Her beskriver vi en protokol til optogenetic manipulation af motoneuronal aktivitet, mens overvågning af ændringer i motoreffekt (muskelsammentrækning) i semi-intakte<em> Drosophila</em> Larver med laser i en konventionel konfokal mikroskop. Denne teknik gør det muligt for forskerne at opnå lokal forstyrrelse af neurale aktivitet i et par neuromeres at belyse dynamikken i motoriske kredsløb.
Drosophila larver bevægelse er en flot model-system i udviklings-og fysiologiske neurovidenskab, som følge af den genetiske tilgængeligheden af de underliggende neuronale komponenter i kredsløb 1-6. Anvendelse af optogenetics 7,8 i larvestadiet neurale kredsløb giver os mulighed for at manipulere neuronal aktivitet i rumligt og tidsligt mønstrede måder 9-13. Typisk prøver bredt belyst med en kviksølv lampe eller LED er så specificitet af de målrettede neuroner kontrolleret af binære genekspressionssystemer såsom Gal4-UAS systemet 14,15. I dette arbejde, at forbedre den rumlige opløsning til "sub-genetisk opløsning", vi lokalt belyst en delmængde af neuroner i det ventrale nerve ledning med laser gennemføres i en konventionel konfokal mikroskop. Mens du lytter til bevægelse af kroppen væg semi-intakte larver, vi interaktivt aktiveres eller hæmmede neurale aktivitet med channelrhodopsin 16,17 or halorhodopsin 18-20, hhv. Ved rumligt og tidsligt begrænset belysning af nervevæv, kan vi manipulere aktiviteten af specifikke neuroner i kredsløbet på en specifik fase af adfærd. Denne metode er nyttig til at studere sammenhængen mellem aktiviteterne i en lokal neural forsamling i den ventrale nerve ledning og den Spatiotemporal mønster af motorens output.
Forward peristaltisk bevægelse i Drosophila larver sker ved udbredelsen af muskelsammentrækning fra posterior til anterior segmenter. Denne bevægelse realiseres ved sekventiel aktivering af motoriske neuroner i det ventrale nerve ledningen langs den langsgående krop akse. For at undersøge kredsløbet bag denne mønstrede formeringsmateriale aktivitet kunne lokal forstyrrelse af neurale aktivitet være en informativ tilgang. Selvom farmakologisk assay kan styre specifikke stof, såsom neurotransmittere i nervevæv, kan effekten af farmakologiske lægemidler være ens blandt de næsten alle segmenter, fordi larve ventrale nerve ledning er gentagne struktur bestående af lignende neuromeres langs længdeaksen. Alternativt kan man udtrykke optogenetic eller temperaturfølsomme probemolekyler i et lille antal segmenter. Imidlertid sådanne særlige GAL4 linjer er meget vanskelige at uddrage. Her præsenterer vi en metode til at manipulere neuroner i et par segmenter anvender laserbelysning. At drage fordel af det rumligt begrænset belysning i konfokal mikroskopi, kan man forstyrre aktiviteten af neuroner i et lokalt område. Kombineret med ekspressionsmønsteret af sonden ved delmængder af neuron-specifikke Gal4 linjer, stærkt denne laserbelysning metode forbedrer den rumlige opløsning for forstyrrelse. Og fordi denne metode kræver kun en konventionel konfokal mikroskop, indkøb af ekstra laboratorieudstyr er typisk ikke nødvendig.
Ved hjælp af denne teknik, undersøgte vi den rolle motor neuronal aktivitet i udbredelsen af motoreffekt 13. Ved at blokere aktiviteterne i motoriske neuroner inden for et par segmenter under peristaltisk bevægelse, var vi i stand til at teste, om aktiviteten af motoriske neuroner selv er nødvendigt for udbredelsen af motorens udgangssignal. Lokale og forbigående blokade af motoriske neuroner anholdt udbredelsen af peristaltiske bevægelse. Efter blokaden blev fjernet, propagation optrådte på det segment, hvor bølgen var blevet anholdt. Dette fænomen antyder, at uden motor neuronal aktivering, kan propagative bølge ikke videre ad den ventrale nerve ledningen yderligere, og dermed aktiveringen af motoriske neuroner er nødvendig for peristaltisk bevægelse. Vi har tidligere rapporteret detaljerede data og diskussioner om dette fænomen i inada et al. (2011) 13.. Her beskriver vi metoden til at forurolige neurale aktivitet interaktivt under overvågning bevægelsen af dissekerede larver. Ved hjælp af forskellige GAL4 linjer og serier af spatiotemporale mønstre for aktivitet manipulation, kan man undersøge kredsløb logik gennem perturbationsmetoder respons egenskaber motorkredsen.
Temporal og lokale forstyrrelse af neurale aktivitet er en uvurderlig teknik til at analysere netværks dynamik neurale kredsløb. I denne protokol, præsenterer vi en metode til at manipulere neurale aktivitet ved optogenetics ved hjælp af en laser. Laseren høje direktionalitet tillader mere lokaliseret optogenetic stimulation end bredt felt stimulation ved hjælp kviksølv eller Xenon lampe. Selvom laser illuminationer allerede har været anvendt på optogenetics i tidligere studier er specielle opsætninger såsom glasfiber, mikromanipulator, og laser kilde, der kræves i de fleste tidligere undersøgelser. I denne protokol, bruger vi en konventionel konfokal mikroskopi til lokal belysning. Da den konfokal mikroskop systemet er meget udbredt, vil denne metode åbner mulighed for at anvende højere opløsning optogenetics i mange laboratorier.
Protokollen har to kritiske punkter: larvernes dissektion og laser magt. Først, hvis hjernen, den ventrale nerve ledning eller en motorisk nerve er beskadiget during dissektion, vil larverne udviser mindre eller ingen spontan peristaltisk bevægelse. Præcision er derfor vigtigt, især når de foretager et snit på dorsalsiden med fjeder saks og fjerne indre organer med pincet. Detaljer om dissektion er blevet rapporteret tidligere 21.. For det andet, hvis der er tilstrækkelig stimulation skal opnås en laser magt på omkring 0,1 ~ 1 mW / mm 2 for ChR2 eller 1 ~ 10 mW / mm 2 for NpHR er påkrævet. Vi vurderede laser magt som den samlede lyseffekt under en objektiv divideret med en anslået areal på belysning. Vi målte den samlede lyseffekt ved hjælp af et power meter (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). Vi vurderede område af belysning som cirkulære konstante gange kvadratet af bølgelængde laser, som groft giver belyste område i diffraktion grænse. Effektiv belysning magt på prøven kan justeres ikke alene ved laserens udgang, men også ved at ændre scanningshastighed og følelsesløsis gentagelser. Vi scannet laser med 20-100 mikrosekunder / pixel til 63 gange. Derudover er ekspressionsniveauet af optogenetics protein og mængden af ATR også kritisk for stimulering effektivitet. Følgelig, hvis larver viste ingen optogenetic respons, bør følgende punkter kontrolleres og korrigeres: 1) laser effekt (ved at optimere mikroskop-system), 2) udtryk niveau af optogenetics protein (ved at kontrollere genotype og opdræt temperatur), og 3) mængden af ATR (ved at justere koncentrationen af ATR og fodring periode). NpHR kræver højere koncentration af ATR end ChR2 gør af ukendte årsager 13. ChR2 fungerer godt i larver opdrættet i fødevarer, der indeholder mindre ATR (f.eks 0,1 mM) end beskrevet her (1 mM). Som fodring larver til 1 mM ATR er tilstrækkelig til at gøre ChR2 foto-reaktiv, anbefaler vi denne koncentration for den første retssag i ChR2 eksperimenter. Koncentrationen af ATR efterfølgende kan titreres ned fra 1 mM. Hvad eksponeringstid for ATR anbefaler vivarigheden beskrevet her for robust optogenetic kontrol. Vi har ofte tilsidesat optogenetic respons, når fodring larver til ATR for kortere varighed.
I denne protokol, er laserbelysning og image erhvervelse drives af en separat computer. Så klar påvisning af Spatiotemporal mønster af laserbelysning af CCD-kameraet er kritisk for dataanalyse. Hvis laser stedet eller linje er dæmpet på CCD billede, bør du optimere magt halogenlampe og få værdien af CCD-kamera til at visualisere laserbelysning samtidig holde kropsvæg synlige.
Spatiotemporale belysning vist i denne protokol giver oplysninger om larver motoriske kredsløb, men metoden har visse begrænsninger. Med hensyn til "rumlige" aspekt, placering af belysningen registreres ved lav forstørrelse CCD bruges til videooptagelser kroppens væg bevægelser. Følgelig kan belysningen område tildeles på segment niveau, men ikke på celleniveau. Med hensyn til "temporal "aspekt tidsforskel mellem tændes laseren scanning ved konfokal mikroskop og belysning med laser afhænger af det konfokal mikroskop systemet og scanning tilstand. Derfor er nogle test ved trial and error nødvendig for at justere belysningen timing. Da timingen af belysning kan bestemmes i CCD-billedsensorer film ved hjælp af en passende software som ImageJ, den kritiske faktor i tidsmæssig opløsning er frame rate på CCD kamera billeddannelse. Vi typisk framerate for 7,5-15 frames per sekund.
Fremskridt i optogenetic værktøjer giver os en chance for at ændre denne protokol. Vi brugte 3 rd instar larver besidder OK6-Gal4 og UAS-ChR2 [H134R] eller UAS-NpHR2. Andre optogenetic værktøjer i stedet for ChR2 [H134R] eller NpHR2 såsom ChR2 [T159C/E123T] NpHR3 eller Arch kan øge effektiviteten af aktiviteten styring 22.. Desuden kan bruge andre GAL4 linjer eller analyse i andre udviklingsstadier give mere information om motor circuits.
I denne protokol, blev motorisk aktivitet overvåges af transmissions billeder af bodywall sammentrækning med et CCD-kamera. Aktiviteten af motoriske neuroner med calcium-sensitive fluorescens molekyler (f.eks GCaMP) kan også direkte overvåges, mens manipulere neurale aktivitet med ChR2 eller NpHR. I dette tilfælde er blåt lys belysning i et bredt område og et yderst følsom CCD-kamera (f.eks EMCCD kamera) anvendes i stedet for en halogenlampe og den normale CCD-kameraet tidligere beskrevet heri. For at forbedre rumlig opløsning på stimulation, mens overvågningen bodywall bevægelse, ved hjælp af en ekstra objektiv kan være en mere avanceret metode: belysning af den ventrale nerve ledningen ved en høj forstørrelse objektiv (f.eks 40x) fra over prøven og overvågning bodywall ved lav forstørrelse linse (fx 4x) under prøven. Denne dobbelte linsesystem kan tillade os at stimulere nervesystemet højere rumlig opløsning.
<p class="Jove_content"> Protokollen vist her kan anvendes til andre neurale kredsløb, kan billede optogenetic værktøjer udtrykkes i nervesystemet og præparat, hvori tilstrækkeligt lys kan leveres ind i det neurale væv kan fastslås.The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en bevilling-in-Støtte til videnskabelig forskning i innovative områder "mesoskopisk neurocircuitry" (nr. 22.115.002) og "Comprehensive Brain Science Network" (nr. 221S0003) i ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab, og Teknologi, Japan til AN og Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (nr. 21.700.344) i Japan Society for fremme af Science (JSP'er) til HK
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BX61WI Microscope | Olympus Corporation | BX61WI | |
Fluoview FV1000 confocal system | Olympus Corporation | FV1000 | |
CCD camera | Sony | XCD-V60 | |
all-trans retinal | Sigma | R2500-500MG | 200 mM stock in 95% EtOH |
Silpot184 | Dow Corning Toray | 3255981 |