Summary
תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.
Abstract
חוט השדרה של דג הזברה הוא מודל חקירה יעיל למחקר מערכת עצבים מכמה סיבות. ראשית, יכולות להיות מנוצלים גנטי, מהונדס וגן גישות מציאה לבחון את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התפתחות מערכת עצבים. שנית, ציפורניים גדולות של עוברים מסונכרנים התפתחותית לספק גודל מדגם ניסוי גדול. שלישית, הבהירות האופטית של עובר דג הזברה מאפשרת לחוקרים לחזות אב, גליה, ואוכלוסיות נוירונים. למרות עוברי דג הזברה הם שקופים, עובי דגימה יכול לעכב להדמיה מיקרוסקופית יעילה. אחת סיבות לכך היא פיתוח טנדם של חוט השדרה ורקמות somite שמעליה. סיבה נוספת היא חלמון הכדור הגדול, שעדיין קיימות בתקופות של נוירוגנזה מוקדמת. במאמר זה, אנו מדגימים microdissection וההסרה של החלמון בעוברים קבועים, המאפשר להדמיה מיקרוסקופית, תוך שמירה על רקמות somite. אנו also להפגין הרכבת semipermanent של עוברי דג הזברה. זה מאפשר התבוננות בהתפתחות הנוירולוגית בצירי dorso-הגחון וקדמי, אחורי, כפי שהוא שומר על שלוש ממדי של הרקמה.
Introduction
ויזואליזציה של חוט השדרה בדג הזברה היא מעוכבת על ידי מספר הגורמים. בשל העובי של somites שמעליה והמיקום הפנימי של חוט השדרה, במרחק ניכר עבודה ארוכה נדרש לפתרון סלולארי גבוה. חלמון הכדור (שהוא עדיין נוכח במהלך הנוירוגנזה שלבים מוקדמים) מגדיל עוד יותר את מרחק העבודה הנדרש, והוא נפגע בקלות על ידי לחץ של coverslip. בנוסף, שאריות מחלמון פגום אוסרת להדמיה ברורה של רקמות. למרות חתכים בציר dorso-הגחון (DV) הם אפשריים, הם לא בקלות מתירים הדמיה סימולטני בציר קדמי, אחורי (AP) 1.
כדי להתגבר על המכשולים הללו, עוברים הם גזורים ורכובים על שקופיות. הליך זה מספק מספר יתרונות. ראשית, עוברי דג הזברה בקלות לשכב עם הצד לרוחב כלפי מעלה, המאפשר הדמיה ציר סוכנות הידיעות AP. שנית, הסרת Bal החלמוןl מקטין את מרחק העבודה הנדרש, ומגביל את הפסולת. שלישית, הליך התקנה זו מאפשר לשני ניאון ומיקרוסקופיה brightfield. רביעית, עוברים רכובים יציבים במשך חודשים על 4 מעלות צלזיוס, המאפשרים ויזואליזציה דגימה ממושכת. לבסוף, התקדמות של פיתוח מתרחשת בכי חלקים קדמי הם בוגרים יותר ממגזרים האחוריים. על מנת להבטיח כי מבוים hemisegments השדרה מתאים הם בהשוואה בין עוברים, רקמת somite שמעל משמשת כמדריך. לדוגמא, somite האחורית ביותר העשירית overlies hemisegment השדרה עשירית, שהוא שווה ערך מבחינה התפתחותית בעוברי בהתאמה במה. הליך הרכבה זו של עוברים ללא פגע מאפשר זיהוי קל של somites.
אנו משתמשים בגנטיקה ובטכנולוגיות לדפוק למטה גנטיות כדי ללמוד את המכניזם של הדרכה האקסון בחוט השדרה המתפתח. בפרט, אנו קובעים כי robo2, robo3, וDCC נדרשים לCommissural הראשי ASCEnding (COPA) pathfinding האקסון. באמצעות הליך ההרכבה המתואר כאן, היינו יכול לבחון את צמיחת הגחון, מעבר קו האמצע, רוחב השליך, גב ו2,3 צמיחה הקדמי. הליך הרכבה זה גם יכול להיות מיושם על DV או דפוסים AP של חוט השדרה. יש לנו להשתמש בהליך זה כדי לקבוע תפקידים שונים של effectors Wnt במורד הזרם בדפוסי DV של חוט השדרה. באמצעות הרכבה זו, היינו יכול להשיג ברזולוציה של סמני DV ברמת התא הבודד, ולקבוע משמרות דפוסים דקה כתוצאה של קבלת אות Wnt שינתה 4,5. הליך הרכבה זו מאפשר גם לחישוב מדד mitotic באמצעות אנטי phosphohistone 3 או תיוג BrdU (ריבוי אב) בידול 5.
Protocol
1. הרכבה עוברים (עם השלמת הטכניקה ויזואליזציה נבחרת, כגון Immunocytochemistry, הכלאה באתר, וכו ')
- הנח עוברים בצלחת פטרי מלא 35 מ"מ עם חיץ של בחירה (איור 1 א). הבחירה של חיץ מבוסס על הליך התיוג. בדרך כלל מאגרים מבוססי PBS מתאימים.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, ובאמצעות מלקחיים, לאבטח את הראש עם זוג מלקחיים אחד תוך משיכת החלמון משם עם הזוג האחר (איור 1). לחלופין, השתמש בסיכת חרקים בבעל סיכת חרקים למשוך בעדינות את החלמון.
- שימוש בפוקר העובר (חוט דיג (0.41 מ"מ קוטר) דבוק לאו צינור נימים או פיפטה פסטר) להעביר את העוברים לחלק מצלחת פטרי שאין לו הרבה פסולת חלמון (איורים 1C-D).
- בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, לשאוב את העוברים בנוזל קטן ככל האפשר, וגרמתיently פיפטה אותם על גבי שקופית (איור 1E).
- בעדינות פתיל משם נוזל עודף באמצעות מעבדה לנגב. יש להימנע ממגע עם עוברים.
- הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית לעוברים. לתוויות ניאון, השתמש מגיב antifade של בחירה. עבור אותות colorimetric, גליצרול 70% עשוי לשמש כמדיום גובר.
- שימוש בפוקר העובר, לכוון את העוברים על צדם בשורות (איור 1F).
- להוסיף אחד "טיפה" של וזלין או גריז ואקום גבוה לכל פינה של coverslip (איור 1G). זה מונע נזק של עובר מדחיסה מוגזמת.
- מניחים coverslip (צד וזלין למטה) על גבי עוברים (איור 1H).
- לטפוח בעדינות את coverslip בכל פינה עד שתקשורת ההרכבה (גליצרול 70% או מגיב הרכבה אנטי לדעוך) נוגע coverslip (איור 1H).
- אם יש צורך, להוסיף עוד מדיה הרכבה על ידי pipetting ממש ליד coverslip, באמצעות pipettor בטווח של 20-200 מיליליטר. זה יהיה פתיל תחת.
- באמצעות מעבדה לנגב, נקי לחלוטין סביב coverslip. להיות בטוח שלא תפעילו לחץ על coverslip, כפי שהדבר יפגע בעוברים. אזור זה חייב להיות יבש ואין לי וזלין או תקשורת גוברת עליו.
- למרוח לק על ציפורניים כדי לאטום מסביב לקצה של coverslip (איור 1I).
Representative Results
כאשר הבהרת המנגנונים העומדים בבסיס אירועים התפתחותיים שונים כגון דפוסים סלולריים, בידול, והאקסון הדרכה, חשוב להיות מסוגל לדמיין תאים בהקשר של הרקמות שלהם. פגמים דפוסים dorsoventral נוכחים בדרך כלל כשינוי הגחון או הגבי בתחום הביטוי של גורמי שעתוק בפאקס, nkx, או משפחות dbx 4. לעתים, שינויים יכולים להיות עדינים, הכוללים רק כמה קטרי תא 4. ניתוח חתך רוחב מאפשר סוג זה של ניתוח. עם זאת, חומרים כימיים עם אותות חלשים יותר, או חתכים שאינם בניצב לציר AP יכולים להגביל את הפרשנות. יתר על כן, ניתוח חתך רוחב לא לוקח בקלות בחשבון אם שינויים להתמיד בציר AP, ומסתמך על הזמינות של cryostat. מגבלה זו לעקיפה על ידי השקפות רוחביות של חוט השדרה. כפי שניתן לראות באיור 2 ב, nkx6.1 mRNA הוא דistributed בערך מחצית הגחון של חוט השדרה ב24 שעות לאחר הפריה (hpf), בתוך תחום האב. ובתאים וניתן להבחין מתאי הפוסט mitotic בשל נוכחותם של צלחת הרצפה, הנמצאת בחלק המדיאלי של חוט השדרה. צפו עם אופטיקה DIC, תאים בודדים הם להבחין בבירור, וגבול מוגדר בין ההבעה וnonexpressing תאים הוא מאליו.
יציאת מחזור תא אב מלווה בשינויים בביטוי גנים. לדוגמא, כל הנוירונים לאחר mitotic להביע HUC / D שניתן לזהות עם 1,5 immunocytochemistry. בדיקות ה-mRNA לאיון, gata, ומשפחות VSX לתייג תאי עצב לאחר mitotic הספציפי של עמדה עקבית ומספר בתוך כל hemisegment חוט השדרה 6. בנוסף, קולטני האקסון הדרכה כגון אלה במשפחה רובו באים לידי ביטוי באוכלוסיות מוגבלות של נוירונים postmitotic (איור 2 ג)
ב24 hpf, האקסונים של הנוירונים postmitotic הבאים יכולים להיות דמיינו עם שיטות שונות, וניתן להבחין ברמת התא הבודד: הגבי לרוחב עולה (דולה), Commissural הראשוני עולה (COPA), Commissural המשני עולה (קוזה), הגחון אורכית יורד (ולד), קולמר-Agdur (KA), Commissural מתפצל / אורך (קלח / ל '), עולה היקפי (ה-CIA), היקפי יורד (CID), וחד קוטבי Commissural יורד (UCoD), Rohon-בירד (RB), motoneurons ( ז) 9. אקסונים להאריך מהנוירונים האלה בגב, הגחון, קדמי ואחוריים כיוונים. הם סניף, לחצות את קו האמצע, וצאו משני הגביוחוט השדרה הגחון. כאשר מצמידים עם מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, התנהגויות סלולריות מגוונות אלה אנחנו רואים בעוברים רכובים רוחבי, באמצעות immunocytochemistry וחלבונים ניאון מקודדים גנטי כגון GFP 2. באיור 2 ד, immunocytochemistry ZnP-1 שימש תווית motoneurons המתפתח. Motoneurons לצאת מחוט השדרה ventrally למעצבב את שרירי פיתוח שמסביב.
איור 1. נתיחה ולרוחב הר של עוברי דג הזברה. () לאחר העיבוד לimmunofluorescence, הכלאה באתר, וכו ', עובר ממוקמים בצלחת פטרי מלאה 35 מ"מ עם PBT (PBS עם 0.5% טריטון X-100) או PTW (PBS עם 20-Tween 0.1%). החלמוןהכדור (י.ב.) בא לידי ביטוי. (ב) החלמון הוסר על ידי הבטחת ראשו של העובר ואחרי נתיחה זהירה. (C) פוקר עובר (חוט דיג דבוק לפיפטה פסטר) משמש לעוברים נפרדים ופסולת חלמון (ד '). עוברים ניקו הם pipetted לשקופית מיקרוסקופ (E) ומיושר (F). הריבה (G) נפט מוחלת על הפינות של coverslip. (H) coverslip ממוקם בעדינות על גבי העוברים בהרכבה בינונית. לק (אני) משמש כדי לאטום את הקצוות של coverslip. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
< strong> איור 2. אנליזה של דפוסי ביטוי גנים והאקסון pathfinding ברוחבית רכוב עוברי דג הזברה. () ציור של עובר דג הזברה ב24 hpf. בBD, בערך ארבעה hemisegments מעל הרחבה שק החלמון הם דמיינו (אזור בארגזים). (ב) nkx6.1 מתבטא בחוט השדרה הגחון, כולל צלחת הרצפה (FP). robo3 (C) מתבטא בתאי עצב postmitotic (PMN). אזור צלחת הרצפה ואב הוא לא בא לידי ביטוי במישור מוקד לרוחב יותר זה. בB, C, בעמוד השדרה מתוחם על ידי סוגר בצד שמאל של התמונה. (ד) מיקרוסקופ Confocal שימש לimmunofluorescence תמונת ZnP-1, אשר תוויות אקסונים מנוע יציאה מחוט השדרה ventrally. בכל התמונות, קדמי הוא בצד השמאל ועל הגב הוא עד. מרחק עבודה ארוך 40X, עדשת טבילה במים (NA 0.8) שימשה (3.3 מ"מ).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
הרכבה לרוחב של הדמיה עזרי עוברי דג הזברה קבועה של התפתחות חוט השדרה. באמצעות הסרת חלמון הכדור, מרחק העבודה דרוש להדמיה מיקרוסקופית חריגה מצטמצם. תוצאות הנציג שלנו היו מוגבלות לבמה 24 hpf, לעומת זאת, טכניקה זו יכולה לשמש כתחילה כ18 hpf, אם כי העוברים קודם לכן קשים יותר לנתח בשל גודלו של העובר ואת השבריריות של הרקמה. טכניקה זו היא גם החלים על עוברים מבוגרים מ24 hpf. בעזרת הבהירות האופטית של דג הזברה העוברית, היכולת לבצע מסכי גנטיים קדימה, אחורה גנטיקה, וגישות מהונדסים, כמה תהליכים התפתחותיים עשויים להיחקר. זה כולל מדדי mitotic של אבות עצביים עם סמנים כמו BrdU ואנטי phospho-היסטון 4-6 מרס ודפוסים דרך ביטוי של סמני אב עצביים וגליה בפאקס, nkx, dbx, וFamilie olig1,4-6 ים. ריאגנטים שידווחו נחישות גליה ועצבית (כגון חלבון גליה חומצת fibrillary (GFAP) וHUC / D) 1,4,5,10 ניתן להשתמש. בידול תת עצבי ניתן לנתח דרך ביטוי של איון, VSX, engrailed, וגני gata 1,4-6. ולבסוף, ניתוח של האקסון הדרכה אפשרי באמצעות נוגדנים כגון אנטי טובולין acetylated, 3A10, וZnP-1 2,11,12. למרות שמערכות מודל חוליות אחרות (עכבר וחומוס) משמשים ללמוד פיתוח חוט השדרה, הצפייה בו זמנית היתרי דג הזברה היחידה של כל הצירים התפתחותיים בעובר ללא פגע.
המגבלה הברורה לגישה זו היא כי העוברים קבועים, המונעת הדמיה לחיות. למעשה, הסרת (או לניזק) תוצאות החלמון במוות עוברי מהיר, ולכן זה לא ניתן להקטין את מרחק העבודה בעוברים חיים באמצעות טכניקה זו. עם זאת, שיתוף השדרה ההגדלה גבוההההדמיה rd בעוברי חיה אפשרית. על מנת לשמר את החלמון במהלך הדמיה חיות, ניתן להציב עוברים בשקופיות דיכאון, המספקים מרחב גדול יותר בין הדגימה וcoverslip. לחלופין, יכול להיות דבוק כמה coverslips x 22 מ"מ 22 מ"מ משני השקופיות של 3 x 1 בשקופיות מיקרוסקופיות. Coverslips לשמש "גשר" לcoverslip שמעליה. אם עוברים הם בנים יותר מ 18 hpf, tricaine משמשת כדי להרדים עוברים כדי למנוע תנועה. אמנם מרחק עבודה של 0.288 מ"מ נדרש לעוברי deyolked ב24 hpf, כאשר עובדים עם עוברים חיים המשובצים בagarose, עם חלמונים שלמים, עדשה מיקרוסקופית עם מרחק עבודה של 3.3 מ"מ מספיקה. לחלופין, תרבויות explant מקורם בעוברי deyolked ניתן דמיינו באמצעות טכניקת קיבוע קריש פלזמה 13. ניתן לצפות אוכלוסיות שונות של תאים באמצעות חלבוני ניאון מקודדים גנטי כגון GFP, mCherry, או photoconצבע vertible קאאד (עד כמה שם). יתר על כן, תאים שכותרתו fluorescently בתוך עובר chimeric ניתן לראות גם בגישה זו 14.
טכניקת הרכבה עולה בקנה אחד שהיא יציב במשך חודשים היא כלי חיוני עבור ביולוגים התפתחותיים ותא. טכניקה פשוטה זו היא לשחזור, ומאפשרת השוואה קלה בין ניסויים ניסויים שונים. יתר על כן, את היישור של עוברים בשורות בקלות מאפשר זיהוי של עוברים ספציפיים לניתוח מאוחר יותר.
Disclosures
אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים גם עבור מחבר.
Acknowledgments
סקידמור הפקולטה הפיתוח גרנט מימן את ההכנה ופרסום של כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dishes 35 mm x 10 mm |
VWR | 25373-041 |
|
| Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific | NC9839169 |
|
| Cover glass |
Fisher Scientific | 12-541-B22X22-1.5 |
|
| Slides |
Fisher Scientific | 12-550-343 |
|
| SlowFade Gold |
Fisher Scientific | S36936 |
|
| ProLong Gold |
Life Technologies | P36934 |
|
| Petroleum Jelly |
any grocery store |
|
|
| Loop Holders |
VWR | 80094-482 |
|
| Insect Pins |
Fine Science Tools | 26002-10 |
|
| Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools | 26016-12
|
|
Olympus Stereomicroscope |
Olympus | SZ61 |
References
- Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal. Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).
- Bonner, J., et al. Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons. Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).
- Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. Zebrafish. , In Press. (2012).
- Bonner, J., et al. Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling. Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).
- Gribble, S. L., et al. Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression. Development. 136 (5), 781-789 (2009).
- England, S., et al. Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons. Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).
- Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish. Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).
- Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell. 221 (2), 216-230 (2001).
- Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons. Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).
- Kim, H., et al. Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos. Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- de Soysa, T. Y., et al. Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis. BMC Biol. 10 (40), (2012).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).
- Deschene, E. R., Barresi, M. J. Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (31), (2009).
