Summary

A<em> Caenorhabditis elegans</em> Sistema modello per Amylopathy Studio

Published: May 17, 2013
doi:

Summary

Descriviamo i metodi per studiare aspetti della amylopathies nel verme<em> C. elegans</em>. Mostriamo come costruire i vermi che esprimono Ap umano<sub> 42</sub> Nei neuroni e come testare la loro funzione in saggi comportamentali. Mostriamo ulteriormente come ottenere colture neuronali primarie che possono essere utilizzati per il test farmacologico.

Abstract

Amylopathy è un termine che descrive la sintesi e l'accumulo anomalo di beta amiloide (Ap) nei tessuti con tempo. Ap è un segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) e si trova nella demenza a corpi di Lewy, miosite da corpi inclusi e angiopatia amiloide cerebrale 1-4. Amylopathies progressivamente si sviluppano con il tempo. Per questo motivo gli organismi semplici con brevi durate di vita possono aiutare a chiarire gli aspetti molecolari di queste condizioni. Qui, descriviamo protocolli sperimentali per lo studio neurodegenerazione Ap-mediata utilizzando verme Caenorhabditis elegans. Così, costruiamo vermi transgenici iniettando il DNA codificante Ap umano 42 nelle gonadi sinciziale di ermafroditi adulti. Linee trasformanti sono stabilizzate da una integrazione mutagenesi indotta. Nematodi sono sincronizzati età raccogliendo e seminando loro uova. La funzione dei neuroni che esprimono Ap 42 viene testato in saggi comportamentali opportune (chemiotassi assays). Colture primarie neuronali ottenute da embrioni vengono utilizzati per integrare i dati comportamentali e per testare gli effetti neuroprotettivi di composti anti-apoptotici.

Introduction

Beta amiloide (Ap) è un peptide di 36-43 aminoacidi che si forma a seguito della scissione sequenziale della proteina precursore dell'amiloide (APP) per β e γ secretasi 1. Il γ secretasi elabora l'estremità C-terminale del peptide Ap ed è responsabile per le sue lunghezze variabili 5. Le forme più comuni di Ap sono Ap 40 Ap e 42, quest'ultimo essendo più comunemente associato a condizioni patologiche come 5 AD. Ad alte concentrazioni Ap forma β-sheets che aggregano a formare fibrille amiloidi 6. Depositi di fibrille sono il componente principale delle placche senili che circondano i neuroni. Entrambe le targhe e diffusibili, oligomeri Ap non placca, si pensa di costituire le forme patogene sottostanti Ap.

Studio di laboratorio di amylopathies neuronali è complicata dal fatto che queste condizioni progresso con il tempo. Pertanto, è important di sviluppare modelli animali geneticamente trattabili-complementari a topi-con vita breve. Questi modelli possono essere utilizzati per spiegare aspetti specifici di amylopathies-tipicamente cellulare e molecolare e in virtù della loro semplicità, aiutare a catturare l'essenza del problema. Il verme Caenorhabditis elegans cascate è questa categoria. Ha una durata di vita breve, ~ 20 giorni e in aggiunta i processi cellulari di base tra cui regolazione dell'espressione genica, traffico di proteine, connettività neuronale, sinaptogenesi, segnalazione cellulare e la morte sono simili ai mammiferi 7. Le caratteristiche uniche del worm includono la genetica potenti e la mancanza di un sistema di vasi, che permette di studiare i danni neuronali indipendentemente da danno vascolare. D'altra parte, la mancanza di un cervello limita l'uso di C. elegans per studiare molti aspetti della neurodegenerazione. Inoltre, la riproduzione e identificazione di distribuzioni anatomiche delle lesioni non possono essere eseguite in questo organismo. Altro limitezioni comprendono la difficoltà di valutare sia le differenze nei profili di espressione genica e di valore di un comportamento complesso e funzione di memoria. Qui si descrivono i metodi per generare C. elegans modelli di amylopathies.

Protocol

1. Costruzione di Worms transgenici Trasformazione. Preparare pad iniezione. Mettere una goccia di caldo, 2% agarosio sciolto in acqua, su un vetrino di vetro. Introdurre rapidamente un secondo vetrino sulla goccia e toccare leggermente lo. Dopo l'agarosio si è solidificato, vetrini di diapositive a parte, e cuocere il coprioggetto-pad in un forno sotto vuoto a 80 ° CO / N. Tirare pipette. Usiamo un Sutter P-97 estrattore di tirare 1/0.5 mm OD / ID borosilicato capillari con filamento…

Representative Results

Con i nostri protocolli si studiano gli effetti di Ap umano 42 oligomero sulla funzione neuronale 8. Un frammento codificante Ap umano 42 e il peptide segnale codificante sequenza artificiale di fuoco vettore pPD50.52 è stato amplificato dal costrutto PCL12 9 utilizzando primer che hanno introdotto un sito di endonucleasi di restrizione 1 Sma alle estremità. Il frammento è stato poi inserito in un costrutto contenente un FLP-6 sequenza promotrice 2.481 bp nel fuoco…

Discussion

Qui si descrive un approccio combinato, per studiare gli aspetti cellulari e molecolari delle amylopathies utilizzando C. elegans. I vantaggi di questo approccio includono:. 1) basso costo C.elegans è mantenuta in normali Petri seminato con batteri, a temperatura ambiente. 2) genetica potente. Animali transgenici possono essere ottenuti in pochi mesi e alla vasta gamma di sequenze promotore è disponibile per guidare l'espressione del gene desiderato in neuroni specifici. 3), ben caratterizzato, s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Ringraziamo il Dott. Shuang Liu per la lettura critica del manoscritto. La PCL12 costrutto è stato un dono forma Dr. Christopher D. Link. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation di due borse di studio (0842708 e 1026958) e una sovvenzione di AHA (09GRNT2250529) per FS.</p

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
      1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water     Bring to 975 ml
      Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer     25 ml of 1M stock
      2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
      Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
      6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9  
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199  
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN  
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG  
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320  
Lysine Sigma-Aldrich L5501  
Biotin Sigma-Aldrich B4639  
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044  
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289  
Sucrose Sigma-Aldrich S0389  

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
  7. DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).

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Cite This Article
Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

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