Summary
De actieve bacteriegemeenschappen geassocieerd met de darm van Spodoptera littoralis, werd bepaald door stabiele-isotoop probing (SIP) gekoppeld pyrosequencing. Met behulp van deze methodiek, de identificatie van de metabolisch actieve bacteriën soorten binnen de gemeenschap werd gedaan met een hoge resolutie en nauwkeurigheid.
Abstract
Ingewanden van de meeste insecten worden bewoond door complexe gemeenschappen van symbiotische pathogene bacteriën. Binnen deze microbiële gemeenschappen is het mogelijk om commensale of mutualistic bacteriesoorten identificeren. Deze laatste zijn waargenomen meerdere functies dienen om de insecten, dus helpen in insectencellen voortplanting 1, stimuleren van de immuunrespons 2, feromoonproductie 3, alsmede voeding, waaronder de synthese van essentiële aminozuren 4, onder anderen.
Vanwege het belang van deze associaties zijn veel pogingen gedaan om de gemeenschappen karakteriseren tot de afzonderlijke leden. De meeste van deze pogingen waren ofwel gebaseerd op teeltwijze of gebaseerd op de generatie van 16S rRNA genfragmenten die werden gesequenced voor definitieve identificatie. Helaas zijn deze benaderingen alleen die de bacteriële soorten in de darm en ontvangen geen information op de metabole activiteit van de micro-organismen.
Om de metabool actieve bacteriële species kenmerken in de darm van insecten, gebruikten we stabiele isotoop sonderen (SIP) in vivo toepassing van 13C-glucose als universeel substraat. Dit is een veelbelovende-cultuur vrije techniek die de koppeling van microbiële fylogenieën maakt het mogelijk om hun specifieke metabole activiteit. Dit is mogelijk door het volgen van stabiele isotoop gemerkte atomen substraten in microbiële biomarkers, zoals DNA en RNA 5. De opname van 13C isotopen in DNA verhoogt de dichtheid van de gemerkte DNA vergeleken met het ongelabelde (12 C) een. Uiteindelijk wordt het 13C-gelabelde DNA of RNA gescheiden door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie van 12 C-ongelabelde soortgelijk 6. Daaropvolgende moleculaire analyse van de gescheiden nucleïnezuur isotopomeren zorgt voor de verbinding tussen metabole activiteit en identiteit van de soort.
Hier presenteren we het protocol dat wordt gebruikt om de metabolisch actieve bacteriën te karakteriseren in de darm van een generalist insect (ons model systeem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). De fylogenetische analyse van het DNA werd gedaan met behulp pyrosequentiebepaling, waardoor hoge resolutie en nauwkeurigheid bij de identificatie van insectendarm bacteriegemeenschappen. Als voornaamste substraat werd 13C-gelabelde glucose gebruikt in de experimenten. Het substraat werd toegevoerd aan de insecten met een kunstmatig dieet.
Introduction
Insect-bacteriële symbiotische associaties staan bekend om een groot aantal insectensoorten 7. In deze symbiotische associaties, micro-organismen spelen een belangrijke rol bij de groei en ontwikkeling van insecten. Microben is aangetoond bijdragen aan insecten voortplanting 1, feromoon biosynthese 3, voeding, waaronder de synthese van essentiële aminozuren 4 en vertering van voedsel ontoegankelijk voor de gastheer. Ondanks de grote verscheidenheid van darm-bacteriële verenigingen, veel minder bekend over de functionele rol die zij spelen in het voordeel van het insect. Alleen bij de termieten, de symbiotische vertering van lignocellulose door prokaryoten, protozoa en fungi uitgevoerd uitgebreid bestudeerd werd 8,9. In tegenstelling tot deze, is er weinig bekend over de symbiotische vereniging aanwezig in de darmen van generalist insecten, dwz de katoen leafworm, Spodoptera litteralis. Bovendien, omdat zij frequent verschuiving van plantaardige gastheren, algemeenist insecten en hun darm geassocieerde bacteriële gemeenschappen zijn permanent blootgesteld aan nieuwe uitdagingen in verband met hun voedingsgewoonten consumeren planten met een overvloed aan fytochemicaliën. Naast deze, de darm milieu lepidopterans, vormt op zich een ruwe omgeving voor de groei van bacteriën vanwege de hoge darm pH 10. Vooral bij S. littoralis, varieert van 10,5 in de foregut, ca. 9 in de middendarm bijna 7 in de dikke darm 11 pH. Anderzijds, de bacteriegemeenschappen verband met de darm van S. littoralis is eenvoudig. Tang, Freitak, et al.. 12 rapporteerde maximaal 36 phylotypes behoren tot totaal 7 verschillende bacteriële species als de enige leden van de bacteriële gemeenschap waaraan deze insecten. Daarnaast is geen ingewikkelde fokken procedure vereist voor de groei insect in het laboratorium. Bovendien, deze en de korte levenscyclus van het insect te vergemakkelijken multi-generational studies, het draaien van deze soort tot een ideaal modelsysteem voor het bestuderen gut-microbe interacties.
Met de komst van PCR-gebaseerde sequencing technologie, is het aantal studies behandeling van darm biota van verscheidene organismen (bijvoorbeeld mensen, insecten of mariene organismen) verhoogd. Bovendien zal het resultaat zijn onafhankelijk van isolatie en kweek van de darm herbergden bacteriën in het verleden. Bijna 99% van de bacteriën zijn niet kweekbare en de simulatie van de milieu-omstandigheden in de darm is moeilijk 12. Door PCR kan 16S rRNA genfragmenten (een veelgebruikt fylogenetische merkergen onder bacteriën) selectief worden geamplificeerd uit een gemengde DNA-matrijs van darm bacteriële, gesequenced en gekloneerd. Met deze informatie, de gebruiker kan de bacteriële species te identificeren dan de sequentie informatie ophalen uit openbare databanken 13,14. Toch is de sequentie zal bacteriële beschrijvengemeenschappen onvoldoende blijven door gebrek aan informatie over de intrinsieke metabole bijdrage van de afzonderlijke soorten binnen de gemeenschap.
Stabiele isotoop sonderen (SIP) is een veelbelovende-cultuur free techniek. Het wordt vaak gebruikt in Environmental Microbiology microbiële fylogenie verband houden met bepaalde metabolische analyseert. Dit wordt bereikt door het volgen stabiele isotoop gemerkte atomen substraten in microbiële biomarkers, zoals fosfolipide afgeleide vetzuren, DNA en RNA 5. Bij het overwegen van nucleïnezuren, is de methode gebaseerd op de scheiding van 13C-gelabelde DNA of RNA van het ongelabelde DNA door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie 6. Door deze directe verbinding tussen de DNA label en metabolische activiteit, een stroomafwaartse moleculaire analyse van de nucleïnezuren worden de soort en geeft informatie over metabolische activiteiten. Bovendien combinatie van DNA-SIP en pyrosequencing zoals toegepast doorPilloni, von Netzer, et al.. 15, maakt een bijzonder eenvoudige en gevoelige identificatie van de bacteriële soorten in de zware 13 C-gelabelde DNA-fractie. Tot nu toe is deze techniek toegepast om de bacteriële gemeenschappen die betrokken zijn bij biogeochemische processen in de bodem onder aerobe en anaerobe omstandigheden 16,17 18,19 beschrijven. Naast het gebruik in milieukunde wordt de techniek toegepast in de medische wetenschappen zoals beschreven door Reichardt, et al.. 5, die de metabolische activiteiten van verschillende fylogenetische groepen van de menselijke darmflora beschreven in reactie op een verteerbare koolhydraten.
Hier gebruiken we 13C-glucose om "label" het DNA van de metabool actieve bacteriële soorten in de darm. Glucose is een suiker die door de meeste bacteriële species langs de brede Entner-Doudoroff (ED) route, hoewel uitzonderingen bekend 20. Dezerechtvaardigt het gebruik van 13 C-glucose als een betrouwbare metabole sonde die een verband tussen metabolieten van belang en de bron koolstof langs gevestigde paden biedt. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag andere substraten, namelijk 13 C-methaan, 13 CO 2 of planten onder een 13 CO2 atmosfeer verhoogd, kan worden gebruikt voor metabolische activiteiten te pakken.
Op dit punt, presenteren wij het protocol toegepast in de metabole karakterisering van de darm bacteriële gemeenschap van een generalist insect, namelijk S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Bovendien werd de techniek gekoppeld aan pyrosequencing, die op zijn beurt maakt de identificatie van insectendarm bacteriegemeenschappen met hoge resolutie en precisie. Als belangrijkste substraat werd 13C-gelabelde glucose gebruikt tijdens de experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insect Steigerend
- Kopen of er eieren klauwen van Spodoptera litteralis vanaf uw eigen opfok. Onderhoudsplicht in steriele Petrischalen bij kamertemperatuur (KT) tot uitkomen.
- Bereid de kunstmatige voeding voor de insecten grootbrengen als volgt:
- Soak 500 g gemalen witte bonen een nacht in 100 ml water.
- Voeg 9,0 g ascorbinezuur en 75 g agar aan 1000 ml gedestilleerd H2O en daarna kook het.
- Laat het mengsel afkoelen en wanneer het stolt (een witte wasachtige vaste stof mengsel) bewaard bij 4 ° C tot gebruik.
- Breng de pas uitgekomen larven een schone plastic doos en achterste ze op de kunstmatige voeding bij 23-25 ° C onder een lange dag bestaand met 16 uur van verlichting en 8 uur duisternis. Verander het eten elke dag tot de larven gaan door alle zes larvale stadia.
2. 13C-labeling van DNA in metabolisch actieve darmbacteriën
- Los 186,1 mg volledig 13C-gelabeld glucose met gedestilleerd en gedeïoniseerd water (DDH 2 O) en goed mengen met 100 g kunstmatige voeding voor de SIP experiment. Zorgen definitieve 13C-glucose concentratie van 10 mM in de kunstmatige voeding. Dit bootst de in situ glucoseconcentratie in de darm van S. littoralis larven voeden op katoenplanten volgens Shao et al.. (ingediend).
- Transfer 9-15 larven gezond tweede instar uit de doos opfok tot steriele plastic petrischaaltjes (een larve per petrischaal) met vers 13 C-glucose spiked kunstmatige voeding. Gebruik kunstmatig dieet met dezelfde hoeveelheid natief glucose (12 C-glucose), zoals beschreven voor het voeden van de controlegroep.
- Vernieuwen van de kunstmatige voeding vaak tijdens de incubatieperiode (1 dag). Gebruik kweekomstandigheden zoals in stap 1.3.
- Verzamel negen larven van elke behandeling voor latere verwerking (DNA-extractie). Elkrepliceren wordt gevormd door drie personen; maken ten minste drie duplo's per behandeling.
3. Insect Dissection
- Reinig en desinfecteer de dissectie instrumenten aan het begin van de werkzaamheden met ethanol 70% (Extra = Vannas schaar, pincet en scalpel met fijne wegwerp messen).
- Neem de insecten met een zachte pincet en wassen hun huid oppervlakkig met gedestilleerd water. Plaats ze op ijs gedurende ten minste 30 minuten te verdoven.
- Terwijl ze verdoofd plaats bij 0 ° C gedurende 1 uur om ze te doden. Ontsmet de dode insecten oppervlakkig door ze onder te dompelen in ethanol (70%) voor een paar minuten.
- Voer het insect dissectie tot een volume van ongeveer 15 ml 1x PBS afgezet op een steriele petrischaal (1XPBS = 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2PO 4, de pH op 7,4 , autoclaaf). Wees er zeker van dat het hele insect lichaam volledig ondergedompeld in de solution gedurende de hele periode ontleden.
- Begin de dissectie door een incisie in de huid langs de rechter en linkerzijde van het insect, begint op de kop en eindigen op de anus. Verwijder de hele huid, buisjes van Malpighi, en vet lichaam. Ga verder met verse buffer voordat het opensnijden de darm. Sectie de darm in voor-, midden-, en hindgut indien nodig. Bewaar het weefsel in de vriezer (-80 tot -20 ° C) tot DNA-extractie
4. DNA-extractie en amplificatie
- Plaats het insect weefsel in een 1,5 ml steriele centrifugebuis en droog alle monsters bij 45 ° C in een vacuüm concentrator inrichting. Crush gedroogd weefsel met een steriele plastic stamper.
- Extraheer het genomische DNA met een geschikte kit bodem DNA-extractie. Breng de droge tissue de reactiebuis van de kit en de instructies zoals aangegeven door de fabrikant.
- Bepaal de concentratie van de uiteindelijke geëlueerde DNA met een spectrofotometer.
- Verifya succesvolle extractie van de microbiële metagenomic DNA van het insect darm door het opstellen van een diagnostische PCR-test met behulp eubacteriële algemene primers 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) en 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Stel de PCR-reactie als volgt:
- Plaats een 50 pl reactiemengsel dat 1x buffer, 1,5 mM MgCl2, 10 mM vier deoxynucleoside trifosfaten (dNTPs), 2,5 U Taq DNA-polymerase, 0,5 mM van elke primer en 60 ng van het geëxtraheerde DNA als matrijs.
- Voer de PCR-reacties met behulp van een thermocycler als volgt: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 3 min, gevolgd door 35 cycli: 94 ° C gedurende 45 seconden, hybridisatie bij 55 ° C gedurende 30 seconden en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min . Gebruik een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
- Controleer de succesvolle PCR amplificatie in een 1% agarose elektroforese ethidiumbromide (EB) gekleurde gel (los 1 g agarose in 100 ml 1 x TAE buffer en vlek met 1 pi EB). Borg 5 ui the PCR product + 1 pi van 6x laden kleurstof in de gel zakken. (1x TAE = 40 mM Tris-base, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA, op pH 8).
- Laat de gel met 1xTAE buffer bij 300 V, 115 mA gedurende ca.. 20 min in een elektroforese kamer. Door het gebruik van een gel documentatie kamer (UV transilluminator verbonden met een digitale camera en computer) observeer de gel en vergelijk de grootte van uw eindproduct met de ook geladen gen marker, de juiste maat van de amplicons moeten ongeveer 1,5 kb zijn.
- Bewaar de PCR-producten onder diepe vrieskou, bij voorkeur -80 ° C tot gebruik.
5. DNA Scheiding-CsCl Gradient Ultracentrifugatie
- Bereid de reagentia voor de gradiënten voor ultracentrifugeren als volgt:
- Bereid een 7,163 M cesiumchloride (CsCl) oplossing door het geleidelijk oplossen van 603,0 g CsCI in DDH 2 O en vullen tot een eindvolume van 500 ml.
- Nauwkeurig Determine de dichtheid van de bereide CsCl oplossing wegen van een 1,0 ml aliquot van een evenwicht driecijferig door drievoud. Dit ligt meestal tussen 1,88 en 1,89 g / ml bij kamertemperatuur.
- Bereid de gradiënt buffer (100 mM Tris, 100 mM KCl en 1 mM EDTA) door het combineren van 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) en 3,75 g KCl in een definitieve volume van 500 ml met behulp van DDH 2 O. Filter (0,22 pm) steriliseren en autoclaaf deze oplossing.
- DNA-scheiding
- Na te hebben vastgesteld de individuele DNA-concentratie van de behandelde insecten, gemeten als in punt 4.3, zwembad die insecten die overeenkomt met een repliceren elkaar en normaliseren van hun DNA-concentratie te zorgen dat een ieder, in gelijke mate bijdraagt aan het samengevoegd monster. Een eindconcentratie van 500-5000 ng DNA (opnieuw meten de eindconcentratie) is geschikt voor het ultracentrifugatie proces 21.
- Voor het instellen van het verloop medium, combineren de gekwantificeerde DNA, gradiëntbuffer eend 4.8 ml 7,163 M CsCl oplossing samen om een gemengde volume van 6,0 ml in een steriele 15 ml schroefdop buis (vorming van een gradiënt medium-DNA-mengsel).
- Plaats het voorbereide gradiëntmedium-DNA mengsel in een 5,1 ml ultracentrifuge buis (vul in, totdat de onderkant van de buis nek) met een spuit en naald. Vermijd het pompen of vormen van eventuele luchtbellen. Ten minste een lege gradiënt (met behulp van DDH 2 O in plaats van DNA) in iedere centrifuge run als referentie verloop.
- Balance buis paren om binnen 10 mg van het gewicht na elke gewenste gradiënt medium wordt gevuld in de respectieve ultracentrifuge buis. Dicht de buis met een "Tube Topper" en ervoor te zorgen dat de afdichting is lekvrij door het buisje en het toepassen van matige druk met de hand.
- Gebruik een bijna verticale rotor met acht putten voor het houden van 5,1 ml ultracentrifuge buizen voor de ultracentrifuge. Verzegelen voorzichtig de rotor putten en laden de rotor in de ultracentrifuge volgens de mainstructies brikant's. Stel de ultracentrifugatie voorwaarden: centrifugeren op 50.000 rpm (ongeveer 177.000 xg), temperatuur 20 ° C en ultracentrifugatie looptijd voor 40 uur met vacuum. Selecteer maximale versnelling en de vertraging zonder rem.
- Eenmaal klaar, voorzichtig de buizen uit de centrifuge rotor met behulp van een tang. Plaats ze in een rek zonder de gevormde gradiënten binnen de buizen. Verwerk de gradiënt fractionering monsters zo snel mogelijk om diffusie te minimaliseren.
- Ophalen van DNA van isopycnische Gescheiden Verlopen door fractionering
- Gebruik een nauwkeurige HPLC-pomp systeem voor het uitvoeren van de gradiënt fractionering, die even scheidt de gevormde hellingen van de ultracentrifuge buis boven verplaatsing methode. Sluit de HPLC-pomp (100% stroomgradiënt) aan de fles gevuld met 1 liter cilinderinhoud DDH 2 O en stevig hechten aan de open pomp buis met een 23 G 1 in naald van de spuit. Voeg voldoende bromophenol blauwe kleurstof om de DDH 2 O om het een donkerblauwe kleur. Dit maakt de visualisatie van de interface tussen het verloop medium en de verplaatsing van DDH 2 O.
- Zet de pomp aan een debiet van 850 pl / min en evenwicht het systeem tot een enkele druppel van de blauw gekleurde DDH 2 O komt uit de naald van de spuit.
- Fix zorgvuldig de ultracentrifuge buis om een klem staan en prik de bodem van de buis met een spuit 23 G 1 in lange naald. Sluit de pomp aan de ultracentrifuge buis door de naald aan de pompslang in de bovenkant van de buis, en dalingen van de bodem te verzamelen rechtstreeks in steriele 1,5 ml microcentrifuge buizen. Verzamel een fractie elke 30 seconden, een bedrag van ongeveer 425 ul per fractie en een totaal van 12 fracties per verloop. Merk op dat de laatste fractie (fractie 12) bevat meestal de verplaatsing DDH 2 O en moet worden weggegooid.
- Na fractionering, measure de dichtheid van alle gescheiden fracties met behulp van een analytische balans zoals vermeld in punt 5.1.2.
- Precipiteer het DNA uit elke fractie (ongeveer 425 pl) door eerst 1 ui glycogeen (20 ug / ul in DDH 2 O, geautoclaveerd) als drager voor de precipitatie van lage hoeveelheid DNA. Meng het goed door.
- Twee volumes (850 pl) van polyethyleenglycol (PEG)-oplossing (opgelost 150 g polyethyleenglycol 6000 en 46,8 g NaCl in DDH 2 O tot een totaal volume van 500 ml. Filter, steriliseren en autoclaaf. Het PEG oplossing 30 % PEG 6000 en 1,6 M NaCl) en meng opnieuw door het omkeren tien keer.
- Laat de buizen bij kamertemperatuur gedurende ten minste twee uur (eventueel 's nachts) om het DNA te precipiteren.
- Centrifugeer de precipitaten bij 13.000 xg gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Een zichtbare pellet moeten vormen.
- Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en was het pellet met 500 pi van 70% ethanol. Centrifugeer onder dezelfdevoorwaarden voor 10 min weer.
- Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof en lucht-droog de pellet bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Los het gedroogde DNA pellet in 30 ul van DDH 2 O en meng goed door de buis zachtjes tikken. Kwantificeren van de DNA in elk gradiënt fractie als in stap 4.3 Store de monsters onder -20 of -80 ° C of langdurige opslag is niet vereist.
6. DNA Karakterisering door Pyrosequencing
- Controleer of de ongelabelde natieve (12 C) DNA neemt de dichtheid variëren van 1,705 g / ml tot 1,720 g / ml, terwijl 13C-gelabelde DNA een dichtheid van ongeveer 1,720-1,735 g / ml. Merk op dat zowel de autochtone en 13 C-gelabeld DNA geëxtraheerd uit milieu monsters meerdere gradiënt fracties kunnen overspannen. Verwacht het licht DNA geassocieerd te worden met breuken 9-11 en de zware DNA geassocieerd te worden met breuken 4-6.
- Combineer sleutel fracties om een "samengesteld" representatief deel ac creërengens de specifieke piek verdeling van de dichtheid opgelost DNA. Alternatief kunnen andere middelen om de afgescheiden fracties onderzocht met de isotopenverhouding massaspectrometrie (IRMS) 22 of fingerprintingmethode zoals denaturerende gradiënt gelelektroforese (DGGE) 23, helpen om passende fracties kiezen voor de sequencing.
- Voer pyrosequencing van de PCR-versterkte bacteriële 16S rRNA genen van de gecompileerde zware, midden en lichte fracties van elk individueel verloop. Met deze methode, identificatie van het geslacht en relatieve abundantie van metabool actieve bacteriesoorten in de SIP geïncubeerde monsters mogelijk. Voer pyrosequencing als volgt:
- Voer amplicon pyrosequencing met behulp van een Roche 454 FLX instrument met Titanium reagentia.
- Bereid streepjescode amplicons voor het multiplexen met de fusie primer set Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) en Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 verlengd met the respectievelijke primer Adaptor A / B en sample-specifieke multiplex identifiers (MID).
- Breng een een-staps PCR met 30 cycli, met behulp van een Hot Start Taq-polymerase, de sequencing bibliotheek te genereren.
- Sequentiëren de amplicons gebaseerd op de leverancier protocol, en uitbreiding van de leest van de voorwaartse richting (Gray28F) zoals beschreven in http://www.researchandtesting.com/ .
7. Pyrosequencing Data Analysis
- Analyseer de ruwe volgorde leest gegenereerd door de 454 pyrosequencing met de "kwantitatieve inzichten in microbiële ecologie", QIIME software pijpleiding 26. Voer de verwerking als volgt:
- Aanvankelijk zetten de 454-machine-gegenereerde sff bestand naar FASTA, QUAL en Flowgram bestanden met de process_sff.py script.
- Valideren van de mapping-bestand (gebaseerd op check_id_map.py) en wijs multiplex leest aan biologische samselen met de split_libraries.py script. Trim de lage kwaliteit eindigt met een schuifraam grootte van 50 en een gemiddelde kwaliteit cutoff parameter van 25, elimineren ook korte dubbelzinnig sequenties (de lengte <200 bp) uit de dataset.
- DeNoise de data 454 met behulp van de denoise_wrapper.py.
- Vervolgens cluster de hoge kwaliteit leest in operationele taxonomische eenheden (OTU's) met behulp van de meervoudige OTU plukken methode (pick_otus.py met 97% sequentie-overeenkomst cut-offs).
- Kies een representatieve reeks van elkaar OTU gebruik pick_rep_set.py.
- Taxonomie toewijzen aan de vertegenwoordiger opeenvolgingsgroep gebaseerd op assign_taxonomy.py. Gebruik de Ribosomaal Database Project (RDP) classifier met een minimum vertrouwen op te nemen opdracht ingesteld op 0.80.
- Lijn de vertegenwoordiger volgorde tegen de prealigned Greengenes kern 16S sequenties met behulp van het algoritme PyNast (align_seqs.pymet de minimale sequentie-identiteit procent ingesteld op 75).
- Bovendien, afbrekende hersenschimmen van verdere analyse door het uitvoeren identify_chimeric_seqs.py.
- Verwijder alle gap posities (niet handig voor fylogenetische gevolgtrekking) met de lanemask sjabloon (filter_alignment.py) voorafgaand aan de bouw van een fylogenetische boom (make_phylogeny.py).
- Tenslotte genereren OTU tafels met make_otu_table.py, beschrijven het optreden van bacteriële phylotypes binnen elk monster. Gebruik de OTU tabel om de heatmap te construeren voor het vergelijken van de bacteriële overvloed en activiteit.
- Indien nodig, berekenen de alfa-en bèta diversiteit binnen en tussen de monsters, respectievelijk. Op dezelfde wijze kan verdunning krommen (grafieken van diversiteit versus sequencing diepte) en Principal coördinaten Analysis (PCOA) percelen die de relaties tussen microbiële ook worden bereid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om voldoende etikettering van de metabolisch actieve bacteriën in de insectendarm bereiken, moet de insecten worden blootgesteld aan de 13 C-rijke substraat voor een eerder geoptimaliseerde voldoende tijd voor de scheiding van de gelabelde zwaardere fractie gemakkelijk mogelijk van ongelabelde lichtere. In ons geval werd 13C-glucose aangevuld de kunstmatige voeding bij een uiteindelijke concentratie van 10 mM tot 1 dag (figuur 1A). Dezelfde hoeveelheid normale glucose (fig. 1B) werd geleverd in de kunstmatige voeding van de insecten buiten. Zoals eerder vermeld, scheiding van de DNA-fracties (zwaardere lichtere) is de basis van het hele proces. Daarom is de eerste stap uit te voeren is de extractie van DNA uit het weefsel van belang, in dit geval, de bacteriegemeenschappen verband met het insect darm. Om de kwaliteit te bevestigen is het van belang een electroforese gel lopen om te bepalen of DNA helemaal werd verkregen uit de analyzed weefsel. In figuur 1C is waarneembaar een sterke band van genomisch DNA aan de bovenkant van het beeld bevestigt de positieve DNA-extractie. Bovendien moet een diagnostische PCR uitvoeren door bacteriële universele primers, de aanwezigheid van bacterieel DNA (figuur 1D) bepalen. Dit positieve resultaat is belangrijk om te beslissen of verder gaan met de scheiding van het geëxtraheerde DNA metagenomic.
Na ultracentrifugatie, wanneer de hoeveelheid DNA in elke fractie gescheiden wordt bevestigd en de meting van de dichtheid wordt gedaan plot de gemiddelde fractie dichtheid in g / ml via fractie zodat het juiste verloop formatie buizen, die normaal bedekt bevestigen een dichtheid variëren van 1.690 (voor fractie 12 of 11) tot en met g / ml 1,760 g / ml (Voor fractie 1). Kwantitatieve pyrosequencing wordt direct uitgevoerd op de representatieve SIP gradiënten aan soorten afstamming onthullen en relatieve rijkdom (figuur 2 13 C-glucose gewijzigd monster en de ongelabelde controle, die diende voor het profileren van actieve bevolking in de gemeenschap. Na sequencing totaal 120.045 hoge kwaliteit leest met een gemiddelde lengte van 404 nucleotiden gegenereerd. De pyrosequencing profiel toonde een toegenomen overvloed van bepaalde soorten waaronder Enterococcus en Pantoea in het gelabelde monster (13-C gelabelde DNA figuur 3) vergeleken met die in de controlegroep (12 C Control DNA figuur 3). Daarom moeten deze bacteriën worden beschouwd metabolisch actief, en verdienen verdere studie.
Figuur 1. 13C-glucose feeding experiment, DNA-extractie en PCR amplificatie van het 16S rRNA gen bacteriële e. (A) 13 C-glucose gewijzigd kunstmatige dieet geconsumeerd door Spodoptera littoralis larven. (B) Indiaans glucose (12 C-glucose) gewijzigd kunstmatige dieet geconsumeerd door larven van dezelfde partij insecten in (A), die dient als controle . (C) Typische metagenomic DNA-extract van het darmweefsel van larven in de 13 C-glucose behandelde groep en in de 12 C-glucose controle groep. Drie biologische replicaten (laan 1, 2 en 3) zijn opgenomen in elke groep. M staat voor 1 kb DNA-merker. (D) PCR-amplificatie met een universele bacteriële primer set genereert de juiste 1,5 kb 16S rRNA-gen producten, waarbij de gevonden metagenomic DNA als template. Lanen 1 is de PCR-positieve controle. Laan 2 en 3 vertegenwoordigen de 13 C-glucose behandelde monster en de 12 C-glucosecontrole, respectievelijk. jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Overzicht van een Pyro-SIP experiment met CsCl dichtheidsgradiënt ultracentrifugeren en fractie karakterisering met pyrosequencing van de gescheiden DNA. H = hogere overvloed, L = lager overvloed. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Bacteriële diversiteit en relatieve rijkdom in de zware fracties van de inheemse glucose gevoede larven (12 C-control DNA) en 13 C-glucose gevoede larven (13C-gelabeld DNA)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De darm van de meeste insecten herbergt een rijke en complexe microbiële gemeenschap, meestal 10 7 -10 9 prokaryote cellen dienen er een verhouding eigen cellen van de gastheer in de meeste gevallen. Zo is de insectendarm is een "hot spot" voor diverse microbiële activiteiten, die meerdere aspecten van microbiële relaties, van pathogenese naar mutualisme 27 obligaat. Hoewel veel studies een verbazingwekkende verscheidenheid aan insecten darm microbiële gemeenschappen, hebben beschreven karakterisering van de metabole activiteit van de darmflora is zeldzaam. Stabiele isotoop indringende benaderingen bieden nu de mogelijkheid voor het onderscheiden van de actieve leden van een complexe microbiota achtergrond onafhankelijk van de teelt en zelfs in vivo. We pasten deze waardevolle tool om de darmflora te studeren in een insect modelsysteem, katoen blad worm (Spodoptera littoralis). Omdat glucose is de dominante suiker in de darm van katoen leafworm, in deze demonstratie we gevoed de LARvae met een kunstmatige voeding verrijkt met een extra, maar fysiologische dosis van 13 C-glucose naar de metabolisch actieve bacteriën sporen in de darmflora. Een identieke incubatie gelegd met natief glucose ontvangen kritisch controle voor latere vergelijking opdat alle zichtbare kenmerken van nucleïnezuur was geen artefact van de werkwijze zelf, zoals een hoog G+ C gehalte in DNA dragen aan scheiding. De buurt in situ concentratie van glucose verminderd experimentele inslag. Andere overwegingen die verband houden met een strenge experimentele opstelling van de DNA-SIP studie is elders 28,29 besproken. De darmbacteriën normaal metabolisch zeer actief en hebben korte generatie tijd in vergelijking met de micro-organismen van de meeste terrestrische en aquatische milieus. Dus een 24 uur continu toevoeren veroorzaakte reeds een aanzienlijke labeling. Merk op dat een grote hoeveelheid gastheer genoom DNA werd ook worden geëxtraheerd uit de darm weefsel, dat moet worden rekeningoverweging bij de bespreking van de resultaten.
De typische gradiënt fractie karakterisering gebaseerd op de lage-resolutie fingerprinting methoden, zoals terminale restrictie fragment lengte polymorfisme (RFLP-T) en tijdrovend cloonbibliotheek constructie om de gegevens te verbinden. Het is pas onlangs dat de komst van high-throughput tweede generatie sequencing techniek zorgt voor een snelle, kosteneffectieve, en gedetailleerde analyse van complexe microbiële gemeenschappen. Hier pasten wij deze nieuwe technologie om direct de enquête van de genetische samenstelling van de dichtheid gradiënt fracties en identificeren van metabolisch actieve bacteriën, die verbeterde gevoeligheid gaf vergeleken met de gel-elektroforese gebaseerde methoden, en gefaciliteerd daaropvolgende fylogenetische classificatie. Door het vergelijken van gelijkwaardige zware fracties van zowel de 13 C-label en 12 C-controlemonsters, vinden we dat Pantoea en Enterococcus werden bestempeld op isotoop sonderen. Zodra de Metabolically actieve bacteriën zijn geïdentificeerd, kunnen andere analyses zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) met specifieke probes en metagenomic analyse van het gelabelde DNA teruggewonnen uit actieve leden van de gemeenschap worden uitgevoerd om een uitgebreid inzicht in de ware symbionten verbonden met de gastheer bieden . Op basis van het ingestelde systeem hier kunnen andere 13C-gelabelde koolstofbronnen worden toegevoerd aan de gastheer aan de bij de beoogde darm metabole route bacteriën ontleden, bijvoorbeeld labelen van de cellulose actieve bacteriën betrokken bij de ontvangende verteringsproces identificeren. Met de ontwikkeling van deze nieuwe benaderingen, zal de rol van insecten darmflora duidelijker dan nu geworden.
Gezamenlijk de hier beschreven protocol is een eenvoudige, snelle en efficiënte werkwijze voor het bepalen metabolische activiteiten van de darmflora, die verder kan worden toegepast op de specifieke rol van bac beoordelenRial symbionten in de ontvangende voeding, ontgifting, en defensie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Angelika Berg voor laboratorium hulp. Dit werk werd ondersteund en gefinancierd door het Max Planck Instituut en de Jena School voor Microbiële Communication (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D.
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al.
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
