Dissection och Lateral Montering av Zebrafish embryon: Analys av ryggmärgs Utveckling

Summary

Develop processer såsom proliferation, mönstring, differentiering och axon vägledning kan lätt modelleras i zebrafisk ryggmärgen. I den här artikeln beskriver vi en monteringsförfarande för zebrafisk embryon, vilket optimerar visualisering av dessa händelser.

Abstract

Den zebrafisk ryggmärgen är en effektiv utredningsmodell för nervsystemet forskning av flera skäl. Först, kan genetiska, transgena och gen knockdown metoder användas för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom nervsystemets utveckling. För det andra, stora kopplingar av utvecklingsmässigt synkroniserade embryon ger stora experimentella provstorlekar. För det tredje, den optiska klarheten hos zebrafisk embryot tillåter forskare att visualisera stamfader, gliaceller och neuronala populationer. Även om zebrafisk embryon är transparenta, kan provet tjocklek hämma en effektiv mikroskopisk visualisering. En orsak till detta är den tandem utvecklingen av ryggmärgen och överliggande somit vävnad. En annan orsak är den stora gule boll, som fortfarande är närvarande under perioder av tidig neurogenes. I den här artikeln visar vi microdissection och avlägsnande av äggula i fasta embryon, vilket gör att mikroskopiska visualisering samtidigt som omgivande somit vävnad. Vi also visa semipermanent montering av zebrafisk embryon. Detta medger observation av neurodevelopment i dorso-ventrala och främre-bakre axlar, eftersom den bevarar tre-dimensionalitet av vävnaden.

Introduction

Visualisering av ryggmärgen i zebrafish inhiberas av ett antal faktorer. På grund av att tjockleken hos de överliggande somiter och den interna platsen för ryggmärg, är en avsevärt lång arbetsavstånd som erfordras för hög cellulär upplösning. Den gula bollen (som fortfarande är närvarande under tidiga stadier av neurogenes) ökar ytterligare arbetsavstånd som krävs, och skadas lätt av trycket från ett täckglas. Dessutom skräp från skadade äggula förbjuder tydlig visualisering av vävnader. Även tvärsektioner i Dorso-ventrala (DV) axel är möjliga, behöver de inte enkelt tillåter samtidig visualisering i anterior-posterior (AP) axel ^1.

För att övervinna dessa hinder är embryon dissekerades och monterades på objektglas. Detta förfarande ger flera fördelar. Först, zebrafisk embryon ligga lätt med den laterala sidan uppåt, vilket underlättar AP axel visualisering. För det andra, avlägsnande av äggula ball minskar den nödvändiga arbetsavstånd, och begränsar skräp. För det tredje ger detta monteringsförfarande för både lysrör och bright mikroskopi. För det fjärde, monterade embryon är stabila för månader vid 4 ° C, vilket gör långvarig exemplar visualisering. Slutligen sker utvecklingen av utvecklingen i att främre segment är mer mogen än bakre segment. För att säkerställa att iscensatta matchade ryggrads hemisegments jämförs mellan embryon är liggande somit vävnad användas som vägledning. Till exempel, ligger över den tionde mest bakre somit tionde spinal hemisegment, vilket är utvecklingsmässigt motsvarande i scenmatchade embryon. Detta montaget av intakta embryon gör det lätt att identifiera somites.

Vi använder genetik och gen knock-down teknik för att studera mekanismerna för Axon vägledning i utvecklings ryggmärgen. Framför allt har vi fastställt att robo2, robo3 och dcc krävs för commissural Primary ASCENding (CoPA) axonet pathfinding. Använda monterings procedur som beskrivs här, kunde vi undersöka ventrala tillväxt, mittlinjen korsning, commissure bredd, rygg och främre tillväxten ^2,3. Detta monteringsförfarande kan också tillämpas på DV eller AP mönstring av ryggmärgen. Vi har använt detta förfarande för att fastställa skilda roller nedströms Wnt effectors i DV-mönstring av ryggmärgen. Med hjälp av denna montering, kunde vi få upplösningen av DV markörer på enskild cellnivå, och bestämma minut mönstring skift som en följd av förändrad Wnt signalmottagning ^4,5. Detta montaget möjliggör också mitotiska indexberäkning genom anti phosphohistone 3 eller BrdU märkning (stamfader proliferation) differentiering ^5.

Protocol

1. Montering embryon (Efter avslutad Vald Visualiseringsteknik, till exempel Immuncytokemi, in situ hybridisering, etc.)

1. Placera embryon i en 35 mm petriskål fylld med buffert val (Figur 1A). Valet av buffert baseras på märkningsförloppet. Typiskt PBS-baserade buffertar är lämpliga.
2. Enligt en dissekera mikroskop, och med hjälp av pincett, fast huvudet med en pincett samtidigt som du drar äggulan undan med det andra paret (Figur 1B). Alternativt kan du använda en insekt stift i en insekt stift innehavaren att försiktigt dra bort äggulan.
3. Använda embryot poker (lina (0,41 mm diameter) limmas antingen ett kapillärrör eller en Pasteur pipett) flytta embryon till en del av petriskål som inte har en massa äggula skräp (figur 1C-D).
4. Med användning av en glas pasteurpipett aspireras embryon i så lite vätska som möjligt, och g.ently pipettera dem på en bild (figur 1E).
5. Försiktigt transportera bort överflödig vätska med hjälp av ett laboratorium torka. Undvik kontakt med embryon.
6. Tillsätt en droppe monteringsmedium till embryon. För fluorescerande etiketter, använda ett antifade reagens val. För kolorimetriska signaler kan 70% glycerol användas som monteringsmedium.
7. Med hjälp av embryot poker, orientera embryona på sina sidor i rader (Figur 1F).
8. Lägg till en "dab" vaselin eller hög fett vakuum till varje hörn av ett täckglas (figur 1G). Detta förhindrar skador på embryo från överdriven kompression.
9. Placera täckglas (vaselin sidan nedåt) på toppen av embryon (figur 1H).
10. Knacka försiktigt på täckglas i varje hörn tills montering media (70% glycerol eller anti-fade montering reagens) vidrör täckglas (figur 1H).
11. Om det behövs, tillsätt mer monteringsmedia genom att pipettera alldeles intill coverslip, med användning av en pipett i intervallet från 20 till 200 ml. Det kommer att veken under.
12. Med hjälp av ett laboratorium torka, helt rent runt täckglaset. Var noga med att inte pressa på täckglas, eftersom det skadar embryon. Detta område skall vara torr och har ingen vaselin eller montering media på det.
13. Använd nagellack för att täta runt kanten på täckglas (figur 1I).

Representative Results

När belysa de mekanismer som ligger bakom olika utvecklings evenemang såsom cellulär mönstring, differentiering, och Axon vägledning, är det viktigt att kunna visualisera celler inom ramen för deras vävnad. Dorsoventral mönstring defekter vanligtvis närvarande som en ventral eller rygg förskjutning i uttrycket domänen av transkriptionsfaktorer i pax, nkx eller dbx familjer ^4. Ibland kan förändringar vara subtil, som består av endast ett fåtal celldiameter ^4. Tvärsnittsanalys tillåter denna typ av analys. Däremot kan reagenser med svagare signaler, eller tvärsnitt som inte är vinkelrät mot AP-axeln begränsar tolkning. Vidare behöver tvärsnittsanalys inte enkelt ta hänsyn till om ändringar kvar i AP-axeln, och förlitar sig på att det finns en kryostat. Denna begränsning kringgicks genom sidovyer av ryggmärgen. Såsom ses i figur 2B är nkx6.1 mRNA distributed i ungefär den ventrala delen av ryggmärgen vid 24 h efter befruktning (HPF), på det sätt progenitor domänen. Progenitorceller är åtskiljbara inlägget mitotiska celler på grund av närvaron av golvplattan, som finns i den mediala delen av ryggmärgen. Sett med DIC optik, enskilda celler är klart urskiljbara, och en definierad gräns mellan att uttrycka och icke-uttryckande celler är uppenbar.

Progenitorcell cykeln utträde åtföljs av förändringar i genuttryck. Till exempel, alla post-mitotiska neuroner uttrycker Huc / D som är detekterbar med immunocytokemi ^1,5. mRNA prober för holme, gata, och VSX familjer märka specifika post-mitotiska nervceller i konsekvent ställning och nummer inom varje ryggmärgen hemisegment ^6. Dessutom axon vägledning receptorer som de i den robo familjen uttrycks i begränsade populationer av postmitotiska neuroner (figur 2C) 4-6.

Vid 24 HPF kan axoner hos följande postmitotiska neuroner visualiseras med olika metoder, och är urskiljbara vid enkelcellnivån: Dorsal Lateral Stigande (Dola) commissural Primär Stigande (CoPA) commissural Sekundär Stigande (cosa) Ventral Longitudinal Fallande (Veld), Kolmer-Agdur (KA), commissural bifurcating / Longitudinella (COB / l), Periferi stigande (CiA) Periferi Fallande (CID), och unipolära commissural fallande (UCoD), Rohon-Beard (RB), motoneuroner ( M) ^9. Axoner sträcker sig från dessa nervceller i rygg, ventrala, främre och bakre riktningar. De gren, korsa mittlinjen, och avsluta både rygg-och ventrala ryggmärgen. När den kombineras med konfokal laserscanningsmikroskopi Denna mångfald av cellulära beteenden är uppenbara i sidled monterade embryon, med användning av immunocytokemi och genetiskt kodade fluorescerande proteiner såsom GFP ^2. I Figur 2D var ZNP-1 immunocytokemi användes för att märka u motoneuroner. Motoneuroner lämnar ryggmärgen ventralt att innerverar den omgivande utveckla muskulatur.

Figur 1. Dissektion och lateral montering av zebrafiskembryon. (A) efter bearbetning till immunofluorescens, in situ hybridisering, etc. är embryon placeras i en 35 mm petriskål fylld med PBT (PBS med 0,5% Triton X-100) eller PTW (PBS med 0,1% Tween-20). Den äggulakulan (YB) är uppenbar. (B) Den gula avlägsnas genom att säkra huvudet av embryot följt av noggrann dissektion. (C) Ett embryo poker (fiskelina som limmats på en Pasteur pipett) används för att separera embryon och äggula skräp (D). Rengjorda embryon pipetteras på ett objektglas (E) och linje (F). (G) Vaselin appliceras på hörnen på täckglas. (H) Täckglaset placeras försiktigt på toppen av embryona i monteringsmedium. (I) Nagellack används för att täta kanterna på täckglas. Klicka här för att visa en större bild .

< strong> Figur 2. Analys av genuttryck mönster och axonet pathfinding i sidled monterade zebrafisk embryon. (A) Teckning av en zebrafisk embryo vid 24 HPF. I BD, är ungefär fyra hemisegments ovanför gulesäcken förlängningen visualiseras (box område). (B) nkx6.1 uttrycks i den ventrala ryggmärgen, inklusive golvplattan (FP). (C) robo3 uttrycks i postmitotiska neuroner (PMN). Golvplatta och stamfader zonen är inte tydligt i detta mer lateral fokalplanet. I B, C, är ryggmärgen som avgränsas av ett fäste på den vänstra sidan av bilden. (D) Konfokalmikroskopi användes för bild ZNP-1 immunofluorescens, vilka etiketter motoriska axoner lämnar ryggmärgen ventralt. I alla bilder, är anterior till vänster och dorsala är uppe. En 40X långa arbetsavstånd, vatten nedsänkning (NA 0,8) objektiv (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Lateral montering av fast zebrafisk embryon hjälpmedel visualisering av ryggmärgsutveckling. Genom borttagande av äggulan bollen, är den arbetsavstånd som krävs för exceptionell mikroskopisk avbildning reduceras. Vår representativa resultat var begränsade till 24 HPF stadiet, dock kan denna teknik användas så tidigt som 18 HPF, men tidigare embryon är svårare att dissekera på grund av storleken på embryot och bräcklighet av vävnaden. Denna teknik är också tillämplig på embryon äldre än 24 HPF. Med hjälp av den optiska klarheten hos den embryonala zebrafisk, förmågan att utföra framåt genetiska skärmar, omvänd genetik, och transgena metoder kan flera utvecklingsprocesser undersökas. Detta inkluderar mitotiska index av neuronala stamceller med markörer som BrdU och anti-fosfor-histon ^04-06 Mars och mönstring genom uttryck av neuronala och gliaceller stamceller markörer i pax, nkx, dbx, och olig families ^1,4-6. Reagens som rapporterar gliaceller och neuronala bestämning (t.ex. gliafibrillärt syraprotein (GFAP) och Huc / D) ^1,4,5,10 kan användas. Neuronal subtyp differentiering kan analyseras genom uttryck av holme, vsx, engrailed och gata gener ^1,4-6. Och slutligen, är möjlig analys av Axon vägledning genom antikroppar, såsom anti-acetylerade tubulin, 3A10, och ZNP-1 ^2,11,12. Även andra ryggradsdjur modellsystem (mus och chick) används för att studera ryggmärgen utveckling endast den zebrafisk tillåter samtidig visning av alla utvecklingsaxlar i den intakta embryot.

Den uppenbara begränsningen till detta tillvägagångssätt är att embryona är fasta, vilket utesluter Bildproduktion. I själva verket är det avlägsnandet av (eller skada på) guleresulterar i snabb embryonal död således inte möjligt att minska arbetsavståndet i levande embryon med användning av denna teknik. Men hög förstoring spinal cord avbildning i levande embryon är möjlig. För att bevara äggulan under live-avbildning, kan embryon placeras i depression diabilder, som ger ett större utrymme mellan provet och täckglas. Alternativt kan flera 22 mm x 22 mm täckglas limmas på endera bilden i en 3 i x 1 i mikroskopisk bild. Täckglasen tjäna som en "bro" för den överliggande täckglas. Om embryon är äldre än 18 HPF är tricaine används för att söva embryon för att förhindra rörelser. Medan ett arbetsavstånd på 0,288 mm för deyolked embryon vid 24 HPF, när man arbetar med levande embryon inbäddade i agaros, med intakta äggulor, räcker en mikroskopisk lins med ett arbetsavstånd på 3,3 mm. Alternativt kan Explantation kulturer härledda från deyolked embryon visualiseras med användning av en plasmakoagel immobiliseringsteknik ^13. Olika populationer av celler kan observeras genom användning av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, såsom GFP, mCherry eller photoconkonvertibla färgämne Kaede (för att nämna några). Vidare kan fluorescerande celler i chimär embryon också ses med detta tillvägagångssätt ^14.

En konsekvent monteringsteknik som är stabil i månader är ett viktigt verktyg för utvecklings-och cellbiologer. Denna enkla teknik är reproducerbar, vilket möjliggör enkel jämförelse mellan olika experimentella studier. Vidare, anpassningen av embryon i rader tillåter lätt identifiering av specifika embryon för senare analys.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dishes 35 mm x 10 mm	VWR	25373-041
Dumont Forceps #3	Fisher Scientific	NC9839169
Cover glass	Fisher Scientific	12-541-B22X22-1.5
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
SlowFade Gold	Fisher Scientific	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Petroleum Jelly	any grocery store
Loop Holders	VWR	80094-482
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10
Nickel Plated Pin Holders	Fine Science Tools	26016-12
Olympus Stereomicroscope	Olympus	SZ61