Summary

A<em>線虫(Caenorhabditis elegans)</emAmylopathyの研究のための>モデルシステム

Published: May 17, 2013
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Summary

私たちは、ワームでamylopathiesの側面を研究するための方法を説明<em> C.エレガンス</em>。我々は人間のAβを発現しているワームを構築する方法を示し<sub> 42</sub>ニューロンにおいて、どのように行動アッセイにおけるそれらの機能をテストします。私たちは、さらに薬理試験のために使用することができ、一次ニューロン培養を取得する方法を示しています。

Abstract

Amylopathyは時間とともに組織におけるアミロイドβ(Aβ)の異常合成と蓄積を説明する用語です。 Aβは、アルツハイマー病(AD)の特徴であり、レヴィー小体認知症、封入体筋炎および脳アミロイド血管症1-4に見出される。 Amylopathiesは徐々に時間を使って開発。このような理由から短い寿命を持つ単純な生物は、これらの条件の分子の側面を解明するのに役立つ可能性があります。ここでは、ワームの線虫(Caenorhabditis elegans)を用いたAβ媒介神経変性を研究するための実験プロトコルを記述します。したがって、私たちは大人雌雄同体の生殖器合胞体にコードするDNA人間Aβ42を注入することにより、トランスジェニックワームを構築する。形質転換線は突然変異誘発によって誘発される積分によって安定化される線虫は、それらの卵を採取し、播種によって同期化時代である。 Aβ42を表現するニューロンの機能が(適当な行動アッセイで試験される走化性アッセイ秒)。胚から得られた一次ニューロン培養は、行動データを補完し、抗アポトーシス性化合物の神経保護効果を試験するために使用される。

Introduction

アミロイドベータ(Aβ)βおよびγセクレターゼ1によるアミロイド前駆体タンパク質(APP)の連続的切断後に形成される36-43アミノ酸のペプチドである。 γセクレターゼは、AβペプチドのC末端を処理し、その変数の長さ5を担当する。 Aβの最も一般的な形態は、Aβ40Aβ42、より一般的なAD 5などの病態に関連している後者である。アミロイド線維6を形成するために集約すること、高濃度Aβフォームβシートで。線維預金は、ニューロンを取り巻く老人斑の主成分である。両方斑および拡散性、非プラークAβオリゴマーは、Aβの基礎となる病原形を構成すると考えられている。

神経amylopathiesの実験室での研究は、時間とともにこれらの条件が進歩という事実によって複雑になる。したがって、それはimportanですがマウス、短い寿命に遺伝的に扱いやすい動物モデル相補的開発するT。これらのモデルはamylopathies通常は細胞および分子とそのシンプルさのおかげでの特定の側面を解明するために使用することができ、問題の本質をキャプチャするために役立ちます。ワーム線虫(Caenorhabditis elegans)の滝がこのカテゴリです。それは短い寿命を持っている、〜20日と加えて、遺伝子発現、タンパク質輸送、神経接続、シナプス形成、細胞シグナリング、および死の調節など、基本的な細胞プロセスは、哺乳類7に似ています。ワームのユニークな特徴は、強力な遺伝学と独立して血管損傷の神経損傷を勉強できるように血管系の欠如が含まれています。一方、脳の欠如は、Cの使用を制限する神経変性の多くの側面を研究する 。また、病変の解剖学的分布の再現性と識別は、この生物において行うことができない。その他の制限管理ポイントは、遺伝子発現プロファイルおよび複雑な挙動とメモリ機能障害の違い両方を評価する難しさが挙げられる。ここでは、Cを生成する方法を説明amylopathiesのエレガンスモデル

Protocol

1。トランスジェニックワームの構築変換。 インジェクションパッドを準備します。ガラスカバースリップ上に、水に溶解し、ホット、2%アガロースのドロップを置きます。素早く降下に第二カバースリップを置き、軽くそれをタップします。アガロースが固化した後、離れてカバースリップをスライドさせて、80℃の真空オーブン中でカバースリップパッドを焼く°CO / N. <…

Representative Results

我々のプロトコルでは、我々は神経機能8に人間Aβ42オリゴマーの影響を研究。フラグメントをコードするヒトAβ42および火災ベクトルpPD50.52の人工シグナルペプチドコード配列は、末端にSmaIで1制限エンドヌクレアーゼ部位を導入したプライマーを用いて構築PCL12 9から増幅した。断片をSmaIで一意1部位10との間pPD95.75火災ベクトルで2,481 bpのFLP-6プ?…

Discussion

ここでは、Cを使用amylopathiesの細胞および分子の側面を研究するために、複合的なアプローチを説明しますエレガンス 。このアプローチの利点は次のとおり。1)低コストの線虫を室温で、細菌を接種し、通常のペトリ皿に保持される。 2)強力な遺伝学。トランスジェニック動物は、数ヶ月で得られたプロモーター配列の広い配列は、特定のニューロンにおける所望の遺?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content">私たちは、原稿の重要な読書のための博士双劉に感謝します。 PCL12コンストラクトは、ギフト用のフォーム博士クリストファーD.リンクだった。この作品は、2つの国立科学財団の助成金(0842708および1026958)とFSにAHA助成(09GRNT2250529)によってサポートされていました。</p

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
      1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water     Bring to 975 ml
      Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer     25 ml of 1M stock
      2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
      Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
      6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9  
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199  
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN  
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG  
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320  
Lysine Sigma-Aldrich L5501  
Biotin Sigma-Aldrich B4639  
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044  
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289  
Sucrose Sigma-Aldrich S0389  

References

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Cite This Article
Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

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