Disseksjon og Lateral Montering av sebrafisk embryo: Analyse av ryggmargs Development

Summary

Utviklingsprosesser som spredning, mønster, differensiering, og axon veiledning kan lett modellert i sebrafisk ryggmargen. I denne artikkelen beskriver vi en monteringsprosedyre for sebrafisk embryo, som optimaliserer visualisering av disse hendelsene.

Abstract

Den sebrafisk ryggmargen er en effektiv unders modell for nervesystemet undersøkelser av flere grunner. For det første kan genetisk, transgene og genet knockdown tilnærminger benyttes for å undersøke de molekylære mekanismer som ligger til grunn nervesystemet utvikling. For det andre, store klørne til utviklingshemmede synkronisert embryoer gir store eksperimentelle utvalgsstørrelser. Tredje, den optiske klarhet i sebrafisk embryo tillater forskere å visualisere stamfar, glial, og nevronale populasjoner. Selv om sebrafisk embryo er gjennomsiktige, kan prøven tykkelse hindre effektiv mikroskopisk visualisering. En årsak til dette er den tandem utvikling av ryggmargen og liggende somitt vev. En annen grunn er den store eggeplomme ball, som fortsatt er til stede i perioder med tidlig neurogenesis. I denne artikkelen viser vi microdissection og fjerning av eggeplomme i faste embryoer, som tillater mikroskopisk visualisering samtidig bevare rundt somitt vev. Vi also demonstrere semipermanent montering av embryoer sebrafisk. Dette tillater observasjon av neurodevelopment i dorso-ventrale og anterior-posterior akser, som det bevarer tredimensjonalitet av vevet.

Introduction

Visualisering av ryggmargen i sebrafisk hemmes av en rekke faktorer. På grunn av tykkelsen av de overliggende somites og den indre beliggenheten av ryggmargen, er en betraktelig lang arbeidsavstand som kreves for høy cellulær oppløsning. Plomme ball (som fortsatt er til stede under tidlige stadier av neurogenesis) ytterligere øker arbeidsavstanden som kreves, og blir lett skadet etter press fra et dekkglass. I tillegg, rusk fra skadede plomme forbyr klar visualisering av vev. Selv om tverrsnitt i dorso-ventral (DV) aksen er mulig, har de ikke lett tillate samtidig visualisering i anterior-posterior (AP) aksen ^en.

For å overvinne disse hindringene, er embryoer dissekert og montert på lysbilder. Denne fremgangsmåten gir flere fordeler. Først, sebrafisk embryo lett ligge med den laterale siden vendt oppover, noe som letter AP aksen visualisering. For det andre, fjerning av plomme ball reduserer den nødvendige arbeidsavstand, og begrenser rusk. Tredje, gir dette monteringsprosedyre for både fluorescerende og lysfelt mikroskopi. Fjerde, montert embryoer er stabil i flere måneder ved 4 ° C, slik at langvarig prøven visualisering. Endelig forekommer progresjon av utviklingen ved at fremre segmenter er mer modne enn bakre segmenter. For å sikre at iscenesatt matchet spinal hemisegments sammenlignes mellom embryoer, er liggende somitt vev som brukes som en veiledning. For eksempel ligger over den tiende mest posterior somitt den tiende spinal hemisegment, som er utviklingsmessig tilsvarende i scene-matchet embryoer. Denne monteringsmåten av intakte fostre gir enkel identifisering av somites.

Vi bruker genetikk og gen knock-down teknologier for å studere mekanismene for axon veiledning i utviklingsryggmargen. Spesielt har vi fastslått at robo2, robo3 og DCC er nødvendig for commissural Primær ascending (COPA) axon pathfinding. Bruke påsettingsprosedyren beskrevet her, var vi i stand til å undersøke ventral vekst, midtlinjen krysset, commissure bredde, rygg-og anterior vekst ^2,3. Denne monteringsmåten kan også anvendes på DV-eller AP mønster av ryggmargen. Vi har brukt denne fremgangsmåten for å finne ut ulike roller nedstrøms Wnt effektorer i DV fordelingen av ryggmargen. Ved hjelp av denne montering, var vi i stand til å oppnå en løsning på DV-markører på celle-nivå, og bestemme minutt mønster skift som følge av endrede Wnt signalmottak ^4,5. Denne monteringsmåten gir også mulighet for mitotiske indeksen beregningen gjennom anti-phosphohistone tre eller BrdU merking (stamfar spredning) differensiering ^fem.

Protocol

En. Montering embryo (ved gjennomføring av Selected Visualisering Technique, som Immunocytochemistry, in situ hybridisering, etc.)

1. Plasser embryo i en 35 mm petriskål fylt med buffer av valg (figur 1A). Valget av buffer er basert på merkningsmetode. Vanligvis PBS-basert buffere er egnet.
2. Under en dissekere mikroskop, og ved hjelp av tang, sikre hodet med en pinsett mens du trekker plommen unna med det andre paret (Figur 1B). Alternativt kan du bruke et insekt pin i et insekt pin holder å dra forsiktig bort plommen.
3. Ved hjelp av embryoet poker (fiskesnøre (0,41 mm diameter) festet til enten et kapillarrør eller en Pasteur-pipette) beveger embryoene som en del av petriskålen som ikke har mye plomme rusk (figurene 1C-D).
4. Ved hjelp av et glass Pasteur pipette, aspirer embryoene i så lite væske som mulig, og gently pipettere dem inn på et lysbilde (figur 1E).
5. Forsiktig veken vekk overflødig væske ved hjelp av et laboratorium tørk. Unngå kontakt med embryoer.
6. Tilsett en dråpe av monteringsmedium til embryoer. For fluorescerende etiketter, bruke en antifade reagens av valget. For kolorimetriske signaler, kan 70% glyserol anvendes som et monteringsmedium.
7. Bruk av embryo poker, orientere embryoene på sine sider i rader (Figur 1F).
8. Legg en "skvett" med vaselin eller høyt vakuum fett til hvert hjørne av et dekkglass (figur 1G). Dette forhindrer skade av embryo fra overdreven komprimering.
9. Plasser dekkglass (vaselin side ned) på toppen av embryoer (Figur 1H).
10. Forsiktig på dekkglass på hvert hjørne før montering media (70% glyserol eller anti-fade montering reagens) berører dekkglass (figur 1H).
11. Tilsett om nødvendig mer montering media ved å pipettere rett ved siden av coverslip, ved hjelp av en pipette i området fra 20 til 200 ml. Det vil veke etter.
12. Ved hjelp av et laboratorium tørk, helt rent rundt dekkglass. Vær sikker på å ikke legge trykk på dekkglass, da dette vil skade fostre. Dette området må være tørre og har ingen vaselin eller montering media på det.
13. Bruk neglelakk for å forsegle rundt kanten av dekkglasset (Figur 1I).

Representative Results

Når belyse mekanismene som ligger til grunn for ulike utviklings arrangementer som cellular mønster, differensiering, og axon veiledning, er det viktig å være i stand til å visualisere celler innenfor rammen av deres vev. Dorsoventral mønster defekter typisk stede som en ventral eller rygg skift i uttrykket domenet av transkripsjonsfaktorer i pax, nkx, eller dbx familier ^fire. Til tider kan endringer være subtile, bestående av bare noen få celle diameter ^4. Tverrsnitt-analyse tillater denne type analyse. Imidlertid kan reagenser med svakere signaler, eller tverrsnitt som ikke er vinkelrett på AP aksen begrense tolkning. Videre betyr tverrsnittsanalyse ikke lett ta hensyn til om endringene vedvarer i AP-aksen, og er avhengig av tilgjengeligheten av en kryostat. Denne begrensningen er omgått ved sidevisninger i ryggmargen. Som vist i figur 2B, er nkx6.1 mRNA distributed i omtrent ventral halvparten av ryggmargen på 24 timers post-fertilisering (HPF), innenfor stamfar domenet. Stamceller kan skjelnes fra stolpen mitotiske celler på grunn av tilstedeværelsen av gulvplaten, som er funnet i den mediale del av ryggmargen. Sett med DIC optikk, individuelle celler skiller seg klart, og en definert grense mellom å uttrykke og nonexpressing celler er tydelig.

Stamcellesyklus utgang er ledsaget av endringer i genekspresjon. For eksempel, alle post-mitotiske nevroner uttrykke HUC / D som er synlig med immunocytochemistry ^1,5. mRNA prober for holme, gata, og VSX familier merke spesifikke post-mitotiske nevroner av konsekvent posisjon og nummer innenfor hver ryggmarg hemisegment ^seks. I tillegg er axon lede reseptorer slik som de i robo familien uttrykt i begrensede populasjoner av postmitotic neuroner (figur 2C) 4-6.

På 24 HPF, kan axons av følgende postmitotic nevroner bli visualisert med ulike metoder, og er gjenkjennelig på celle-nivå: Dorsal Lateral Stigende (Døla), commissural Primary Stigende (COPA), commissural Sekundær Stigende (Cosa), ventral Langsgående Synkende (Veld), Kolmer-Agdur (KA), commissural bifurcating / Langsgående (COB / L), Omkrets Stigende (CiA), Omkrets Synkende (CID) og unipolar commissural Synkende (UCoD), Rohon-Beard (RB), motoneurons ( M) ^9. Axoner strekker seg fra disse nevronene i rygg, ventral, anterior og posterior retninger. De gren, krysser midtlinjen, og gå ut av både ryggog ventral ryggmargen. Når dette kombineres med konfokal laser scanning mikroskopi, disse varierte cellulære atferd er tydelig i sideveis montert embryoer, bruker immunocytochemistry og genetisk kodet fluorescerende proteiner som GFP ^to. I figur 2D, ble znp-en immunocytochemistry brukes til å merke utviklings motoneurons. Motoneurons ut av ryggmargen ventrally å innerverer den omkringliggende utvikle muskulaturen.

Figur 1. Disseksjon og lateral montering av sebrafisk embryoer. (A) Etter behandling for immunfluorescens, in situ hybridisering, etc., blir embryoene plassert i en 35 mm petriskål fylt med PBT (PBS med 0,5% Triton X-100) eller Ptw (PBS med 0,1% Tween-20). Eggeplommeball (YB) er tydelig. (B) Den plomme fjernet ved å sikre at hodet av embryoet, etterfulgt av forsiktig disseksjon. (C) Et embryo poker (snøret limt til en Pasteur-pipette) blir brukt til å skille befruktede egg og eggeplomme avfall (D). Rensede embryoer blir pipettert på et objektglass (E) og innrettet (F). (G) Vaselin brukes på hjørnene av dekkglass. (H) for dekkglass plasseres forsiktig på toppen av embryoene i monteringsmedium. (I) Neglelakk brukes til å forsegle kantene av dekkglass. Klikk her for å se større bilde .

< strong> Figur 2. Analyse av genuttrykk mønstre og axon pathfinding i lateralt montert sebrafisk embryo. (A) Tegning av en sebrafisk embryo ved 24 HPF. I BD, er omtrent fire hemisegments over plommesekken forlengelse visualisert (eske området). (B) nkx6.1 er uttrykt i ventral ryggmarg, inklusive bunnplaten (FP). (C) robo3 er uttrykt i postmitotic nevroner (PMN). En gulvplate og stamfar sone er ikke tydelig i denne mer lateral fokusplan. I B, C, er ryggmargen er avgrenset av en brakett på den venstre side av bildet. (D) Konfokalmikroskopi ble brukt til bilde znp-en immunfluorescens, hvilke etiketter motoriske axoner spennende ryggmargen ventrally. I alle bildene, er anterior til venstre og rygg er opp. En 40X lang arbeidsavstand, nedsenking i vann (NA 0,8) objektiv ble brukt (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Discussion

Lateral montering av faste sebrafisk embryo hjelpemidler visualisering av ryggmarg utvikling. Ved fjerning av plomme ball, er arbeidsavstanden som kreves for eksepsjonell mikroskopisk avbildning reduseres. Våre representative resultater ble begrenset til 24 HPF stadium, kan imidlertid denne teknikken benyttes så tidlig som 18 HPF, skjønt tidligere embryoer er vanskeligere å dissekere på grunn av størrelsen av embryoet og skjørheten av vevet. Denne teknikken er også aktuelt å fostre eldre enn 24 HPF. Med hjelp av den optiske klarhet i embryonale sebrafisk, evnen til å utføre termin genetiske skjermer, revers genetikk, og transgene nærmer seg, kan flere utviklingsprosesser bli undersøkt. Dette inkluderer mitotiske indekser av nevrale stamceller med markører som BrdU og anti-fosfor-histone 4 ^{til 6 mars} og mønster gjennom uttrykk for nevronale og gliaceller progenitor markører i pax, nkx, dbx, og olig Familiers ^1,4-6. Reagenser som rapporterer glial og neuronal-bestemmelse (eksempel glial fibrillary syreprotein (GFAP) og HUC / D) ^1,4,5,10 kan benyttes. Nevronale subtype differensiering kan analyseres gjennom uttrykk for holme, VSX, engrailed, og gata gener ^1,4-6. Og til slutt, er analyse av axon veiledning mulig gjennom antistoffer som anti-acetylert tubulin, 3A10, og znp-en ^2,11,12. Selv om andre vertebrate modellsystemer (mus og kylling) blir brukt til å studere ryggmarg utvikling, bare den sebrafisk tillater samtidig visning av alle utviklings akser i intakt embryo.

Den åpenbare begrensningen for denne tilnærmingen er at embryoene er løst, noe som utelukker direkte avbildning. Faktisk fjernet (eller skade) eggeplomme fører til hurtig død embryonale, og dermed er det ikke mulig å redusere arbeidsavstanden i levende embryoer ved hjelp av denne teknikk. Men høy forstørrelse spinal cord bildebehandling i levende embryoer er mulig. For å bevare plommen under live bildebehandling, kan embryo plasseres i depresjon lysbilder, som gir et større mellomrom mellom prøven og dekkglass. Alternativt kan flere 22 mm x 22 mm Dekk limes på enten lysbilde av et tre i x 1 i mikroskopisk lysbilde. Dekk tjene som en "bro" for den overliggende dekkglass. Hvis embryoer er eldre enn 18 HPF, er Tricaine brukt til å bedøve embryoer for å hindre bevegelse. Mens en arbeidsavstand på 0.288 mm er nødvendig for deyolked embryoer på 24 HPF, når du arbeider med levende embryoer innebygd i agarose, med intakte plommer, er nok et mikroskopisk linse med en arbeidsavstand på 3,3 mm. Alternativt kan eksplantering kulturer som stammer fra deyolked embryoer bli visualisert ved hjelp av en plasma blodpropp immobiliseringsteknikken ^13. Forskjellige grupper av celler kan observeres ved bruk av genetisk kodede fluorescerende proteiner som GFP, mCherry eller Photoconkonvertible fargestoff Kaede (for å nevne noen). Videre kan fluorescensmerkede celler i løpet av kimære embryoer også sees med denne tilnærmingen ^14.

En konsekvent monteringsteknikk som er stabil i flere måneder er et kritisk verktøy for utviklings-og cellebiologer. Denne enkle teknikken er reproduserbar, noe som gir enkel sammenligning mellom ulike eksperimentelle studier. Videre justering av embryoer i rader lett tillater identifisering av spesifikke embryoer for senere analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes 35 mm x 10 mm	VWR	25373-041
Dumont Forceps #3	Fisher Scientific	NC9839169
Cover glass	Fisher Scientific	12-541-B22X22-1.5
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
SlowFade Gold	Fisher Scientific	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Petroleum Jelly	any grocery store
Loop Holders	VWR	80094-482
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10
Nickel Plated Pin Holders	Fine Science Tools	26016-12
Olympus Stereomicroscope	Olympus	SZ61