Summary

一<em>线虫</em>研究Amylopathy模型系统

Published: May 17, 2013
doi:

Summary

我们描述的方法来研究蠕虫amylopathies方面<em> C。线虫</em>。我们将展示如何构建表达Aβ的蠕虫<sub> 42</sub>在神经元和如何测试其功能行为分析。进一步的研究表明如何获取药理试验,可用于主培养的神经元。

Abstract

的Amylopathy是一个术语,描述了异常的β淀粉样蛋白(Aβ)的合成和积累组织中随着时间的推移。 Aβ是阿耳茨海默氏病(AD)的一个标志,并且被发现在路易体痴呆,包涵体肌炎和脑淀粉样血管病1-4。 Amylopathies随着时间的推移逐步发展。出于这个原因,简单的有机体寿命短,可能有助于阐明分子方面的这些条件。在这里,我们描述了实验协议利用线虫研究Aβ介导的神经退行性疾病。因此,我们构建转基因蠕虫通过注射DNA编码人类Aβ42到成年雌雄同体的合胞性腺。转化线是稳定的诱变诱发的整合线虫是年龄同步收集和播种他们的鸡蛋。测试时机行为分析的功能神经元表达Aβ42(趋化实验S)。从胚胎的原代神经元培养物的使用行为数据的补充和测试抗凋亡的化合物的神​​经保护作用。

Introduction

β淀粉样蛋白(Aβ)是36-43个氨基酸的肽的顺序裂解后形成的淀粉样前体蛋白(APP),β和γ分泌1。的γ分泌的Aβ肽的C-末端进行处理,并负责可变长度5。 Aβ的最常见的形式是Aβ40Aβ42,后者更常见的病理条件下,如AD 5相关联。 Aβ形式在高浓度的β-折叠,聚集形成淀粉样纤维6。存款的原纤维周围神经元的老年斑的主要成分。两个斑块和斑块扩散,非Aβ寡聚体,被认为构成了潜在的致病形式的Aβ。

实验室神经元amylopathies研究是复杂的事实,这些条件随时间的进展。因此,它是重要的吨至发展互补基因听话的动物模型小鼠寿命短。这些模型可以用来阐明具体方面amylopathies典型的细胞和分子,凭借其简单,有利于把握问题的实质。 线虫瀑布是这一类。它有一个很短的寿命,〜20天,除了基本的细胞过程,包括调节基因表达,蛋白质贩运,神经元连接,突触,细胞信号传导,和死亡的哺乳动物7类似。蠕虫的独特功能包括强大的遗传学和缺乏的血管系统,使独立研究神经元损伤血管损伤。另一方面,人脑的缺乏限制使用线虫研究神经退行性疾病的许多方面。此外,病变的解剖分布的再现和识别不能进行这种微生物。其他限制ations包括两个基因表达谱的差异和复杂的行为和记忆功能的减值难以评估。在这里,我们描述的方法来生成C。线虫模型amylopathies。

Protocol

1。转基因蠕虫建设转型。 准备注射垫。热,2%琼脂糖溶解在水中,将下降到玻璃盖玻片上。快速放置第二个下拉盖玻片,轻轻敲击。在琼脂糖固化,滑动盖玻片分开,和烘烤盖玻片垫在真空烘箱中在80℃CO / N。 拉移液器。我们使用一个萨特的P-97车夫拉1/0.5毫米OD / ID硼硅毛细血管长丝。移液器都是伪造的,这是打破在稍后阶段开放与闭合尖端。 准备注射组合。使注射?…

Representative Results

我们的协议中,我们研究了人类Aβ42低聚物对神经元功能8。推出了平均1两端的限制性内切酶的引物扩增片段编码人类Aβ42和序列消防载体pPD50.52的人工信号肽编码从结构PCL12 9使用。然后将该片段插入到含有2481 bp的FLP-6启动子序列的一个构造在pPD95.75火焰矢量之间的独特的SMA 1站点10。使用协议1中描述的改造技术,我们构建了转基因蠕虫表达Aβ42</su…

Discussion

在这里,我们描述相结合的办法,来研究细胞和分子方面,用C amylopathies 线虫 。这种方法的优点包括:1)成本低。 线虫保持在正常与细菌接种的陪替氏培养皿中,在室温下。 2)强大的遗传学。转基因动物在几个月内,可以得到各种各样的启动子序列可用来驱动在特定神经元的所需基因的表达。 3)操作简单,良好的特点,神经系统。C.线虫拥有一个非常简单的神经系?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"我们感谢刘爽博士批判性阅读的手稿。 PCL12构造是一个礼物形式克里斯托弗博士D.链接。这项工作是支持由两个国家科学基金会资助(0842708和1026958)和AHA授予FS(09GRNT2250529)。</p

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
      1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water     Bring to 975 ml
      Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer     25 ml of 1M stock
      2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
      Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
      6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9  
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199  
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN  
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG  
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320  
Lysine Sigma-Aldrich L5501  
Biotin Sigma-Aldrich B4639  
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044  
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289  
Sucrose Sigma-Aldrich S0389  

References

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Cite This Article
Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

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