Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic forstyrrelse av nevrale aktiviteten med Laser Illumination i Semi-intakt Published: July 4, 2013 doi: 10.3791/50513
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Summary

Her beskriver vi en protokoll for optogenetic manipulering av motoneuronal aktivitet mens overvåke endringer i motoreffekt (muskel sammentrekning) i semi-intakt

Abstract

Drosophila larve bevegelse er en utmerket modell system i utviklingsmessige og fysiologiske Neuroscience, i kraft av den genetiske tilgjengelighet av de underliggende neuronale komponentene i kretsene 1-6. Bruk av optogenetics 7,8 i larve nevrale krets tillater oss å manipulere neuronal aktivitet i tid og rom av mønstrede måter 9-13. Vanligvis er prakteksemplarer bredt belyst med en kvikksølvlampe eller LED, er så spesifisitet av målet nevroner kontrollert av binære genuttrykk systemer som Gal4-UAS systemet 14,15. I dette arbeidet, for å forbedre romlig oppløsning for å "sub-genetiske oppløsning", vi lokalt opplyst en undergruppe av neuroner i ventrale nerve ledningen ved hjelp av lasere gjennomført på en konvensjonell konfokalmikroskop. Mens overvåke bevegelsen til kroppsveggen av den semi-intakt larver, vi interaktivt aktivert eller hemmet nevral aktivitet med channelrhodopsin 16,17 or 18-20 halorhodopsin, henholdsvis. Ved romlig og tidsmessig begrenset belysning av nervevev, kan vi manipulere aktiviteten av spesifikke nevroner i kretsen ved en bestemt fase av virkemåten. Denne metoden er nyttig for å studere sammenhengen mellom aktivitetene til en lokal nevrale forsamlingen i ventrale nerve ledningen og tid og rom mønster av motoreffekt.

Introduction

Forward peristaltiske bevegelse i Drosophila larver skjer ved spredning av muskelkontraksjon fra bakre til fremre segment. Denne bevegelse oppnås ved sekvensiell aktivering av motoriske neuroner i løpet av den ventrale nerve ledning langs den langsgående aksen legeme. For å undersøke kretsene bak dette mønstret spre aktivitet, kunne lokal forstyrrelse av nevral aktivitet være en informativ tilnærming. Selv om farmakologisk assay kan styre spesifikk substans, så som nevrotransmittere, i nervevev, kan virkningen av farmakologiske stoffer være lik blant de nesten alle segmenter fordi larve ventrale nerve ledningen er repeterende struktur sammensatt av lignende neuromeres langs lengdeaksen. Alternativt kan man uttrykke optogenetic eller temperaturfølsomme probemolekyler i et lite antall segmenter. Imidlertid har slike spesifikke Gal4 linjene er svært vanskelig å generere. Her presenterer vi en metode for å manipulere nevroner i noen segmentmenter som bruker laser belysning. Benytte seg av den romlig begrenset belysning i konfokalmikroskopi, kan man forurolige aktiviteten til nerveceller i et lokalt område. Kombinert med uttrykket mønster av sonden av undergrupper av nervecellen-spesifikke Gal4 linjer, forbedrer denne laser belysning metoden sterkt romlig oppløsning for forstyrrelse. Og fordi denne metode krever bare en konvensjonell konfokalmikroskop, er kjøp av ytterligere laboratorieutstyr vanligvis ikke nødvendig.

Ved hjelp av denne teknikken, undersøkte vi betydningen av motor neuronal aktivitet i utbredelsen av motoreffekt 13. Ved å blokkere aktiviteten av motoriske neuroner i løpet av få boresegmenter peristaltisk bevegelse, var vi i stand til å teste hvorvidt aktiviteten av motoriske nevroner selv er nødvendig for forplantning av motoren utgangssignal. Lokale og forbigående blokade av motoriske nerveceller arrestert utbredelsen av peristaltiske bevegelser. Etter at blokkaden ble fjernet, propagation dukket opp på segment der bølgen hadde blitt arrestert. Dette fenomen antyder at uten motor neuronal aktivering, kan det propagative bølge ikke fremgang langs den ventrale nerve ledningen videre, og dermed aktiveringen av motor neuroner er nødvendig for peristaltiske bevegelse. Vi har tidligere rapportert detaljerte data og diskusjoner om dette fenomenet i Inada et al. (2011) 13. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å forurolige nevral aktivitet interaktivt samtidig å overvåke bevegelsen til det anatomiske larver. Ved hjelp av ulike Gal4 linjer og serier av Spatiotemporal mønstre for aktivitet manipulasjon, kan man undersøke krets logikk gjennom forstyrrelsene respons egenskapene til motoren krets.

Protocol

En. Larver Forberedelse

  1. Opprettholde fly linjer med OK6-Gal4, UAS-CHR2 eller OK6-Gal4, UAS-NpHR2 i plast hetteglass som inneholder standard fly mat.
  2. Spread gjær lim som inneholder all-trans retinal (ATR) i passende konsentrasjoner (1 mM for CHR2, 10 mM for NpHR2 ("NpHR" for kort) på en eplejuice agar plate.
  3. Plukk opp 2. og 3. instar larver fra hetteglassene og sette dem på ATR-holdig plate.
  4. Oppfostre dem ved 25 ° C i mørket for en passende periode (en dag for CHR2, to dager for NpHR.)

2. Mikroskop Setup

  1. Fest en CCD-kamera (XCD-V60, Sony) til en konvensjonell konfokalmikroskop (i vårt tilfelle, FV1000, Olympus) med en C-mount vedlegg (forstørrelse 0.35x).
  2. Hvis det er en skodde langs lysbanen fra objektiv til CCD-kamera, som lukker under laserskanning, fjerner du det forsiktig. Ettersom dette trinnet avhenger av microstakle oppsett, ta kontakt med mikroskop produsenten for teknisk støtte, hvis det er nødvendig.

3. Disseksjon

  1. Skyll ATR-matet larver med vann for å fjerne rester av mat fra kroppen.
  2. Sett larve på en Sylgard belagt fatet, dorsal side opp (dorsal side har to trakealtubers kjører lengderetningen, en på hver side av dorsal midtlinjen). Tykkelsen av Sylgard er omtrent 5 mm.
  3. Sett et insekt pin (Austerlitz Insect pins, Φ0.10mm, rustfritt) inn i halen mellom trakealtubers med pinsett (nr. 5 Inox, FST av Dumont, Sveits). Tappene, rundt 10 mm lang, bør være bøyd eller klippes til å være kort nok (~ 2 mm lang) for å unngå å treffe og skade overflaten på objektivlinsen. Deretter satte andre insekt pin inn i hodet på larven nær munningen krok, svart klo-aktig struktur på fremre enden.
  4. Legg Ca 2 +-fritt fysiologisk saltvann (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl2 6 mM, HEPES-NaOH 5 mM,Sukrose 36 mM (pH7.1)) for å holde den fuktig larve.
  5. Lag et lite snitt i nærheten av halen med mikro saks (MB-50-7, Napox, Japan).
  6. Fra snittet, lag et langsgående snitt langs dorsal midtlinjen mot hodet. Vær forsiktig så du ikke skader den ventrale nerve ledningen (VNC) og axoner.
  7. Lag et lite snitt på hodet sidelengs.
  8. Plasser fire pinner på hvert hjørne av dissekert bodywall. Kroppen veggen skal strekkes nok til å visualisere en segmental mønster av kroppen veggen, men ikke for mye å hindre peristaltiske bevegelser.
  9. Fjern de indre organer bortsett fra hjernen og VNC og skyll prøven med Ca 2 +-fritt fysiologisk saltvann.
  10. Juster retningen av ventrale nerve ledningen for å være bilateralt symmetriske ved å endre posisjon og orientering insekt pinnene på kroppen veggen. For å fastslå posisjonen til den ventrale nerve-ledningen og sett en nål gjennom vevet mellom hjernen og munningen kroken ned til Sylgard.
    11. <li> Sett buffer med 2 mm Ca 2 + Ringer løsning (NaCl 130 mm, KCl 5mM, MgCl 2 2mM, 2 CaCl 2 mm, HEPES-NaOH 5 mm, Sukrose 36 mm (ph7.3)).

4. Bildebehandling med Laser Illumination

  1. Fest en 4x tørr objektiv (UPlanSApo 4x, 0,16 NA, Olympus, Japan) i konfokalmikroskop og sette larven forberedelse på scenen.
  2. Skaff en overføring bilde av dissekert forberedelse med en rød laser (633nm) for å finne den ventrale nerve ledningen ved konfokalmikroskop. For denne skanningen, pass på å ikke bruke en 488nm eller 559nm laser, som induserer uønsket stimulering av CHR2 eller NpHR, henholdsvis.
  3. Definer regionen av interesse (ROI) på overføring bildet. Zoomet modus kan være nyttig for detaljert fastsettelse av ROI.
  4. Skifte filter sett med mikroskop for å belyse med 488nm eller 559nm lys.
  5. Belyse forberedelse med en halogenlampe å visualisere kroppen veggen. The forberedelse kan overvåkes med et CCD-kamera festet til konfokalmikroskop.
  6. Record bevegelse av kroppen veggen og slå av laserstrålen på og av samtidig å overvåke bevegelsen.

Representative Results

Lokale og forbigående aktivering av motoriske nerveceller med CHR2.

Vi uttrykte CHR2 i motoriske nerveceller. Axons av motoriske nerveceller fremvoksende fra hver VNC segment prosjekt til en tilsvarende del av kroppen veggen. Når vi stimulert en eller to segmenter av VNC med en blå laser, oppviste muskler i de tilsvarende segmenter kontraksjoner (figur 1).

Lokale og forbigående hemming av motoriske nerveceller med NpHR.

Vi har uttrykt NpHR i motoriske nerveceller. Når vi stimulerte noen (1 ~ 2) segmenter av VNC med en gul laser i løpet av de peristaltiske muskelsammentrekninger, ble den seg ​​utbredende bølge arrestert ved de tilsvarende segmenter av kroppsveggen (figur 2). Da bølgen startet på nytt fra de arresterte segmenter når vi skrudde av laser belysning 13.

50513fig1.jpg "alt =" Figur 1 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Lokal aktivering av motoriske nerveceller med CHR2. A. Scheme av den lokale aktivering av filetert forberedelse. Av blue-light belysning av noen segmenter av ventrale nerve ledningen uttrykker CHR2 i motoriske nevroner, er musklene i tilsvarende segmenter kontrakt (pil hode). B. Transmission bilder av en dissekert larve. Lokale belysning av ventrale nerve ledningen (pil hoder) induserer segmental sammentrekning av kroppen veggen muskler (piler).

Figur 1
Figur 2. Lokale hemming av motoriske nerveceller med NpHR. A. Scheme av den lokale hemming av filetert forberedelse. Av gul-light belysning av noen segmenter av ventrale nerve ledningen uttrykker NpHR i motoriske nerveceller, muskler sammentrekning under spontant-inntraff peristaltiske bevegelser (pil hodet i toppen) er avslappet (pil hodet i bunnen.) B. Transmission bilder av en dissekert larve . Lokale belysning av ventrale nerve ledningen (pil hoder) slappet de spontant-kontrakt kroppen veggsegmentene (piler).

Discussion

Temporal og lokale endringen av nevral aktivitet er en uvurderlig teknikk for å analysere nettverket dynamikken i nevrale kretser. I denne protokollen, presenterer vi en metode for å manipulere nevral aktivitet ved optogenetics ved hjelp av en laser. Laseren høye retningen gir mer lokaliserte optogenetic stimulering enn bredt felt stimulering ved hjelp av kvikksølv eller Xenon lampe. Selv om laser belysning har allerede blitt brukt til optogenetics i tidligere studier, er spesielle oppsett som glassfiber, micromanipulator, og laser kilde, som kreves i de fleste tidligere studier. I denne protokollen, bruker vi en konvensjonell konfokalmikroskopi for lokale belysning. Siden konfokalmikroskop systemet er mye brukt, vil denne metoden åpner muligheten for å bruke høyere oppløsning optogenetics i mange laboratorier.

Protokollen har to kritiske punkter: larve disseksjon og laser makt. For det første, dersom hjernen, den ventrale nerve ledningen eller en motorisk nerve er skadet undeng disseksjon, vil larvene vise mindre eller ingen spontan peristaltiske bevegelser. Presisjon er derfor viktig, spesielt når du gjør et snitt på dorsal side med våren saks og fjerne indre organer med tang. Detaljer om disseksjon har vært rapportert tidligere 21. Dernest, dersom tilstrekkelig stimulering som skal oppnås, en laser-kraft på omtrent 0,1 ~ 1 mW / mm 2 for CHR2 eller en ~ 10 mW / mm 2 for NpHR er nødvendig. Vi evaluerte laser makt som total lys kraft under en objektiv delt av et beregnet areal for belysning. Vi målte den totale lys kraft ved hjelp av en strømmåler (mobiken, Sanwa MI Technos, Japan). Vi beregnet av belysningsarealet som sirkulære konstant ganger kvadratet av bølgelengden av laseren, noe som gir omtrent belyste området i diffraksjon grensen. Effektiv belysning strøm på prøven kan justeres ikke bare i kraft av laser-utgang, men også ved å endre skannehastighet og nummeneh av repetisjoner. Vi skannet laser med 20-100 μsec / pixel for 63 ganger. I tillegg er uttrykket nivået av optogenetics protein og mengden av ATR er også kritiske for stimulering effektivitet. Følgelig, hvis larver viste ingen optogenetic respons, bør følgende punkter kontrolleres og korrigeres: 1) laser makt (ved å optimalisere mikroskop system), 2) uttrykk nivået av optogenetics protein (ved å sjekke genotype og oppdra temperatur), og 3) mengden av ATR (ved å justere konsentrasjonen av ATR og mate periode). NpHR krever høyere konsentrasjon av ATR enn CHR2 gjør av ukjente grunner 13. CHR2 fungerer godt i larver alet opp i mat som inneholder mindre ATR (f.eks 0.1 mm) enn beskrevet her (1 mm). Som fôring larvene til en mM ATR er tilstrekkelig for å gjøre CHR2 foto-reaktive, anbefaler vi denne konsentrasjonen for den første rettssaken i CHR2 eksperimenter. Konsentrasjonen av ATR kan senere bli titrert ned fra 1 mm. Som til eksponering varighet for ATR, anbefaler vivarigheten er beskrevet her for robust optogenetic kontroll. Vi ofte ikke klarte å observere optogenetic respons når mate larvene til ATR for kortere varighet.

I denne protokollen, er laser belysning og bildeopptak drives av en egen datamaskin. Så, er klar påvisning av tid og rom mønster av laser belysning av CCD-kamera kritisk for dataanalyse. Hvis laser spot eller linjen er dim på CCD image, bør du optimalisere kraften av halogenpære og få verdien av CCD-kamera for å visualisere laser belysning mens du holder kroppen veggen synlig.

Spatiotemporal belysning vist i denne protokollen gir informasjon om larve motorkretser, men metoden har noen begrensninger. Hva angår "romlig" aspektet, plassering av belysningen måles ved lav forstørrelse CCD brukes for videotaping kroppsveggen bevegelser. Følgelig kan belysning område være tilordnet segment nivå, men ikke på cellenivå. Hva angår «temporal "aspektet, tidsforsinkelse mellom innkobling av laserskanning av konfokalmikroskop og belysning med laser er avhengig av konfokalmikroskop system og skanning tilstand. Følgelig er noen tester ved prøving og feiling er nødvendig å justere belysning timing. Siden tidspunktet for belysning kan fastsettes i CCD image filmer ved hjelp av tilstrekkelig programvare som ImageJ, er den kritiske faktoren i tidsmessig oppløsning bildefrekvens på CCD-kamera imaging. Vi vanligvis setter bildefrekvens for 7.5-15 bilder per sekund.

Fremskritt i optogenetic verktøy gir oss en sjanse til å endre denne protokollen. Vi brukte 3 rd instar larver besittelse OK6-Gal4 og UAS-CHR2 [H134R] eller UAS-NpHR2. Andre optogenetic verktøy i stedet for CHR2 [H134R] eller NpHR2 som CHR2 [T159C/E123T], NpHR3 eller Arch kan øke effektiviteten av aktivitet kontroll 22. I tillegg kan bruk av andre Gal4 linjer eller analyse i andre utviklingsstadier gi mer informasjon om motor circuits.

I denne protokollen, ble motorisk aktivitet overvåkes av overføring bilder av bodywall sammentrekning med en CCD-kamera. Aktiviteten av motoriske nerveceller med kalsium-sensitive fluorescens molekyler (f.eks GCaMP) kan også være direkte overvåket mens manipulere nevral aktivitet med CHR2 eller NpHR. I dette tilfellet blir blått lys belysning i et bredt område og en svært følsom CCD-kamera (f.eks EMCCD kamera) benyttes i stedet for en halogenlampe og den normale CCD-kamera som tidligere er beskrevet heri. For å forbedre romlig oppløsning på stimulering mens overvåking bodywall bevegelse, ved hjelp av en ekstra objektivlinse kan være en mer avansert metode: belysning av den ventrale nerve ledningen ved en høy forstørrelse objektivlinse (f.eks 40x) ovenfra prøven og overvåking bodywall ved lav forstørrelse linse (f.eks 4x) under prøven. Denne doble linsesystem kan tillate oss å stimulere nervesystemet i høyere romlig oppløsning.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en Grant-i-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Mesoskopisk neurocircuitry" (nr. 22115002) og «Comprehensive Brain Science Network" (nr. 221S0003) i Kunnskapsdepartementet, Kultur, sport, vitenskap, og teknologi, Japan til AN og Grant-i-Aid for Unge Forskere (B) (nr. 21700344) av Japan Society for Promotion of Science (JSP) til HK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BX61WI Microscope Olympus Corporation BX61WI
Fluoview FV1000 confocal system Olympus Corporation FV1000
CCD camera Sony XCD-V60
all-trans retinal Sigma R2500-500MG 200 mM stock in 95% EtOH
Silpot184 Dow Corning Toray 3255981

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).
  2. Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation. J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).
  3. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  4. Gomez-Marin, A., Louis, M. Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than. Curr. Opin. Neurobiol. , (2011).
  5. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nat. Methods. , (2012).
  6. Suster, M. L., Bate, M. Embryonic assembly of a central pattern generator without sensory input. Nature. 416, 174-178 (2002).
  7. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  8. Miesenbock, G., Kevrekidis, I. G. Optical imaging and control of genetically designated neurons in functioning circuits. Annu. Rev. Neurosci. 28, 533-563 (2005).
  9. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  10. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
  11. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J. Neurophysiol. 101, 3075-3088 (2009).
  12. Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in Drosophila. Adv. Physiol. Educ. 35, 82-91 (2011).
  13. Inada, K., Kohsaka, H., Takasu, E., Matsunaga, T., Nose, A. Optical dissection of neural circuits responsible for Drosophila larval locomotion with halorhodopsin. PLoS One. 6, e29019 (2011).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  15. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  16. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  17. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (1073).
  18. Hildebrand, E., Dencher, N. Two photosystems controlling behavioural responses of Halobacterium halobium. Nature. 257, 46-48 (1975).
  19. Takahashi, T., Mochizuki, Y., Kamo, N., Kobatake, Y. Evidence that the long-lifetime photointermediate of s-rhodopsin is a receptor for negative phototaxis in Halobacterium halobium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 127, 99-105 (1985).
  20. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  21. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107 (2009).
  22. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).

Tags

Nevrovitenskap molekylærbiologi nevrobiologi Developmental Biology bioteknologi cellebiologi motoriske nerveceller nevrovitenskap, Optogenetics channelrhodopsin-2 Halorhodopsin laser Konfokalmikroskopi dyremodell
Optogenetic forstyrrelse av nevrale aktiviteten med Laser Illumination i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose,… More

Matsunaga, T., Fushiki, A., Nose, A., Kohsaka, H. Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion. J. Vis. Exp. (77), e50513, doi:10.3791/50513 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter