Parabiosis i Mus: En detaljert protokoll

Summary

Parabiotic sammenføyning av to organismer som fører til utvikling av en felles sirkulasjons-systemet. I denne protokollen beskriver vi den kirurgiske fremgangsmåten for å danne en parabiotic forbindelse mellom en villtype-mus og en konstitutiv GFP-uttrykkende mus.

Abstract

Parabiosis er en kirurgisk forening av to organismer slik deling av blodsirkulasjonen. Feste huden av to dyr fremmer dannelsen av microvasculature på stedet av inflammasjon. Parabiotic partnere dele sine sirkulerende antigener og dermed er fri for uønskede immunreaksjon. Først beskrevet av Paul Bert i 1864 ^en ble parabiosis kirurgi raffinert av Bunster og Meyer i 1933 for å forbedre dyre overlevelse ^to. I den aktuelle protokoll, blir to mus kirurgisk sluttet etter en modifikasjon av den Bunster og Meyer teknikk. Dyr blir koblet gjennom albuen og kneledd, etterfulgt av feste av huden gir fast støtte som hindrer at belastningen på huden sutureres. Heri, vi beskrive i detalj parabiotic sammenføyning av en allestedsnærværende GFP uttrykke mus til en vill type (WT) mus. To uker etter at inngrepet er de to separerte og GFP-positive celler kan påvises ved flowcytometrisk analyse i blodet sirkulererion av WT mus. Blodet kimerisme gjør det mulig å undersøke bidraget av de sirkulerende cellene fra ett dyr i den andre.

Introduction

Parabiosis, kirurgisk sammenføyning av to organismer, ble først beskrevet i 1864 av Paul Bert som en måte for å utvikle en modell for å studere felles sirkulasjons-systemer og besto av sammenføyning av huden og muskelveggene av to rotter ^en. Parabiosis fremmer dannelsen av microvasculature på stedet av inflammasjon ³ og har fått en rekke anvendelser innen fysiologiske undersøkelser, slik som hormonelle kommunikasjon mellom hypofysen og gonader, så vel som betydningen av nyrene hos hypertensjon ^4.. Det er videre benyttet for å undersøke rekruttering og integrering av progenitorceller i neovaskularisering ^5, vandring av hematopoietiske stamceller ^{til 6,} og lymfocytt handel ^7, så vel som betydningen og kinetikk av sirkulerende inflammatoriske eller stamceller i tumormetastase ^8,9, og nevrodegenerativ sykdom ^10.

En vesentlig fordel med parabiosis løgnerved at de samarbeider dyrene har felles sirkulerende antigener, slik at cellemigrering og neovaskularisering uten å utløse en immunologisk reaksjon. Viktigere, Weissman et al. Har vist at parabiosis mellom mannlige og kvinnelige mus fører ikke til dannelse av anti HY antistoffer ^11.

I den opprinnelige protokoll som er beskrevet av Paul Bert de to dyr ble sammenføyd gjennom kontakt mellom huden og muskelvegger ^1. Denne metoden er imidlertid forårsaket betydelig belastning på dyrene og resulterte i høy dødelighet på grunn av infeksjon av såret. Siden da parabiosis teknikken har blitt revidert av flere grupper med den mest dominerende er protokollen foreslått av Bunster og Meyer i 1933 ^2. Deres metode inkludert sammenføyning av scapula leddene, kroppshulrom, og hud, tillater bedre støtte og mindre smerte for dyrene. På samme tid, er den nye fremgangsmåten resulterte i minimal postoperativ behandling og betydeligdelig redusert dødelighet. Den protokoll som er beskrevet her er en modifikasjon av den Bunster og Meyer teknikk som er mindre invasiv og tillater fastere sammenføyning. Nemlig, blir musene forbundet via albuen og kneledd, så vel som huden. Denne sammenføyning hindrer forlengelse av huden, og derfor forårsaker mindre smerte og komplikasjoner. Her beskriver vi sammenføyning av en vill type (WT) voksen mus til et konstituerende GFP uttrykke mus. Vi viser at to uker etter operasjonen kan vi oppnå 50% av blod kimerisme demonstrere effektiviteten av dette kirurgiske prosedyre for å opprette et felles sirkulasjonssystem.

Protocol

Alle dyrestudier ble utført i henhold til retningslinjene for UCLA dyr omsorg og bruk komité og National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Varigheten av prosedyren beskrevet nedenfor er ca 45-60 min fra begynnelse til slutt. En. Utarbeidelse av kirurgiske feltet Utfør prosedyren i en ren dyr operasjon rom. Utstyr: isofluran Vaporizer, Gaymer T Pumpe med varmepute. Sterile verktøy: to buede tang, fine saks, nål holder. …

Representative Results

Den forventede resultatet av parabiosis av to organismer er lik bidraget fra hvert dyr sirkulasjonssystemet til en felles blodsirkulasjon (fig. 2). Man kan enkelt kontrollere den vellykkede ekvilibreringsperiode av blod av parabiosed WT og GFP positive mus ved flowcytometrisk analyse. Her ble veneblod oppnådd fra halen til begge parabionts ved 2 uker etter kirurgi og ble fraksjonert for perifere blodceller (for å utelukke erytrocytter). Den fraksjon hematopoetiske-avledet cellefraksjon ble deretter an…

Discussion

Den parabiosis metoden diskutert her presenterer minimale tekniske problemer og resultater i lav dødelighet. Vedlegget av kne-og albueledd er en betydelig forbedring av Bunster og Meyer teknikk. Imidlertid forblir den prosedyre invasive dermed opprettholdelse av sterile betingelser gjennom hele operasjonen er avgjørende. For ytterligere å hindre infeksjon av det kirurgiske området, er det viktig at de parabiosed dyr som mottar en blanding av antibiotika, og kontrolleres regelmessig. For å sikre fast støtte og forh…

Materials

Name of equipment	Company	Catalog number
Isoflurane-Phoenix	Clipper	NDC 57319-559-06
Posi-Seal Induction Chamber	Molecular Imaging Products	AS-01-0530-SM
Portable Anesthesia System	Molecular Imaging Products	AS-01-0007
Gaymer T Pump	Gaymar Industries, Inc	TP650
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp	TP-22G
Curved forceps	Roboz	RS-5101
Scissors	Fine Science Tools (FST)	FST 14063-09
Needle holder	FST	FST 12501-13
Electrical shaver	Oster	Golden A5