Summary
Udviklingsmæssige processer, såsom spredning, mønster, differentiering og Axon vejledning kan let modelleres i zebrafisk rygmarven. I denne artikel beskriver vi et monterings procedure for zebrafisk embryoner, der optimerer visualiseringen af disse begivenheder.
Abstract
Zebrafisk rygmarven er en effektiv undersøgende model for nervesystemet forskningen af flere grunde. For det første kan genetiske, transgene og gen knockdown tilgange udnyttes til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger nervesystem udvikling. For det andet, store kløer udviklingshæmmede synkroniserede embryoner giver store eksperimentelle stikprøvestørrelser. For det tredje, den optiske klarhed af zebrafisk foster tillader forskerne at visualisere stamfader, glial og neuronale populationer. Selvom zebrafisk embryoner er gennemsigtige, kan prøven tykkelse hæmme den effektive mikroskopisk visualisering. En årsag til dette er tandem udviklingen af rygmarven og overliggende somit væv. En anden årsag er den store æggeblomme bolden, som stadig er til stede i perioder med tidlig neurogenese. I denne artikel vil vi demonstrere mikrodissektion og fjernelse af blommen i faste embryoner, der tillader mikroskopisk visualisering samtidig bevare omgivende somite væv. Vi also demonstrere halvpermanent montering af zebrafisk embryoner. Dette tillader observation af nervesystemets i dorso-ventrale og anterior-posterior akser, da den bevarer tredimensionalitet af vævet.
Introduction
Visualisering af rygmarven i zebrafisk inhiberes af en række faktorer. På grund af tykkelsen af de overliggende somitter og den interne placering af rygmarven, er et betydeligt lang arbejdsdag afstand der kræves for høj cellulær opløsning. Blommesækken kugle (som stadig er til stede i de tidlige stadier af neurogenese) øger yderligere arbejdsafstanden kræves, og er let beskadiget af pres fra et dækglas. Desuden snavs fra beskadigede æggeblomme forbyder klar visualisering af væv. Selv er mulige tværsnit i dorso-ventral (DV)-akse, behøver de ikke umiddelbart tillade samtidig visualisering i anterior-posterior (AP) akse 1.
For at overvinde disse forhindringer, er embryoner dissekeres og monteret på dias. Denne procedure giver flere fordele. Først zebrafisk embryoner let ligge med den laterale side opad, hvilket letter AP akse visualisering. For det andet fjernelse af blommen ball nedsætter den krævede arbejdstid afstand, og begrænser snavs. Tredje denne montering procedure giver mulighed for både fluorescerende og lysfeltmikroskopi. For det fjerde, monterede embryoner er stabile i måneder ved 4 ° C, hvilket giver forlænget eksemplar visualisering. Endelig forekommer progression af udvikling på forreste segmenter er mere modne end bageste segmenter. For at sikre, at iscenesatte matchede spinal hemisegments sammenlignes mellem embryoner, der er overliggende somite væv, der anvendes som en vejledning. For eksempel tiende mest posteriore somite overlejrer den tiende spinal hemisegment, som er udviklingsmæssigt ækvivalent i fase-matchede embryoner. Denne montage procedure af intakte embryoner gør det nemt at identificere somitter.
Vi bruger genetik og gen knock-down teknologier til at studere mekanismerne i Axon vejledning i udviklingslandene rygmarven. Især har vi fastslået, at der er behov robo2, robo3 og DCC til kommissurale Primær ASCEnde (COPA) Axon stifinding. Brug af montage her beskrevne procedure, var vi i stand til at undersøge ventrale vækst, midterlinjen passage, commissure bredde, bryst og forreste vækst på 2,3. Denne montering procedure kan også anvendes til DV eller AP mønsterdannelse af rygmarven. Vi har brugt denne fremgangsmåde til at bestemme forskellige roller downstream Wnt effektorer i DV mønstret af rygmarven. Ved hjælp af denne montering, var vi i stand til at opnå opløsning på DV markører på enkelt celle niveau, og bestemme minut mønstergivende forskydninger som følge af ændret Wnt signalmodtagelse 4,5. Denne montage fremgangsmåde giver også mulighed for mitotisk indeks beregning gennem anti-phosphohistone 3 eller BrdU mærkning (stamfader proliferation) differentiering 5..
Protocol
1.. Montering Embryoner (Efter supplering af udvalgte Visualisering Teknik, såsom immunhistokemi, in situ hybridisering etc.)
- Placer embryoner i en 35 mm petriskål fyldt med buffer af valg (Figur 1A). Valget af puffer baseret på proceduren mærkning. Typisk PBS-baserede puffere er egnede.
- Under et dissektionsmikroskop, og ved hjælp af pincet, sikre hovedet med en tang, mens du trækker blommen væk med det andet par (Figur 1B). Alternativt kan du bruge et insekt pin i et insekt pin holder til forsigtigt at trække væk æggeblomme.
- Brug af embryo poker (fiskesnøre (diameter 0,41 mm) limet til enten en kapillarrør eller en Pasteur-pipette) flytte embryoner til en del af petriskålen, der ikke har en masse af æggeblomme vragrester (figur 1C-D).
- Ved hjælp af et glas Pasteur-pipette, opsug embryoner i så lidt væske som muligt, og gladende pipette dem på et dias (Figur 1E).
- Væge forsigtigt overskydende væske ved hjælp af et laboratorium serviet. Undgå kontakt med embryoner.
- Tilsæt en dråbe montering medium fostre. For fluorescensmarkører bruge et antiblegemiddel reagens valg. Til kolorimetriske signaler, kan 70% glycerol anvendes som et monteringsmedium.
- Ved hjælp af embryo poker, orientere embryoner på deres sider i rækker (Figur 1F).
- Tilføj en "DAB" vaseline eller høj vakuum fedt på hvert hjørne af et dækglas (figur 1G). Dette forhindrer beskadigelse af embryo fra overdreven komprimering.
- Placer dækglas (vaseline side nedad) på toppen af embryoner (fig. 1 H).
- Bank forsigtigt på dækglasset på hvert hjørne, indtil montering medier (70% glycerol eller anti-fade montering reagens) rører dækglasset (fig. 1 H).
- Hvis det er nødvendigt, tilføje mere montering medier ved pipettering lige ved siden af coverslip ved hjælp af en pipette i området 20-200 ml. Det vil væge under.
- Ved hjælp af et laboratorium tørre, helt ren omkring dækglasset. Vær sikker på ikke at lægge pres på dækglasset, da det vil beskadige embryoner. Dette område skal være tørt og har ingen vaseline eller montering medier på det.
- Brug neglelak til at tætne omkring kanten af dækglasset (Figur 1I).
Representative Results
Ved at belyse de mekanismer, der ligger til grund for forskellige udviklingsmæssige begivenheder såsom cellulær mønster, differentiering og Axon vejledning, er det vigtigt at være i stand til at visualisere celler inden for rammerne af deres væv. Dorsoventral patterning defekter typisk er til stede som en ventral eller dorsal skift i udtrykket domæne af transkriptionsfaktorer i pax, NKX eller dbx Familier 4. Til tider kan ændringer være hårfin, bestående af kun et par cellediametre 4. Tværsnit analyse tillader denne form for analyse. Reagenser med svagere signaler, eller tværsnit, der ikke er vinkelret på AP-aksen, kan dog begrænse fortolkning. Endvidere betyder tværsnit analyse ikke umiddelbart tager hensyn til, om ændringer forbliver i AP-aksen, og er afhængig af tilgængeligheden af en kryostat. Denne begrænsning omgås ved laterale udsigt rygmarven. Som det ses i figur 2B nkx6.1 mRNA distributed i nogenlunde ventrale halvdel af rygmarven ved 24 timer efter befrugtning (HPF) inden stamfader domæne. Progenitorceller kan skelnes fra post mitotiske celler på grund af tilstedeværelsen af gulvplade, som findes i den mediale del af rygmarven. Set med DIC optik, er de enkelte celler klart adskiller og en defineret grænse mellem at udtrykke og nonexpressing celler er indlysende.
Progenitorcelle cyklus exit ledsages af ændringer i genekspression. For eksempel er alle post-mitotiske neuroner udtrykker HUC / D, som kan påvises med immuncytokemi 1,5. mRNA prober til holmen, gata, og VSX familier mærke specifikke post-mitotiske neuroner i konsekvent holdning og antal inden for hver rygmarv hemisegment 6. Desuden er Axon vejledning receptorer, såsom dem, robo familien udtrykkes i begrænsede populationer af postmitotiske neuroner (figur 2C)
På 24 HPF kan axoner fra følgende postmitotiske neuroner visualiseres med forskellige metoder, og kan skelnes på enkelt celle niveau: Dorsal Lateral Ascending (Dola) kommissurale Primary Ascending (COPA), kommissurale Sekundær Ascending (Cosa), bug Longitudinal Faldende (Veld), Kolmer-Agdur (KA), kommissurale bifurcating / Longitudinal (COB / L), Periferihastighed Stigende (CIA), Periferihastighed Faldende (CIU), og Unipolær kommissurale Faldende (UCoD), Rohon-Beard (RB), motoneurons ( M) 9.. Axoner strækker sig fra disse neuroner i ryg, bug, forreste og bageste retninger. De gren, krydse midterlinjen og afslutte både dorsaleog ventrale rygmarv. Når kombineret med konfokal laser scanning mikroskopi, disse forskellige cellulære adfærd er tydelig i lateralt monterede embryoner hjælp immunocytokemi og genetisk indkodede fluorescerende proteiner, såsom GFP 2. I figur 2D blev znp-1 immuncytokemi anvendes til at mærke udviklingslandene motorneuroner. Motoneuroner forlade rygmarven ventralt innerverer omgivende udvikle muskulatur.
Figur 1. Dissektion og laterale mount af zebrafisk embryoner. (A) Efter behandling til immunfluorescens in situ hybridisering, osv., embryoer anbragt i en 35 mm petriskål fyldes med PBT (PBS med 0,5% Triton X-100) eller PTW (PBS med 0,1% Tween-20). Blommesækkenbold (YB) er indlysende. (B) Blommen fjernes ved at sikre lederen af embryo efterfulgt af omhyggelig dissektion. (C) Et embryo poker (fiskesnøre limet til en Pasteur-pipette) anvendes til at adskille embryoner og æggeblomme rester (D). Rensede embryoer pipetteres på et objektglas (E) og tilpasset (F). (G) Vaseline anvendes til hjørner af dækglasset. (H) Dækglasset placeres forsigtigt på toppen af embryoner i montage medium. (I) Neglelak bruges til at forsegle kanterne af dækglasset. Klik her for at se større billede .
< strong> Figur 2.. Analyse af genekspression mønstre og axon stifinding i sideværts monteret zebrafisk embryoner. (A) Tegning af en zebrafisk foster ved 24 HPF. I BD, er rundt regnet fire hemisegments over blommesækken forlængelse visualiseres (boxed område). (B) nkx6.1 er udtrykt i den ventrale rygmarv, herunder bundpladen (FP). (C) robo3 udtrykkes i postmitotiske neuroner (PMN). Gulvet plade og stamfader zone er ikke tydeligt i dette mere lateral fokalplan. I B, C, rygmarven er afgrænset af et beslag på den venstre side af billedet. (D) Konfokal mikroskopi blev anvendt til at billedet znp-1 immunfluorescens, hvilke etiketter motoriske axoner forlader rygmarven ventralt. I alle billederne, anterior er til venstre og ryg er op. En 40X lang arbejdsafstand blev nedsænkning i vand (NA 0,8) anvendte objektiv (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.
Discussion
Lateral montering af fast zebrafisk embryoner hjælpemidler visualisering af rygmarven udvikling. Gennem fjernelse af blommen bold, bliver arbejdsmiljøet afstand kræves for ekstraordinære mikroskopiske billeddannelse reduceret. Vores repræsentative resultater var begrænset til 24 HPF fase, dog kan denne teknik anvendes så tidligt som 18 HPF, selvom tidligere embryoer er vanskeligere at dissekere på grund af størrelsen af embryoet og skrøbelighed af vævet. Denne teknik er også gældende for embryoner ældre end 24 HPF. Ved hjælp af den optiske klarhed af den embryoniske zebrafisk, evnen til at udføre frem genetiske skærme, reverse genetik og transgene metoder kan flere udviklingsprocesser undersøges. Dette omfatter mitotiske indeks for neuronale forfædre med markører som BrdU og anti-fosfor histon marts 4-06 og mønster gennem udtryk af neuronale og gliale progenitor markører i pax, NKX, dbx, og olig Families 1,4-6. Reagenser, der indberetter glia og neuronal bestemmelse (såsom gliafibrillært syre protein (BiH) og HUC / D) 1,4,5,10 kan anvendes. Neuronal subtype differentiering kan analyseres gennem udtryk for holm, VSX, engrailed og gata gener 1,4-6. Og endelig analyse af axon vejledning er muligt gennem antistoffer, såsom anti-acetyleret tubulin, 3A10, og znp-1 2,11,12. Selvom andre hvirveldyr modelsystemer (mus og kylling) anvendes til at studere rygmarv udvikling kun zebrafisk tillader samtidig visning af alle udviklingsmæssige akser i intakte foster.
Den indlysende begrænsning til denne tilgang er, at embryonerne er faste, som udelukker direkte billedvisning. Faktisk fjernelse af (eller beskadigelse) æggeblomme resulterer i hurtig fosterdød, hvorfor det ikke er muligt at reducere distancen i levende embryoer ved hjælp af denne teknik. Men høj forstørrelse spinal cord billeddannelse i levende fostre er mulig. For at bevare blommen under live billedbehandling kan embryoer placeres i depression dias, som giver et større mellemrum mellem prøven og dækglasset. Alternativt kan flere 22 mm x 22 mm dækglas limes på enten slide af en 3 i x 1 i mikroskopiske dias. Dækglassene tjene som en "bro" til overliggende dækglas. Hvis embryoner er ældre end 18 HPF er tricaine bruges til at bedøve embryoner at forhindre bevægelse. Mens en arbejdsgruppe afstand på 0.288 mm er nødvendig for deyolked embryoner ved 24 HPF, når man arbejder med levende fostre indlejret i agarose, med intakte æggeblommer, en mikroskopisk linse med en arbejdsgruppe afstand på 3,3 mm er tilstrækkelig. Alternativt kan eksplantatkulturer stammer fra deyolked embryoner visualiseres ved hjælp af et plasma blodprop immobilisering teknik 13.. Forskellige populationer af celler kan observeres ved anvendelse af genetisk indkodede fluorescerende proteiner, såsom GFP, mCherry eller photoconkonvertible farvestof Kaede (for at nævne nogle få). Endvidere kan fluorescens-mærkede celler i kimære embryoner også ses med denne tilgang 14.
En konsekvent montage teknik, der er stabilt i flere måneder er et kritisk værktøj til udviklings-og cellebiologer. Denne enkle teknik er reproducerbar, hvilket giver nem sammenligning mellem forskellige eksperimentelle forsøg. Desuden tilpasningen af embryoner i rækkerne umiddelbart muliggør identifikation af specifikke embryoner til senere analyse.
Disclosures
Ingen konkurrerende økonomiske interesser eksisterer enten forfatter.
Acknowledgments
Skidmore Faculty Development Grant finansieret udarbejdelse og offentliggørelse af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dishes 35 mm x 10 mm |
VWR | 25373-041 |
|
| Dumont Forceps #3 |
Fisher Scientific | NC9839169 |
|
| Cover glass |
Fisher Scientific | 12-541-B22X22-1.5 |
|
| Slides |
Fisher Scientific | 12-550-343 |
|
| SlowFade Gold |
Fisher Scientific | S36936 |
|
| ProLong Gold |
Life Technologies | P36934 |
|
| Petroleum Jelly |
any grocery store |
|
|
| Loop Holders |
VWR | 80094-482 |
|
| Insect Pins |
Fine Science Tools | 26002-10 |
|
| Nickel Plated Pin Holders |
Fine Science Tools | 26016-12
|
|
Olympus Stereomicroscope |
Olympus | SZ61 |
References
- Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal. Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).
- Bonner, J., et al. Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons. Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).
- Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. Zebrafish. , In Press. (2012).
- Bonner, J., et al. Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling. Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).
- Gribble, S. L., et al. Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression. Development. 136 (5), 781-789 (2009).
- England, S., et al. Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons. Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).
- Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish. Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).
- Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell. 221 (2), 216-230 (2001).
- Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons. Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).
- Kim, H., et al. Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos. Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- de Soysa, T. Y., et al. Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis. BMC Biol. 10 (40), (2012).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).
- Deschene, E. R., Barresi, M. J. Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation. J. Vis. Exp. (31), (2009).
