Summary
Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.
Abstract
Onder methodes om eiwit-eiwit interacties binnen cellen te bestuderen, Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) is relatief eenvoudig en gevoelig. BiFC is gebaseerd op de productie van fluorescentie met behulp van twee niet fluorescerende fragmenten van een fluorescent eiwit (Venus, een geel fluorescent eiwit variant wordt hier gebruikt). Niet-fluorescerende Venus fragmenten (VN en VC) gefuseerd aan twee interagerende proteïnen (in casu AKAP LBC-en PDE4D3), waardoor fluorescentie door VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 interactie en de vorming van een functioneel fluorescent eiwit in cellen.
BiFC geeft informatie over de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen en de kracht van eiwit interacties op basis van fluorescentie-intensiteit. Echter, BiFC microscopische analyse van de sterkte van eiwit-eiwit interacties te kwantificeren is tijdrovend en enigszins subjectief door heterogeniteit in eiwitexpressie en interactie. Door koppeling flowcytometrischeanalyse BiFC methodologie, kan het fluorescerende BiFC eiwit-eiwitinteractie signaal nauwkeurig worden bepaald voor een grote hoeveelheid cellen in een korte tijd. Hier tonen we een toepassing van deze methode in kaart regio's in PDE4D3 die nodig zijn voor de interactie met AKAP-LBC. Deze high throughput methode kan worden toegepast op screening factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.
Introduction
650,000 eiwit-eiwit interacties worden geraamd, dat in het menselijk interactome, spelen cruciale rol in het handhaven van normale celfuncties 1,2. Naast co-immunoprecipitatie (co-IP), de gouden standaard eiwit-eiwit interacties te bestuderen van cellysaat, verschillende eiwitbanden fragment complementatie bepalingen (PCA) zijn ontwikkeld om de gevoeligheid in het detecteren van eiwit-eiwit interacties binnen cellen 3 verbeteren. Technieken omvatten Förster-energieoverdracht (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), en Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) 4,5. BiFC is gebaseerd op het vergemakkelijkt associatie van twee fragmenten van een fluorescerend eiwit (hier gebruiken we Venus, een YFP variant) die elk worden gefuseerd aan een potentiële interactie eiwit partner (in dit voorbeeld gebruiken we AKAP LBC-en PDE4D3). Interactie van de twee eiwitten van belang in cellen resulteert in functionele fluorescentie, die gevisualiseerd door f kanluorescence microscopie met behulp van live of vaste cellen 6,7,8. Vergeleken met andere PCA's, BiFC is gevoelig en minder technisch uitdagend, met potentieel om de cellulaire lokalisatie in levende cellen te bestuderen. Een belangrijk nadeel van deze techniek is echter dat eenmaal gevormd, het fluorescerende eiwit complex kan niet worden omgekeerd. Daarom is het niet een goede methode om dynamische eiwit-eiwit interacties te bestuderen. In dit artikel gebruiken we BiFC om de interactie plaatsen van PDE4D3 kaart met AKAP-LBC door monitoring van de fluorescentie-intensiteiten van Venus. Vergeleken met traditionele analyse met fluorescentie microscopie, hetgeen tijdrovend en arbeidsintensief (indien niet uitgevoerd met behulp van geautomatiseerde high throughput machines), flowcytometrie biedt een eenvoudige kwantitatieve analyse van duizenden cellen in een heterogene populatie over een korte tijd 9, 10. Hier, door het uitvoeren van een side-by-side vergelijking van flowcytometrische analyse-BiFC en traditionele co-IP, tonen we aan dat de twee methoden bieden vergelijkbare gegevens echter flowcytometrische BiFC analyse is minder tijdrovend en gebruikt minder materiaal dat nuttiger kunnen zijn wanneer de cellen van belang zijn beperkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Transfectie
- Plaat cellen de dag voor transfectie, plating minder cellen voor immunofluorescentie.
- Voor immunofluorescentie: in een 6-wells plaat, jas glas dekglaasjes (1 per putje) met 0,02% gelatine bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur, een keer wassen met medium, en voor elk putje, plate 1 x 10 5 HEK 293T cellen in 2 ml compleet kweekmedium [Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) plus 10% FBS].
- Voor flowcytometrische en Western blot analyses: plate 1,2 x 10 5 HEK 293T cellen / putje in 2 ml compleet groeimedium in 6-well platen (0,3 x 10 5 HEK 293T-cellen in 0,5 ml compleet kweekmedium per well in 24-well plaat ).
- Bereid DNA voor transfectie volgens proefopzet fabricage's: Effectene (Qiagen) wordt gebruikt voor immunofluorescentie. Transit-LT1 (Mirus) wordt gebruikt voor flowcytometrische en Western blot analyses. Hoeveelheid DNA gebruikt wordt hieronder vermeld.
Transfectie met Effectene (6-well):24-well plaat (ng) 6-well plaat (ng) CFP-vector 10 50 VN N-AKAP-LBC 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-UCR1 (a PDE4D3 N-terminaal fragment dat de UCR1 domein) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (een PDE4D3 C-terminale fragment dat de UCR2 en katalytische domeinen) 100 - Voeg aangegeven hoeveelheid plasmide-DNA + 4 ui enhancer aan 100 gl buffer EC, meng en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 ul Effectene, meng en incubeer gedurende 10 minuten bijkamertemperatuur. Voeg druppelsgewijze aan cellen.
- Voeg aangegeven hoeveelheid plasmide DNA μl/50 250 gl Opti-MEM I serumvrij medium in een steriele buis.
- Voeg transit-LT1 reagens om de verdunde DNA-mengsel en pipet voorzichtig te mengen. (Transit-LT1 Reagens: DNA-verhouding is 3 pi van doorvoer-LT1 reagens per 1 ug DNA).
- Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en voeg druppelsgewijze aan cellen.
2. Cel Voorbereiding voor flowcytometrie, Western Blot en Immunofluorescentie
- 24 uur na transfectie, check fluorescentie onder epifluorescentiemicroscoop voor de oogst cellen.
- Celpreparaat voor flowcytometrische analyse:
- Was de cellen met 0,5 ml / 2 ml ijskoude PBS 24-well/6-well platen.
- Los cellen met behulp van 50 μl/250 pi 0,05% trypsine.
- Neutraliseer trypsine met 200 ul / 1 ml DMEM medium.
- Collect 250 ul cellen (voor 24 putjes en 6-wells plaat) door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten, met de resterende cellen (1 ml) voor Western blot analyse.
- Resuspendeer cellen in 250 pi FACS buffer [PBS + 0,5% (w / v) BSA + 2 mM EDTA], opslag op ijs flowcytometrische analyse. Cellen kunnen ook in 1% paraformaldehyde vastgesteld (in PBS) als flowcytometrieanalyse zal niet onmiddellijk.
- Celpreparaat voor Western blot analyse: uitgevoerd in parallel met celpreparaten van flowcytometrie-analyse.
- Was de cellen met 1 x 2 ml ijskoude PBS, lyseren cellen door toevoeging van 100 ul lysis buffer [10 mM natriumfosfaatbuffer, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
- Verzamel cellysaat door centrifugatie gedurende 10 min bij 21.000 xg bij 4 ° C.
- Kwantificeren eiwitconcentratie door Bradford eiwit assay, laadt gelijke hoeveelheden eiwit per laan voor SDS-PAGE, en over te dragen aan nitrocellulose voor immunoblotting.
- Celpreparaat voor immunofluorescentie.
- Spoel cellen 3x met 2 ml PBS, repareren cellen in 1 ml van 3,7% paraformaldehyde (in PBS) gedurende 10 min bij kamertemperatuur was daarna 3x met 2 ml PBS gedurende 5 minuten.
- Monteer dekken slip op een glasplaatje, met behulp van montage medium. Dicht de dekglaasje randen met nagellak indien nodig.
- Bewaar de dia bij 4 ° C voor onderzoek.
3. Flowcytometrie en immunofluorescentie microscopie
- Flowcytometrie wordt uitgevoerd met behulp van een Beckman Coulter Cyan ADP, uitgerust met 488 nm, 405 nm en 642 nm solid-state lasers. Summit software wordt gebruikt voor het verwerven en analyseren.
- Kalibreren doorstroomcytometer met standaard kralen.
- Perceel Forward verstrooiing (FSC) / Zijwaartse verstrooiing (SSC) op een lineaire schaal voor venstertijd levende cel populatie.
- Perceel FSC / spanning pulsbreedte voor gating niet-geaggregeerde levende cel populatie.
- Perceel count/FL6 (GVB fluorescence, 405 nm) op een log schaal voor gating niet-geaggregeerde levende GVB-positieve cellen.
- Perceel count/FL1 (YFP fluorescentie, 488 nm) op een log schaal voor BiFC intensiteit.
- Run YFP-CFP-double negatieve monsters, passen FSC, SSC, VT1 en FL6 fotoversterkerbuis (PMT) spanning om de drempel voor elk signaal instellen.
- Run single positief (zowel YFP + en GVB +) monsters voor toekomstige off-line compensatie
- Verwerven ten minste 10.000 gated events (niet-geaggregeerde levende GVB + cellen) voor analyse.
- Immunofluorescentiemicroscopie wordt uitgevoerd met behulp van een Zeiss LSM 510 confocale microscoop. Opmerking: het is belangrijk om alle instellingen (zoals de zoom, pinhole, detector gain, versterker offset, framegrootte, scansnelheid, scan-gemiddelde, en laservermogen) consistente tussen houden monsters voor een goede vergelijking van alle data.
4. Data-analyse (uitgevoerd met behulp van Summit Software)
- Stel de analyse protocol vergelijkbaar met die voor acquisition met de juiste gating:
Gate 1 in FSC / SSC dot plot voor levende cellen.
Gate 2 in FSC / pulsbreedte van Gate 1 voor niet-geaggregeerde levende cellen.
Poort 3 in count / GVB van Gate 3 voor niet-geaggregeerde GVB + levende cellen. - Compenseren YFP en CFP signaal met behulp van YFP + en GVB + enkele positieve cellen.
- Opnieuw bepalen Uiterste lijnen voor CFP / YFP-positieve cellen.
- Export YFP gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van GVB + cellen naar Excel voor data-plotten.
- Normaliseren YFP MFI de expressie van AKAP-LBC, PDE4D3 en belastingsbegrenzing α-tubuline, zoals bepaald door Western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AKAP-LBC en PDE4D3 constructies (Figuur 1B) werden gefuseerd met VN en VC fragmenten, respectievelijk. Interactie van AKAP-LBC en PDE4D3 resulteert in functionele YFP fluorescentie (Figuur 1A). Hier gebruiken we de BiFC methode om de kaart AKAP-LBC-bindingsplaatsen in PDE4D3. Upstream geconserveerd gebied 1 (UCR1) stroomopwaarts geconserveerde gebied 2 (UCR2) en katalytische gebied (CAT) zijn geconserveerd onder PDE4 familie eiwitten, is de volledige lengte (FL), UCR1 en UCR2 plus CAT werden gebruikt voor het screenen van de bindingsplaats van PDE4D3 naar AKAP-LBC. De expressie van de VN-AKAP-LBC en VC-PDE4D3-fragmenten in HEK 293T cellen resulteert in fluorescentie met verschillende intensiteit (figuur 1C). BiFC geeft aan dat zowel UCR1 en UCR2 + CAT bijdragen aan de interactie van PDE4D3 met AKAP-LBC. Greater fluorescentie-intensiteit als gevolg van AKAP-LBC-UCR1 interactie vergeleken met AKAP-LBC-UCR2 + CAT geeft aan dat PDE-UCR1 bindt aan AKAP-LBC beter PDE-UCR2 + CAT.
(figuur 2A) en cel aggregaten met SSC vs Pulse Width double dot (figuur 2B) uitgesloten uitgesloten. Cellen met BiFC signaal of GVB uitdrukking alleen waren used om de vergoeding te bepalen en cut-off voor cellen zonder fluorescentie (figuur 2C-2F). CFP vector gecotransfecteerd met BiFC constructen en CFP expressie werd gebruikt als een positieve marker voor succesvolle transfectie geven. Slechts GVB + cellen werden gebruikt voor het meten van fluorescentie BiFC. Transfectie van toenemende hoeveelheden PDE4D3 resulteerde in verhoogde Venus (YFP) BiFC signaal (figuur 3A), terwijl de CFP-signaal onveranderd bleef (Figuur 3B). Expressie van VN-AKAP-LBC en toenemende hoeveelheden VC-PDE4D3 werd bevestigd door Western blot (Figuur 3C). Kortom, PDE verhoogde expressie resulteerden in een lineaire toename van fluorescentie BiFC correleren aan PDE expressie (Figuur 3D). Deze resultaten gevalideerd het gebruik van flowcytometrie om AKAP-LBC-PDE4D3 interactie kwantificeren door het meten van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van BiFC. We daarom gebruikt deze methodiek in kaart AKAP-LBC bindingsplaatsen binnen PDE4D3 met VN-AKAP-LBC en VC-PDE4D3 constructies. In overeenstemming met onze waarnemingen in figuur 1C, expressie van VN-AKAP-LBC en VC-PDE4D3-UCR2 + CAT resulteerde in lagere BiFC signaal in vergelijking met VC-PDE4D3-FL en VC-PDE4D3-UCR1 (Figuur 4B). Vergelijkbare eiwitexpressie werd in alle monsters stroming (figuur 4C) en gemiddelde fluorescentie werd genormaliseerd om de relatieve expressieniveaus van AKAP-LBC, PDE4D3 en α-tubuline. Daarom genormaliseerde BiFC MFI geeft aan dat er geen verschil is in de fluorescentie-intensiteit tussen AKAP-LBC-PDE4D3-FL en AKAP-LBC-PDE4D3-UCR1, maar veel lager signaal voor AKAP-LBC-PDE4D3-UCR2 + CAT interactie (figuur 4A ). Deze resultaten suggereren dat er meerdere gebieden PDE4D3 die interageren met AKAP-LBC en dat PDE4D3-UCR1 is de belangrijkste regio interactie met AKAP-LBC. Dit resultaat werd bevestigd door co-IP, de gouden standaard voor eiwit-eiwit interacties (figuur 5).
Figuur 1. BiFC analyse van AKAP-LBC-PDE4D3-fragment interactie met immunofluorescentie microscopie. A) Schematische vertegenwoordiger van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC). Venus fragmenten; VN en VC zijn gefuseerd met AKAP-LBC en PDE4D3 respectievelijk. AKAP-LBC-PDE4D3 interactie resulteert in functionele YFP fluorescentie. B) Schematische weergave van PDE4D3 constructen gebruikt voor het in kaart brengen. C) Vertegenwoordiger BiFC signalen van getransfecteerde HEK 293T cellen. Cellen werden gecotransfecteerd met VN-AKAP-LBC en VC-PDE4D3 constructen (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT) voor BiFC analyse. GVB-vector werd ook gecotransfecteerd als transfectie marker. 24 uur na transfectie werden de cellen gefixeerd voor beeldvorming. BiFC signaal wordt getoond in groen en GVB wordt getoond in pseudocolor rood in de samengevoegde cijfers. 9/50529fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Bepaling van de poorten en compensatie voor FACS-analyse. A) FSC vs SSC puntdiagram naar gate levende cellen en puin en dode cellen te sluiten. B) Side Scatter versus pulsbreedte puntenplot tot poort enkele cellen en aggregaten sluiten. C) Cellen die CFP (GVB + cellen) voor compensatie. D ) Cellen die CFP (GVB + cellen) na YFP compensatie. De cut-off lijn voor cellen met YFP expressie werd opnieuw vastgesteld. E) cellen met BiFC signaal (YFP + cellen) voor compensatie. F) cellen met BiFC signaal (YFP + cellen) na GVB compensatie. De cut-off lijn voor cellen met GVB expressie werd opnieuw vastgesteld.target = "_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Analyse van AKAP-LBC-PDE4D3 interactie met BiFC-flowcytometrie door het variëren van de hoeveelheid PDE4D3 meningsuiting. A) Verhoogde BiFC signaal in GVB + cellen getransfecteerd met toenemende hoeveelheden VC-PDE4D3. Cellen werden met CFP (10 ng), VN-AKAP-LBC (200 ng) en toenemende hoeveelheden VC-PDE4D3 (2,5 ng tot 80 ng). Niet-geaggregeerde GVB + levende cellen werden gated en YFP fluorescentie wordt getoond als YFP vs Forward Scatter dubbele dot plot. YFP + cellen worden in het groen. Representatieve gegevens van 5 ng, 20 ng en 80 ng VC-PDE4D3 wordt getoond. B) GVB fluorescentie in levende cellen wordt getoond als GVB vs Forward Scatter dubbele dot plot, wat aangeeft consistente CFP fluorescentie onder alle monsters. C) Western blot analyse waaruit blijkt toenemende PDE4D3 expression met consistente expressie van AKAP-LBC en α-tubuline (gebruikt als een laad controle). D) Venus (YFP) gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van GVB + cellen is gecorreleerd met VC-PDE4D3 expressie. Voudige verandering van zowel YFP MFI van GVB + cellen wordt uitgezet langs de GVB MFI voudige verandering van niet-geaggregeerde levende cellen. Relatieve expressie niveaus van VC-PDE4D3 bepaald door Afbeelding J analyse van Western blot worden ook uitgezet. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. BiFC analyse van AKAP-LBC interactie met PDE4D3-FL, PDE4D3-UCR1, PDE4D3-UCR2 + CAT met behulp van flowcytometrie. A) AKAP-LBC-PDE4D3-fragment interactie werd gekwantificeerd door Venus-MFI genormaliseerd naar eiwitexpressie (AKAP-LBC, PDE4D3 fragmenten en laad controle α-tubuline). Difference in BiFC signaal werden onderzocht door een weg variantie-analyse (ANOVA) Een p-waarde <0.01 wordt als zeer significant (**), terwijl ap waarde> 0,05 wordt beschouwd als niet significant (ns). B) Vertegenwoordiger BiFC signaal in getransfecteerde HEK 293T cellen. HEK 293T-cellen werden gecotransfecteerd met GVB, VN-AKAP-LBC en VC-PDE4D3 constructen (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT). Niet-geaggregeerde levende GVB + cellen werden gated, en hun BiFC fluorescentie wordt weergegeven in YFP vs Forward Scatter dubbele dot plot. C) Western blot aangeeft vergelijkbare expressie van AKAP-LBC en PDE4D3-fragmenten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 5. Bevestiging van flowcytometrie analyse door co-immunoprecipitatie. HEK 293T cellen gecotransfecteerdvoor de expressie van V5-AKAP-LBC en GFP-PDE4D3 constructen (FL-,-UCR1,-UCR2 + CAT). 48 uur na transfectie, AKAP-LBC werd immunoprecipitatie met V5-agarose kralen. Binding van PDE4D3-FL, UCR1 en UCR2 + CAT werd gedetecteerd door SDS-PAGE en Western blot met anti-GFP primair antilichaam. De overeenkomstige PDE4D3 ingang gebruikt voor immunoprecipitatie wordt ook getoond, wat aangeeft soortgelijke uitdrukking voor alle PDE4D3-fragmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC is een eenvoudige en gevoelige methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze werkwijze kan niet worden gebruikt om nieuwe eiwit-eiwit interacties te identificeren, maar het is vooral handig om eiwit-eiwit interacties binnen cellen bevestigen en functionele eigenschappen te bestuderen, zoals subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen, in kaart brengen van eiwit-eiwit interactieplaatsen en voor het screenen van kleine moleculen / peptiden die eiwit-eiwit interacties kunnen moduleren. Omdat VN en VC fragmenten niet-fluorescerende achtergrond fluorescentie is, dus helpen de gevoeligheid van deze test. Er is tijd nodig om te rijpen / stabiliseren van de VN-proteïne-VC-eiwitinteractie, waardoor er vertraging visualiseren van de eiwit-eiwit interacties en optimale tijdstippen kan dus empirisch worden bepaald. Ook moet worden opgemerkt dat VN-proteïne-VC-eiwitinteractie is niet omkeerbaar, dus nog met huidige Venus BiFC construeert deze test niet geschikt to studie dynamische kinetiek van eiwit-eiwit interacties.
De juiste controles zijn belangrijk voor BiFC analyse. Een geschikte negatieve controle bevat niet-interagerende eiwitten of niet-specifieke peptiden in de desbetreffende BiFC vector, of indien mogelijk, een mutant die eiwit-eiwit interacties verstoort. Lege BiFC vector geen goede controle als het resulteert in niet-specifieke hoge achtergrondfluorescentie. Als BiFC niet wordt waargenomen in twee interagerende proteïnen, hun uitdrukking moeten worden geanalyseerd. Ook kan BiFC signaal variëren naargelang de eiwit-eiwitinteractie sites. Opgemerkt wordt dat de ruimtelijke modulatie van VN en VC interactie kan ook invloed hebben op de fluorescentie-intensiteit, daarom is het belangrijk om in eerste instantie BiFC experimenten met zowel C-terminale en N-terminale VN / VC expressieconstructen voeren. Bijvoorbeeld kan BiFC niet op als eiwit interactie blokkeert de re-associatie van de fragmenten Venus. Daarom meerdere combinaties van VN en VC construeert schouderd worden getest (dwz zowel C-en N-terminale eiwitfusies).
Fluorescentie-intensiteit van BiFC is evenredig met de sterkte van eiwit-eiwit interacties, met hogere intensiteit BiFC vermelding sterkere interactie en lagere fluorescentie-intensiteit suggereert zwakker interactie. BiFC MFI wordt daarom gebruikt als indicator voor eiwit-eiwitinteractie. Bij nauwkeurige analyse van eiwit-eiwit interacties door BiFC, is het zeer belangrijk dat Western blot analyse uitgevoerd om gelijke expressie van verschillende constructen waarborgen en geen proteïne degradatie optreedt, die kunnen interfereren met de juiste analyse. Lysaat van dezelfde monsters heeft derhalve de voorkeur voor Western blot analyse soortgelijke eiwitexpressie te bepalen voor alle geanalyseerde monsters. Bovendien, is het essentieel om geschikte hoeveelheid plasmiden bepalen transfectie lineaire expressie en de interactie van eiwitten garanderen en onder dit bereik, de interactie van eiwit correleert with fluorescentie-intensiteit van BiFC signaal.
Lage hoeveelheid GVB plasmide wordt gebruikt als een marker voor succesvolle transfectie, dus alleen CFP positieve cellen werden geanalyseerd hier. Een ander fluorescerend eiwit, zoals RFP kunnen worden gebruikt om de doorbloeding te minimaliseren tussen kleuren 11. Voor flowcytometrie, zijn enkele positieve cellen die nodig zijn om te worden opgenomen voor de vergoeding. Indien mogelijk, worden minstens 10.000 GVB positieve cellen geteld om een goede steekproef te waarborgen.
Samengevat, hier zien we dat koppeling BiFC methodologie flowcytometrische analyse kan worden gebruikt als een goede indicator van eiwit-eiwit interacties in cellen. Traditionele analyse van BiFC met immunofluorescentie microscoop is tijdrovend, en de steekproefgrootte is veel lager dan die welke overeenkomt met cytometrieanalyse stromen. Aldus koppeling flowcytometrie met BiFC voordelig voor analyse van eiwit-eiwit interactie kan als transfectie-efficiëntie laag. In dezerapport, hebben we geprofiteerd van BiFC-flowcytometrie om de interactie plaatsen in PDE4D3 kaart voor binding aan AKAP-LBC. Deze techniek kan worden uitgebreid om te screenen op moleculen of peptiden die kunnen verstoren of versterken eiwit interactie, voor drug discovery 12. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om bepaalde fysiologische gebeurtenissen, zoals ligand-geïnduceerde internalisatie van GPCR's 13 bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken de O'Bryan lab bij UIC voor kritische experimentele evaluatie en discussie. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Grant 11SDG5230003 om GKC en National Center for Translational Science Vooruitgaan - UIC Centrum voor klinisch en translationeel Sciences Grant UL1TR000050.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
| Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
References
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
