Vi beskriver metoder for å studere aspekter av amylopathies i ormen<em> C. elegans</em>. Vi viser hvordan du kan lage ormer uttrykker menneskelig Aβ<sub> 42</sub> I nevroner og hvordan du kan teste deres funksjon i atferdsmessige analyser. Vi viser videre hvordan man skal oppnå primære nevronale kulturer som kan brukes for farmakologisk testing.
Amylopathy er et begrep som beskriver unormal syntese og akkumulering av amyloid beta (Aβ) i vev med tiden. Aβ er et kjennetegn på Alzheimers sykdom (AD) og finnes i Lewy legeme demens, inkludering kropp myositt og cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies gradvis utvikle seg med tiden. Av denne grunn enkle organismer med korte livsløp kan bidra til å belyse molekylære aspekter av disse forholdene. Her beskriver vi eksperimentelle protokoller for å studere Aβ-mediert neurodegeneration hjelp ormen Caenorhabditis elegans. Dermed konstruerer vi transgene ormer ved å injisere DNA koder for human Aβ 42 inn i syncytial gonader av voksne hermafroditter. Transformant linjer er stabilisert av en mutagenese-indusert integrering. Nematoder er alder synkronisert ved å samle og såing sine egg. Funksjonen av nevroner uttrykker Aβ 42 er testet i beleilige atferds-analyser (kjemotaksis analysene). Primære nevrale kulturer hentet fra embryoer blir brukt til å utfylle atferdsmessige data og for å teste de nervecellene effekter av anti-apoptotiske forbindelser.
Amyloid beta (Aβ) er et peptid med 36-43 aminosyrer som er dannet etter sekvensiell spalting av amyloid forløper protein (APP) med β og γ secretases en. Den γ sekretaselignende behandler den C-terminale ende av peptidet Aβ og er ansvarlig for dets variable lengder 5. De vanligste formene for Aβ er Aβ 40 og Aβ 42, sistnevnte blir oftere assosiert til patologiske tilstander som AD fem. Ved høye konsentrasjoner Aβ danner β-ark som samlet for å danne amyloid fibriller seks. Fibriller innskudd er den viktigste komponenten i senile plakk rundt nerveceller. Begge plaketter og diffusible, ikke-plakk Aβ oligomers, antas å utgjøre de underliggende sykdomsfremkallende former for Aβ.
Laboratory studie av neuronal amylopathies er komplisert ved det faktum at disse forholdene fremgang med tiden. Derfor er det important å utvikle genetisk medgjørlig dyremodeller-komplementær til mus-med kort levetid. Disse modellene kan brukes til å belyse spesifikke aspekter ved amylopathies-typisk cellulært og molekylært-og i kraft av sin enkelhet, bidra til å fange essensen av problemet. Ormen Caenorhabditis elegans fall er denne kategorien. Den har en kort levetid, ~ 20 dager og i tillegg grunnleggende cellulære prosesser, inkludert regulering av genekspresjon, protein trafficking, neuronal tilkobling, synaptogenesis, celle signalisering og død er lik pattedyr 7. Unike trekk ved orm omfatter kraftige genetikk og mangel på et fartøy system, som gjør det mulig å studere neuronal skade uavhengig av vaskulær skade. På den annen side begrenser mangelen på et hjerne bruk av C. elegans til å studere mange sider av neurodegeneration. I tillegg kan den reproduksjon og identifisering av anatomiske fordelinger av lesjonene ikke utføres i denne organisme. Andre rettningslinjersjoner inkluderer problemer med å vurdere både forskjeller i genekspresjonsprofiler og nedskrivning av kompleks atferd og minnefunksjon. Her beskriver vi metoder for å generere C. elegans modeller av amylopathies.
Her beskriver vi en kombinert tilnærming, for å studere cellulære og molekylære aspekter av amylopathies hjelp C. elegans. Fordelene ved denne metode er: 1). Lav kostnad C.elegans opprettholdes i normal petriskål podet med bakterier, ved romtemperatur. 2) Kraftige genetikk. Transgene dyr kan bli oppnådd i få måneder, og et bredt utvalg av promotor-sekvenser er tilgjengelig for å drive ekspresjon av det ønskede gen i bestemte nerveceller. 3) Enkle, godt karakterisert, nervesystemet. C. ele…
The authors have nothing to disclose.
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
1. NGM | |||
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
2. Potassium phosphate buffer | |||
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
Distilled Water | Bring to 1 L | ||
Sterilized by autoclaving | |||
3. M9 buffer | |||
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
Distilled Water | Bring to 1 L | ||
Sterilized by autoclaving | |||
4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
Distilled Water | Bring to 1 L | ||
Sterilized by autoclaving | |||
5. CM-15 | |||
L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
6. Other Reagents | |||
Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |