Nese epitelceller, innhentet gjennom overfladisk skrape biopsi av frivillige, er utvidet og overført til vevskulturstudier inserts. Når du har nådd konfluens, er celler dyrket på luft væske-grensesnittet, som gir kulturer av ciliated og ikke-ciliated celler. Differensiert nasal epitel cellekulturer gi levedyktige eksperimentelle modeller for å studere luftslimhinnen.
In vitro-modeller med humane primære epitelceller er avgjørende for å forstå viktige funksjoner av respiratorisk epitel i sammenheng med mikrobielle infeksjoner eller inhalert agenter. Direkte sammenligninger av celler hentet fra syke populasjoner tillate oss å karakterisere ulike fenotyper og dissekere de underliggende mekanismene som medierer endringer i epiteliale cellefunksjon. Dyrking epitelceller fra den menneskelige trakeobronkialområdet har vært godt dokumentert, men er begrenset av tilgjengeligheten av menneskelig lungevev eller invasivitet forbundet med å skaffe bronkial børster biopsier. Nese epitelceller er innhentet gjennom mye mindre invasive overfladiske nasal skrape biopsier og fagene kan vevsprøve flere ganger uten vesentlige bivirkninger. I tillegg er nesen inngangspunkt for luftveiene og derfor en av de første stedene å bli utsatt for noen form for luftbåren stressor, som for eksempel mikrober, forurensning, eller allergener.
Kort fortalt blir nasale epitelceller oppnådd fra frivillige mennesker utvidet på belagte vevskulturplater, og deretter overført til cellekulturinnsatser. Da nådde konfluens, cellene fortsette å bli dyrket ved luft-væske-grensesnittet (ALI), i flere uker, noe som skaper mer fysiologisk relevante betingelser. Den ALI kultur tilstand bruker definerte medier fører til en differensiert epitel som viser morfologiske og funksjonelle egenskaper som ligner på den menneskelige nasal epitel, med både ciliated og slim produserende celler. Tissue culture innsatser med differensierte nasale epitelceller kan manipuleres på en rekke måter, avhengig av de problemstillinger (behandling med farmakologiske midler, transduksjon med lentiviral vektorer, eksponering mot gasser, eller infeksjon med mikrobielle midler) og analysert for en rekke forskjellige sluttpunkter som strekker seg fra cellulære og molekylære stier, funksjonell lmanges, morfologi, etc.
In vitro modeller for differensierte menneskelige nese epitelceller vil gjøre det mulig etterforskerne å løse nye og viktige forskningsspørsmål ved hjelp av organotypic eksperimentelle modeller som i stor grad etterligne neseepitel in vivo.
Målet med teknikken
Epitelceller (ECS) i luftveiene er blant de første stedene å bli direkte utsatt for inhalert miljømessige stressfaktorer, som patogener, allergener eller luftforurensning. Egenkapitalbevis er mer enn en strukturell barriere: De fungerer som et sentralbord for å initiere og regulere luftimmunrespons 1-3 via utgivelsen av løselige meklere 4-6 og uttrykket av ligander / reseptorer på deres surfac 7-9. Mens foreviget cellelinjer kan brukes som modeller for å studere luftegenkapitalbevis in vitro, klarer de ikke å differensiere i heterogene celle populasjoner består av polarisert ciliated og slim produserende celler, i likhet med hva som er observert in vivo. For å rekapitulere viktige kjennetegn ved respiratorisk epitel observert in vivo, kan primærluftveisegenkapitalbevis benyttes. Derfor, målet vårt var å optimalisere vår metode å benytte nasal egenkapitalbevis (NEC) innhentet fra frivillige. De NEC skal utvides og dyrket in vitro, noe som gir en cellekultur modell av differensierte NEC som etterligner mange av funksjonene i neseepitel sett in vivo.
Rasjonale
Bruken av in vitro-modeller med humane primære EKB etterligne in vivo situasjon – slik det er beskrevet i denne studien – gir unike muligheter for å studere sykdomsspesifikke forskjeller av EKB, fysiologiske parametere forbundet med luftveiene epitel, eller interaksjonen mellom EKB-og andre celletyper, slik som dendrittiske cellen 10, naturlige drepeceller 11 eller makrofager. Flere eksisterende metoder utnytte bronkial egenkapitalbevis, som kan fås invasively via pensel biopsier under bronchoscopies, eller fra annet kasserte lungevev 12-17. I tillegg, kommersielle kilder for å få fullt differensierte menneskelige luftveis epitelial cellekulturer eksisterer (EpiAirway modell fra Mattek, Ashland, MA, Cloneticsfra Lonza, Basel, Sveits, MucilAir fra Epithelix Sars, Genève Sveits), hvor etterforskere kan velge fra ulike givere. Imidlertid, på grunn av den begrensede pool av kommersielt tilgjengelige epitelceller, begrenset eller foreskrevet sett av parametre, er kostnadene forbundet med kommersielt skaffe primære humane luftveier ECS, og den begrensede tilgang på kassert lungevev eller ferskt oppnådd human bronkial vevsprøver, forbyr mange forskere fra å gjennomføre studier i fullt differensierte menneskelige luftveisegenkapitalbevis. Derfor setter vi ut for å utvikle en teknikk som gjør en) utnytte ikke-invasiv innhentet menneskelige NEC, 2) gi en protokoll som gir kulturer av differensiert menneskelige luftveis epitel, og 3) kunne reproduseres i de fleste lab innstillinger med en eksisterende vev kultur infrastruktur.
Fordeler fremfor eksisterende teknikker / modeller
Innhenting av ferske NEC, sammenlignet med bronkial eller små luftveier EKB, er mye mindre invasiv, individuelles kan vevsprøve flere ganger uten vesentlige bivirkninger, og overfladiske nese skrape biopsier kan gjennomføres i syke populasjoner som ellers ikke ville kvalifisere for forskningsrelaterte bronchoscopies. Invasiv overfladiske skrape biopsier å få NEC skal tillate etterforsker for å sette donor spesifikasjonen a priori, inkludert alder, kjønn, sykdomsstatus, etc. i henhold til forskning mål å være dyktig. Dermed når du utformer forskningsstudier etterforskere er ikke begrenset av klinisk tilgjengelige vev / epitel prøven, kjøpe dyre differensierte cellekultur modeller fra kommersielle leverandører, eller design invasive bronkoskopi studier. I tillegg er lette å få tak i NEC øker evnen til å utføre eksperimenter på celler fra forskjellige donorer, noe som forbedrer statistisk validering av observerte resultater. Til slutt, er nesen en av de første stedene å bli utsatt for noen form for luftbåren stressfaktorer. Dermed genererer organotypic ivitro kultursystemer etterligne den nasale epitel er nyttige for å studere inhalering av virale partikler, forurensninger, allergener, eller gasser, som lett kan oppnås ved å bruke denne cellekultursystem.
Luftveisegenkapitalbevis gir ikke bare en fysisk barriere for å beskytte kroppen fra eksogene stimuli 20, men også fungere som et sentralbord for å initiere og regulere luftveisimmunforsvarsresponser 1-3 via sekresjon av løselige meglere eller direkte reseptor-ligand celle-celle interaksjoner. For ytterligere å studere rollen til ECS i immunresponsen, for å undersøke mulige forskjeller mellom ECS fra syke populasjoner, eller for å studere virkningene av eksogene belastninger på ECS, er det…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Lisa Dailey for nyttige innspill.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (ES013611 og HL095163), Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI), og Environmental Protection Agency (CR83346301) og erklærer ingen interessekonflikt. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health. Selv om forskningen er beskrevet i denne artikkelen har blitt finansiert delvis av US Environmental Protection Agency gjennom samarbeidsavtale CR83346301 med Center for Environmental Medicine, astma og lungesyke Biology ved University of North Carolina-Chapel Hill, det har ikke vært utsatt for den etatens nødvendig peer og politisk vurdering, og derfor ikke nødvendigvis gjenspeiler synspunktene til etaten, og ingen offisiell anbefaling skal kunne utledes. Nevn of varemerker eller kommersielle produkter innebærer ingen godkjennelse eller anbefaling til bruk. Loretta Müller er støttet av den sveitsiske National Science Foundation med en personlig stipend.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nasal speculum | Welch Allyn | Model 22009 | 9 mm, reusable polyproylene | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Operating otoscope | Welch Allyn | Model 21700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rhino probe cell cuvette | Arlington Scientific | SY-96-092 | bend the head of the cuvette a little more | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
12-well culture plates | Corning | 3512 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Transwell membrane cell culture inserts | Corning | 3460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture flask | Corning | 430639 and 430641 | T25 and T75 vented flask | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) | Gibco | 11875 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium | Cell applications | 511-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3170 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium Bicarbonate 7.5% solution | Gibco | 25080 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NuSerum | BD Biosciences | 355104 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BAMBANKER freezing media | BAMBANKER | 302-14681 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CoolCell | Biocision | HTBCS-136 | (CryoPrep alcohol-free cell freezing container) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PureCol | AdvancedBioMatrix | 5005-B | dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HBSS with Ca2 and Mg2+ | Gibco | 14025 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNAse 1 | Sigma | DN25 | Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red | Gibco | 25200-056 | Use at it is | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) | Sigma | T6522 | Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Retinoic acid | Sigma | R7632 | Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate | Gibco | 11995 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Pituitary Extract | Gibco | 13028-014 | Used for BEGM ALI media. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nystatin | Sigma | N4014-50 mg | Make up a solution of 3.3 mg/ml. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PneumaCult-ALI media | StemCell | 5001 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrocortisone | StemCell | 7904 | Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) | StemCell | 7980 | Use at it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Filter flasks (500 ml) | Corning | 431097 | 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Filter tubes (50 ml) | Millipore | SCGP00525 | Steriflip, 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Pipette tips – ART Barrier Tips | Molecular Bioproducts | 2139RI, 2069RI, 2179RI | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ddH2O, absolute ethanol, ice | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CO2 incubator | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
refrigerated centrifuge | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
biological safety cabinet | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gloves | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
lab coat with tight cuffs | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|