Cell Death samband med onormal Mitos observerades av Confocal Imaging i Live cancerceller
Summary
Den cytotoxiska aktiviteten hos fenantridin PJ-34 i cancerceller som genomgår mitos dokumenterades i realtid genom levande konfokal avbildning. PJ-34 utrotas human bröstcancer MDA-MB-231 celler, som hyser extra-centrosomes i mitos. Till skillnad från vanlig bifokala mitos, var extra-centrosomes inte klustrade i de två spindeln poler i närvaro av PJ-34.
Abstract
Fenantrenderivaten agerar som potenta PARP1 hämmare förhindrade bifokala klustring av övertaliga centrosomes i flera centrosomal humana cancerceller i mitos. Den fenantridin PJ-34 var den mest potenta molekylen. Declustering av extra-centrosomes orsakar mitotic misslyckande och celldöd i flera centrosomal celler. De flesta fasta humana cancrar har hög förekomst av extra-centrosomes. Aktiviteten av PJ-34 dokumenterades i realtid genom konfokal avbildning av levande humana bröstcancer MDA-MB-231-celler transfekterade med vektorer som kodar för fluorescerande γ-tubulin, som är rikligt i de centrosomes och för fluorescerande histon H2b närvarande i kromosomerna. Avvikande kromosomer arrangemang och de-klustrade γ-tubulin brännpunkter representerar declustered centrosomes upptäcktes i de transfekterade MDA-MB-231-celler efter behandling med PJ-34. Un-klustrade extra-centrosomes i de två spindel polerna föregick deras celldöd. Dessa resultat kopplade for första gången nyligen upptäckt exklusiva cytotoxiska aktiviteten hos PJ-34 i humana cancerceller med extra-centrosomes de-klustring i mitos, och mitotic misslyckande leder till celldöd. Enligt tidigare fynd som observerats med konfokal avbildning av fasta celler, PJ-34 uteslutande utrotas cancerceller med multi-centrosomes utan att försämra normala celler genomgår mitos med två centrosomes och bi-focal spindlar. Denna cytotoxiska aktivitet av PJ-34 delades inte av andra potenta PARP1 hämmare, och observerades i PARP1 bristfälliga MEF härbärgerar extracentrosomes, vilket tyder på dess självständighet av PARP1 inhibition. Live konfokala imaging erbjuds ett användbart verktyg för att identifiera nya molekyler utrota celler under mitos.
Introduction
Fenantren härstammar PARP1 hämmare, inklusive PJ-34, var avsedda att skydda vilande celler från apoptotiska celldöd inducerad av energikrävande PARP1 medierad DNA-reparation enligt stressbetingelser (stroke eller hjärtinfarkt) 1. Men nyligen upptäckte vi att PJ-34, två gånger högre koncentration än den inducerande PARP1 inhibition, uteslutande kan orsaka celldöd i humana cancerceller 2,3. Den snabbare proliferationen av cellen var, var den effektivare utrotning av cellerna. Den cytotoxiska aktiviteten av PJ-34 tillskrevs extra-centrosomes de-klustring i mitos 2. Många humana cancerceller hamnen multicentrosomes 4,5. Inkubation av humana bröstcancerceller MDA-MB-231 som hyser övertaliga centrosomes, med 20 ^ M PJ-34 effektivt utrotas dessa celler inom 72-96 h utan att försämra vilande celler eller några godartade prolifererande celler härbärgerande två centrosomes i mitos <sup> 2,3. Godartade celler inkluderade mänskliga bröst epitelceller MCF-10, humana endotelceller (HUVEC) och primära mesenkymala celler framställda från human tymus. Dessa celler var resistenta mot den cytotoxiska aktiviteten hos PJ-34. PJ-34 inte störa deras cellcykeln under 96 h inkubation eller påverka deras centrosomes och bi-focal spindel formation 2,3.
Bipolär centrosomen montering är avgörande för bipolär spindel formation i mitos 4,5. Därför har celler med mer än två centrosomes utvecklat en knappast förstådd molekylär mekanism är kluster sina extra centrosomes vid två poler 4-9. Underlåtenhet av bipolär montering av sina centrosomes kan orsaka multipolär förvrängd spindlar och avvikande kromosomer segregation som hejdar cellen-cykeln i G2 / M gripandet, och leder till celldöd tillskrivs mitotic misslyckande 4,5. De molekylära mekanismerna bakom extra-centrosomes de-klustring är intensivt undersökt <sup> 10. Att förstå denna död mekanism kommer att exklusivt utrota cancerceller utan att skada friska vävnader 5,10.
Således, föreningar som aktiverar mitotic död katastrof cell erbjuder en ny form av ett selektivt cancerterapi, som kan vara effektiva i ett brett spektrum av humana fasta cancers.Our resultat tyder på att konfokal avbildning kan användas för att identifiera molekyler som påverkar extra centrosomes klustring i mitos 2,3, vilket gör dessa föreningar cancer inriktning läkemedelskandidater.
Vi har dokumenterat den cytotoxiska aktiviteten hos fenantridin PJ-34 genom att skanna fasta och levande humana cancerceller (med hög förekomst av extra-centrosomes i mitos) kontra normala celler. En steg-för-steg beskrivning av imaging metoder som används för att identifiera den cytotoxiska aktiviteten av PJ-34 i humana cancerceller ingår nedan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Live konfokal avbildning tillgänglig i realtid dokumentation av den cytotoxiska effekten av PJ-34 med levande multi-centrosomal celler under mitos (Figur 3 och Kompletterande information). Detta var den första levande dokumentation tillskriva cytotoxicitet av PJ-34 i humana cancerceller till extra centrosomes de-klustring och celldöd, vilket tyder på induktion av Mitotisk Catastrophe celldöd av PJ-34 5-9. Däremot var bi-focal klustring av super-numerary centrosomes observerats i levande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringskällor denna forskning: en gemensam fond av Tel Aviv University tekniköverföring företaget, RAMOT och Sheba-Medical Center (M. CA och SI.), ICRF – israelisk Cancer Research Foundation (M. CA.) Och Israel Science Foundation ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5′-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let’s huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
