Vivo imaging di cellule esposte al colorante lipofilo FM1-43 consente una determinazione precisa della cinetica con cui tossine formanti pori vengono rimossi dalla membrana plasmatica. Questo è un test sensibile che può essere utilizzato per valutare requisiti di Ca 2 +, sfingomielinasi e altri fattori sulla membrana plasmatica di riparazione.
Lesione della membrana plasmatica è un evento frequente, e le ferite devono essere rapidamente riparato per garantire la sopravvivenza cellulare. Afflusso di Ca 2 + è un evento chiave di segnalazione che attiva la riparazione di ferite meccaniche sulla membrana plasmatica entro ~ 30 sec. Recenti studi hanno rivelato che le cellule di mammifero anche richiudersi loro membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con formazione di pori tossine in un processo 2 +-dipendente Ca che coinvolge esocitosi della sfingomielinasi acida lisosomiale seguita da pori endocitosi. Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per dimostrare che la richiusura delle cellule permeabilizzate dalla tossina streptolisina O è anche un rapido e dipendente da Ca 2 + afflusso. Il design saggio permette la sincronizzazione dell'evento lesioni e una misurazione cinetica precisa della capacità delle cellule di ripristinare l'integrità della membrana plasmatica mediante imaging e quantificare la misura in cui il colorante liphophilic FM1-43 raggiunge membrane intracellulari. Questo live als testO consente una valutazione sensibile della capacità di esogenamente aggiunto fattori solubili quali sphingomyelinase inibire FM1-43 afflusso, riflettendo la capacità delle cellule di riparazione sulla membrana plasmatica. Questa analisi ha permesso di mostrare per la prima volta che sphingomyelinase agisce a valle di Ca 2 +-dipendente esocitosi, poiché extracellulare aggiunta dell'enzima promuove richiusura delle cellule permeabilizzate in assenza di Ca 2 +.
E 'noto da diversi decenni riparazione della membrana plasmatica dopo una lesione meccanica è un 1,2 Ca 2 +-dipendente processo. Studi successivi hanno mostrato che Ca 2 + afflusso attraverso la ferita innesca un vigoroso processo di esocitosi di vescicole intracellulari al sito della lesione, che è richiesto per richiusura 3,4. Il tasso di perdita di un colorante fluorescente caricato nel citoplasma delle cellule è stato utilizzato per valutare la velocità di riparazione, concludendo che richiusura è stato completato entro <30 sec dopo la lesione 5. Due modelli sono stati inizialmente proposti per spiegare il requisito di esocitosi nella riparazione membrana plasmatica: 1) il modello "patch", che suggerisce che Ca 2 + afflusso attraverso la lesione innesca fusione inizialmente omotipica di vescicole intracellulari, formando una grande "patch" che sarebbe poi essere applicato alla membrana plasmatica di richiudere la ferita 6 e 2) il modello di riduzione della tensione, che propone di membrana Added entro Ca 2 +-dipendente esocitosi in prossimità della ferita ridurrebbe tensione della membrana plasmatica, facilitando richiusura del doppio strato 7. Il ruolo di Ca 2 +-triggered esocitosi nel plasma di riparazione della membrana è stata ulteriormente rafforzata da studi che dimostrano che i lisosomi contengono una molecola di Ca 2 + sensore, synaptotagmin VII, che facilita il loro esocitosi e plasma riparazione della membrana in cellule danneggiate 8,9,10,11 .
Tuttavia, ulteriori elementi di prova ha indicato che solo esocitosi non era sufficiente a promuovere la riparazione della membrana plasmatica. Oltre alle rotture meccaniche sulla membrana plasmatica, una forma frequente di danno cellulare è permeabilizzazione da tossine formanti pori prodotte da batteri o cellule immunitarie 12,13 14,15. Diversamente lacrime meccanici, proteine formanti pori si inseriscono sulla membrana plasmatica formando una stabile, poro proteina-allineato che non può essere richiuso semplicemente applicando una "patch" membrana o da riduzioneing tensione della membrana. Curiosamente, studi hanno rivelato che le cellule di mammifero hanno un meccanismo efficace per riparare la membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con proteine formanti pori, e questo processo richiede anche la presenza di Ca 2 + extracellulare 12. Questa scoperta ha sollevato la questione se la rimozione dei pori transmembrana dalla superficie cellulare era anche un processo rapido, come osservato con ferite meccaniche 5. Sorprendentemente, i nostri studi recenti rivelato che la richiusura delle cellule permeabilizzate con tossine formanti pori ha proprietà molto simili alla riparazione di ferite meccaniche: il processo richiede Ca 2 + extracellulare, e completata entro ~ 30 sec. Indagare questo processo più in dettaglio, abbiamo recentemente appreso che, oltre a Ca 2 + esocitosi regolata dei lisosomi, riparazione membrana plasmatica comporta una rapida forma di endocitosi, che viene attivato dal rilascio dell'enzima lisosomiale sfingomielinasi acida (ASM) ed è essenziale non solo per the rimozione dei pori transmembrana, ma anche per la riparazione di ferite meccaniche 16.
Per determinare la cinetica di una nuova chiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine formanti pori, nel nostro laboratorio abbiamo adattato una metodologia di imaging dal vivo che era stato precedentemente utilizzato per valutare la richiusura delle fibre muscolari isolate infortunato laser 17. Questo test si basa sulle proprietà del colorante lipofilo FM1-43, che si intercala stabilmente nel foglietto esterno di bistrati lipidici crescente di intensità di fluorescenza. Quando la membrana a doppio strato plasma viene perturbato extracellulari guadagni tinture accesso alle membrane intracellulari, fornendo un saggio sensibile per rilevare lesioni membrana plasmatica e riparare 18,16,19,20. Per adattare questo test per la valutazione della richiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine formanti pori, abbiamo le cellule pre-incubate a 4 ° C con la tossina batterica streptolisina O (SLO), che si lega al colesterolo di membrana 21. Cell sincronopermeabilizzazione può quindi essere facilmente ottenuto spostando le celle da ghiaccio per riscaldare medie in una fase microscopio riscaldata, che attiva l'oligomerizzazione e cambio di conformazione che porta alla formazione di pori transmembrana. Un vantaggio di questo approccio, nei saggi precedentemente pubblicati utilizzando ferimento laser, è che un numero maggiore di cellule possono essere analizzati simultaneamente in un campo microscopico, fornendo una migliore campionamento della popolazione cellulare. Date le similarità meccanicistiche tra il processo richiusura cellulare visto dopo l'infortunio meccanica e permeabilizzazione con le tossine che formano pori, il saggio che descriviamo qui fornisce un metodo molto versatile e potente per i fattori coinvolti nel fondamentale processo di riparazione della membrana plasmatica dissezione. Come esempio, si dimostra che è possibile utilizzare questo test per identificare fasi Ca 2 + dipendenti ed indipendenti del processo di riparazione.
Studi precedenti sul pregiudizio e la membrana plasmatica riparazione meccanica invocati diversi meccanismi delle cellule feriti, che vanno dalla caduta perle di vetro, micropipetting, tranciatura, graffiare o raschiare. La lettura di tutti questi saggi era più qualitativa che quantitativa, e non dare informazioni precise sulla cinetica del meccanismo di riparazione. La capacità delle cellule di richiudere loro membrana plasmatica dopo queste forme di lesioni è stata misurata dalla presenza o assenza di rivelatori ag…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R37 AI34867 e R01 GM064625 a NWA Ringraziamo il Dott. R. Tweten dalla University of Oklahoma per l'espressione plasmide SLO.
Reagent | |||
HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
Material | |||
Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber |