Summary

<em> Caenorhabditis Элеганс</em> Модельной системы для исследования Amylopathy

Published: May 17, 2013
doi:

Summary

Мы опишем методы для изучения аспектов amylopathies в червя<em> C. Элеганс</em>. Мы покажем, как построить червей, экспрессирующих человеческий Ар<sub> 42</sub> В нейронах и как проверить их функции в поведенческих тестах. Далее показано, как получить первичных нейронов культур, которые могут быть использованы для фармакологических испытаний.

Abstract

Amylopathy это термин, который характеризует ненормальное синтез и накопление бета-амилоида (Ар) в тканях со временем. Ар является отличительной чертой болезни Альцгеймера (БА) и находится в деменцию с тельцами Леви, миозит включения тела и церебральной амилоидной ангиопатии 1-4. Amylopathies постепенно развиваются с течением времени. По этой причине простые организмы с короткой продолжительностью жизни может помочь выяснить молекулярные аспекты этих условий. Здесь мы описываем экспериментальных протоколов для изучения Ар-опосредованной нейродегенерацию помощью червя Caenorhabditis Элеганс. Таким образом, мы построим трансгенных червей путем инъекции ДНК, кодирующей человеческий Ар 42 в синцитиальный гонад взрослых гермафродитов. Трансформированных линий стабилизируются индуцированного мутагенеза интеграции. Нематоды возраста синхронизированы путем сбора и посева их яйца. Функции нейронов выражения Ар 42 испытывается в подходящее поведенческого анализа (хемотаксисас). Первичных нейронов культур, полученных из эмбрионов, которые используются для дополнения и поведенческие данные для проверки нейропротекторное действие антиапоптотических соединений.

Introduction

Амилоида бета (Ар) представляет собой пептид из 36-43 аминокислот, которая образуется после последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (APP) по β и γ секретазы 1. Γ секретазы обрабатывает C-конца пептида и отвечает за его переменной длины 5. Наиболее распространенными формами являются Ар Ар Ар 40 и 42, причем последний чаще ассоциируется к патологическим состояниям, таким как рекламы 5. При высоких концентрациях Ар форме β-листов для агрегации с образованием амилоидных фибрилл 6. Фибриллы депозиты являются основным компонентом старческих бляшек окружающих нейронов. Оба бляшек и диффузии, не доска олигомеров Ар, как полагают, являются основными формами патогенных Ар.

Лаборатория исследования нейронной amylopathies осложняется тем фактом, что эти условия прогресса с течением времени. Поэтому важнымиT развиваться генетически послушный животных моделях, комплементарные к мышам-с коротким сроком службы. Эти модели могут быть использованы для выяснения конкретных аспектов обычно amylopathies-клеточном и молекулярном и в силу своей простоты, помогают уловить суть проблемы. Червь Caenorhabditis Элеганс водопада эту категорию. Он имеет короткий срок службы, ~ 20 дней, а в дополнение основных клеточных процессах, включая регуляцию экспрессии генов, белков торговли, нейронные связи, синаптогенезе, клеточной сигнализации и смерти подобны млекопитающих 7. Уникальные особенности червя включают в себя мощные генетика и отсутствие сосудистой системы, которая дает возможность изучить повреждения нейронов независимо от сосудистых повреждений. С другой стороны, отсутствие мозга ограничивает применение С. Элеганс к изучению многих аспектов нейродегенерацию. Кроме того, воспроизведение и идентификации анатомических распределения повреждений не может быть выполнена в этом организме. Другой пределобъема отнести сложность для оценки как различия в профили экспрессии генов и обесценения сложное поведение и функции памяти. Здесь мы опишем методы генерирования C. Элеганс моделей amylopathies.

Protocol

1. Строительство трансгенные черви Трансформации. Приготовления инъекции колодки. Поместите каплю горячей, 2% агарозном растворяется в воде, на покровное стекло. Быстро разместить второй покровное на каплю и слегка коснитесь его. После того, как агароза затвердеет, покровные …

Representative Results

С нашим протоколам, которые мы изучаем последствия человеческой Ар 42 олигомеров на функцию нейронов 8. Фрагмент, кодирующий человеческий Ар 42 и искусственные кодирующую последовательность сигнального пептида из своих вектор pPD50.52 амплифицировали из конструкции PCL12 <su…

Discussion

Здесь мы опишем комбинированный подход, изучать клеточные и молекулярные аспекты amylopathies использованием C. Элеганс. Преимущества этого подхода включают: 1.) Низкая стоимость C.elegans поддерживается в нормальном чашку Петри засевают бактерии, при комнатной температуре. 2) Мощный ге…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Мы благодарим доктора Лю Шуан за критическое прочтение рукописи. PCL12 конструкция была подарком форме Д-р Кристофер Д. Линку. Эта работа была поддержана двумя Национальный научный фонд грантов (0842708 и 1026958) и AHA гранта (09GRNT2250529) в FS.</p

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments
      1. NGM
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 3 g
Bacteriological agar AMRESCO J637 17 g
Bacto-peptone AMRESCO J636 2.5 g
Distilled Water     Bring to 975 ml
      Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 1 ml of 1 M stock
Cholesterol Sigma-Aldrich C3045 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer     25 ml of 1M stock
      2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 108.3 g
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786 35.6 g
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655 3 g
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136 6 g
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 5 g
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643 1 ml of 1 M stock
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S5886 118 mM
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P5405 48 mM
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C5670 2 mM
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M4880 2 mM
HEPES Fisher Scientific BP310 25 mM
Distilled Water     Bring to 1 L
      Sterilized by autoclaving
      5. CM-15
L-15 culture medium Gibco 11415 450 ml
Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028 50 ml
Penicillin Gibco 15140 50 units/ml
Streptomycin Gibco 15140 50 g/ml
      Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
      6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil Halocarbon Products 9002-83-9  
5 μm Acrodisc Syringe Filter PALL Co. 4199  
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-5UN  
Lectin (peanut) Sigma-Aldrich L0881-10MG  
Sodium hydroxide Fisher Scientific S320  
Lysine Sigma-Aldrich L5501  
Biotin Sigma-Aldrich B4639  
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044  
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289  
Sucrose Sigma-Aldrich S0389  

References

  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
  7. DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).

Play Video

Cite This Article
Duan, Z., Sesti, F. A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study. J. Vis. Exp. (75), e50435, doi:10.3791/50435 (2013).

View Video