इस प्रोटोकॉल में, हम एक साथ मधु मक्खियों में दो जीन (डबल जीन पछाड़ना) को दबाने कि दो रणनीतियों का वर्णन है. तो फिर हम मधु मक्खी स्वाद धारणा पर डबल जीन पछाड़ना के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख का उपयोग कैसे प्रस्तुत करते हैं.
इस वीडियो डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) इंजेक्शन का उपयोग कर मधु मक्खियों में एक साथ दो जीन downregulate जो शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) के उपन्यास तकनीक को दर्शाता है. यह भी स्वाद धारणा को मापने के लिए सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.
आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति downregulating एक प्रभावी तकनीक है. इस तकनीक को आम तौर पर एक जीन में गड़बड़ी के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन यह बातचीत और जीन के बीच संयुक्त प्रभाव का पता लगाने के लिए सीमाएँ हैं. इस वीडियो के पहले भाग में, हम एक साथ दो जीन (डबल जीन पछाड़ना कहा जाता है) नीचे दस्तक करने के लिए दो रणनीतियों उपस्थित थे. हम दोनों रणनीतियों को प्रभावी ढंग से एक नियामक प्रतिक्रिया पाश में हैं जो दो जीन, vitellogenin (वीजी) और ultraspiracle (खासियत), को दबाने में सक्षम हैं दिखा. इस दोहरे जीन पछाड़ना दृष्टिकोण जीन के बीच अंतर्संबंधों टुकड़े करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आसानी से लागू किया जा सकता हैविभिन्न कीट प्रजातियों.
इस वीडियो के दूसरे भाग डबल जीन पछाड़ना के इलाज के बाद मधु मक्खियों में सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) परख का एक प्रदर्शन है. प्रति परख मधु मक्खियों, एक मधु मक्खी के व्यवहार परिपक्वता है कि कितनी तेजी के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है जिसमें स्वाद धारणा को मापने के लिए एक मानक परीक्षण है. घोंसला मधुमक्खियों के ग्रेटर स्वाद धारणा अक्सर पराग में विशेषज्ञता foraging और foraging की शुरुआत में एक पहले की उम्र के साथ जुड़ा हुआ है, जो वृद्धि हुई व्यवहार के विकास को दर्शाता है. इसके अलावा, प्रति परख मधु मक्खियों में तुष्टि या भूख की चयापचय राज्यों की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है. अंत में, परख प्रति मधुमक्खियों भी व्यापक रूप से मधु मक्खियों में सीखने और स्मृति के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है कंडीशनिंग के लिए अलग गंध उत्तेजनाओं बाँधना के साथ संयुक्त.
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) यूकेरियोटिक जीवों की एक विस्तृत विविधता में पाया जाता है जो आरएनए आधारित बाद ट्रांसक्रिप्शनल जीन मुंह बंद है. आरएनएआई की प्रक्रिया अंतर्जात या exogenous डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) व्यापारियों से शुरू हो रहा है. dsRNA बांध और छोटे टुकड़े (20-25 बीपी) को dsRNA cleaves जो ribonuclease प्रोटीन पासा खेलनेवाला सक्रिय. फिर dsRNA गाइड के छोटे टुकड़े आर्गोनॉट प्रोटीन से पूरक mRNAs की एक पहचान है और दरार, आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल (आरआईएससी) 1 का एक उत्प्रेरक घटक. स्तनधारियों में, 30 NT के तुलना में अब dsRNAs, शाही सेना टेप 2 की अविशिष्ट गिरावट की ओर जाता है जो एक antiviral प्रतिक्रिया (इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया, IFN) को सक्रिय करें. हालांकि, लंबे dsRNAs इस IFN 3 की कमी के बाद से वहाँ कीड़े में प्रभावी और विशिष्ट साबित किया है.
लांग dsRNAs विभिन्न कीट प्रजातियों में लक्ष्य जीन के डाउनरेगुलेशन के लिए इस्तेमाल किया गया है. मधुमक्खियां pion में से एक हैंEER कीट जीवों में जो विकास और व्यवहार में कई महत्वपूर्ण जीनों के कार्यों dsRNA 4,5 का उपयोग करके खुलासा किया गया है. कई dsRNA प्रसव के तरीके मधु मक्खियों में प्रदर्शन किया गया है: dsRNA इंजेक्शन मधु मक्खी भ्रूण 4 और वयस्क मधुमक्खियों 7,8 में जीन पछाड़ना के लिए एक प्रभावी तरीका है, जबकि dsRNA खिला कुशलता, मधु मक्खी लार्वा 6 में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति downregulates.
कीड़ों के लिए dsRNA लगाने से प्रदर्शित जीन पछाड़ना प्रभाव क्षणिक और स्थानीय हैं. अध्ययन पेट dsRNA इंजेक्शन और वक्ष dsRNA इंजेक्शन दोनों को प्रभावी ढंग से कीड़े 9,10 के पेट की चर्बी शरीर की कोशिकाओं में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को दबाने दिखाया है. DsRNA कोशिकाओं 10 स्नान कर रहे हैं जहां hemolymph से dsRNA लेने के लिए सक्षम हैं, पेट और वक्ष cavities और वसा शरीर की कोशिकाओं में इंजेक्ट किया जाता है. हालांकि, इस तरह के अंडाशय और दिमाग के रूप में अन्य अंगों में जीन या तो द्वारा लक्षित नहीं किया जा सकताउदर या वक्ष इंजेक्शन. मधु मक्खी के मस्तिष्क में जीन को लक्षित करने के लिए, dsRNA के मस्तिष्क इंजेक्शन भी प्रभावी ढंग से स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्रों के 11 में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करती है, जो प्रदर्शन किया गया है. यहाँ, हम केवल वयस्क मधु मक्खियों में अधिक आमतौर पर इस्तेमाल किया है, जो पेट dsRNA इंजेक्शन दस्तावेज़.
आरएनएआई मुख्य रूप से एक जीन को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और जीन समारोह प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है. हालांकि, किसी भी जीन दूसरों से अलग नहीं है, यह जटिल विनियामक नेटवर्क में है. एक जैविक प्रक्रिया को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण जीन कई जीनों के एक साथ जोड़तोड़ के बजाय एक ही जीन पछाड़ना की आवश्यकता है, जो एक दूसरे के साथ बातचीत कैसे काटना है. स्तनधारी सेल लाइनों में वैज्ञानिकों वितरण प्रणाली 12 या बहु microRNA (miRNA) बाल के लिये कांटा डिजाइन 13 का उपयोग करते हुए एक साथ बाधा दो या तीन जीनों में सफल रहा है. लेकिन कीड़ों में, कई जीन knockdowns अभी भी untested हैं. यहाँ, हम presenएक डबल जीन पछाड़ना प्राप्त कर सकते हैं जो टी अलग इंजेक्शन रणनीतियों. एक जर्दी प्रोटीन अग्रदूत encodes, और किशोर हार्मोन (जे) के लिए एक ख्यात रिसेप्टर encodes और जो ultraspiracle (खासियत) मधु मक्खियों में जेएच 14 के लिए प्रतिक्रियाओं mediating एक प्रतिलेखन कारक के रूप में सेवा कर सकता है जो vitellogenin (वीजी): हम दो जीन लक्ष्य. वी.जी. और झा एक राय पाश 15 में एक दूसरे को विनियमित करने और मधु मक्खी व्यवहार विनियमन 9 में शामिल रहे हैं. डबल जीन पछाड़ना का उपयोग करना, हम उपद्रव वी.जी. दोनों और झा रास्ते, और वे संयुक्त रूप से मधु मक्खी व्यवहार और शरीर विज्ञान और कैसे वी.जी., खासियत और झा 9 बातचीत को प्रभावित कैसे पता चलता है.
स्वाद धारणा मधु मक्खी सामाजिक व्यवहार 16 के लिए एक व्यवहार कारक है. उच्च स्वाद धारणा के साथ व्यवहार के विकास, घोंसला मधुमक्खियों behaviorally परिपक्व तेजी से, और आमतौर पर प्रारंभिक जीवन में चारे के संदर्भ में और पराग 16,17 एकत्र करने के लिए पसंद करते हैं. हालांकि नियामक मीटरस्वाद धारणा अंतर्निहित echanisms पढ़ाई स्वाद धारणा आंतरिक ऊर्जा metabolisms के 9, हार्मोनल स्राव 18,19 और biogenetic अमाइन 20 रास्ते से जुड़ा हुआ है पता चला है कि, अभी भी स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. वी.जी. और झा दोनों नियमन स्वाद धारणा 7,21 महत्वपूर्ण हार्मोन संबंधी नियामकों हैं. प्रयोगशाला में, मधु मक्खियों में स्वाद धारणा के विभिन्नता अलग sucrose के समाधान के लिए सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) के परीक्षण के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. प्रत्येक मधुमक्खी 0.1 की एक आरोही एकाग्रता श्रृंखला, 0.3, 1, 3, 10, 30% sucrose के द्वारा पीछा पानी की एक छोटी बूंद के साथ उसके एंटीना दोनों छू द्वारा परीक्षण किया जाता है. पानी या सूक्रोज की एक छोटी बूंद प्रत्येक एंटीना को छुआ है जब एक मधुमक्खी पूरी तरह से उसे सूंड फैली अगर सकारात्मक प्रतिक्रिया उल्लेख किया है. समाधान के लिए सकारात्मक प्रतिक्रियाओं की संख्या के आधार पर, प्रत्येक व्यक्ति के स्वाद धारणा स्तर 16 निर्धारित किया जा सकता है. हालांकि, प्रति के आवेदन जी मापने तक सीमित नहीं हैustatory धारणा. प्रति भी ऐसी तुष्टि बनाम भूख के रूप में मधुमक्खियों के चयापचय राज्य का परीक्षण करने के लिए एक प्रभावी तरीका है. सुक्रोज के लिए अधिक से अधिक प्रतिक्रियाओं के साथ मधुमक्खियों सामान्य में hungrier (वैंग और Amdam, अप्रकाशित डेटा) हैं. इसके अलावा, प्रति प्रतिमान मधु मक्खियों में साहचर्य सीखने और स्मृति में भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में मधुमक्खियों का एक गंध के साथ sucrose पानी की मौजूदगी संबद्ध करने के लिए प्रशिक्षित किया जाएगा. मधुमक्खियों संघ जानने के लिए, गंध की केवल उपस्थिति सूक्रोज 22,23 साथ उन्हें पुरस्कृत बिना एक सकारात्मक सूंड प्रतिक्रिया पैदा कर सकते हैं. इस वीडियो में, हम पिछले एक अध्ययन 9 में वी.जी. और खासियत डबल पछाड़ना के साथ जोड़ा गया है, जो स्वाद धारणा का मूल्यांकन करने के प्रति प्रदर्शन करने के लिए दिखा.
हमारे अध्ययन से एक साथ वयस्क कीड़े में दो जीन नीचे दस्तक करने के लिए पहला प्रयास है. हमारे परिणाम dsRNA इंजेक्शन (एक इंजेक्शन और दो दिवसीय इंजेक्शन) के दो रणनीतियों डबल जीन दमन, और वी.जी. और खासियत क?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों प्रयोग की सहायता के लिए आयलैंड Fennern धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम नॉर्वे के अनुसंधान परिषद (180504, 185306 और 191699), बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट, और उम्र बढ़ने पर राष्ट्रीय संस्थान (एनआईए P01 AG22500) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
GE Healthcare PCR beads in 96 well plate | GE Healthcare | 27-9557-01 | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
RiboMax T7 RNA production system | Promega | P1300 | |
Trizol LS | Invitrogen | 10296028 | |
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma-Aldrich | C0549 | |
isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
Hamilton micro syringe | Hamilton | 80301 | |
30G BD disposable needles | BD Biosciences | 305106 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
1 ml Syringe | BD Biosciences | 30960 | |
Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
Wax plate |