Summary
스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.
Abstract
대부분의 곤충의 내장은 공생 비병원성 박테리아의 복잡한 사회에서 살고있다. 이러한 미생물 지역 사회 내에서 그것은 공생이나 공생 박테리아 종을 식별 할 수 있습니다. 후자의 것, 즉 다른 사람의 사이에서, 필수 아미노산 (4)의 합성을 포함하여 면역 반응 2, 페로몬 생산 3,뿐만 아니라 영양을 증폭, 곤충 재생 1 도움, 곤충에 여러 기능을 제공하는 것으로 관찰되었다.
때문에 이러한 연결의 중요성에 많은 노력이 개별 구성원에 이르기까지 지역 사회의 특성을되었습니다. 그러나, 이러한 노력의 대부분은 하나 재배 방법에 근거하거나 최종 식별 서열화 된 16S rRNA 유전자 단편의 생성에 의존 하였다. 불행히도, 이러한 방법은 장내에 존재하는 세균 종을 파악하고 더 INFORMAT을 제공하지미생물의 대사 활동에 이온.
곤충의 창자의 대사 활성 세균 종의 특성을 위해, 우리는 보편적 인 기질로 13 C-포도당을 이용한 생체 내 (SIP)를 프로빙 안정 동위 원소를 사용했습니다. 이것은 그들의 특정 신진 대사 활동에 미생물 계통의 결합을 할 수있는 유망한 문화가없는 기술이다. 이는 DNA와 RNA 5와 같은 미생물의 생체에 기판에서 안정 동위 원소 표지 원자를 추적 가능합니다. DNA가 비 표지 (12 C)에 비해 한 표지 DNA의 밀도를 증가시킨다 (13)에 C의 혼입 동위 원소. 결국, 13 C-표지 된 DNA 또는 RNA는 12 C-레이블이없는 유사 하나 6에서 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 분리된다. 분리 된 핵산 분자 동위 원소의 후속 분석 종의 대사 활동 및 ID 사이의 연결을 제공한다.
여기에서, 우리는 제너럴 곤충 (우리의 모델 시스템), 스포 도프 테라 리토 랄 (나비목, Noctuidae)의 창자에있는 대사 활성 박테리아의 특성을하는 데 사용되는 프로토콜을 제시한다. DNA의 계통 발생 학적 분석은 곤충 장내 세균 공동체의 식별에 높은 해상도와 정밀도를 허용 pyrosequencing 기법을 사용하여 수행 하였다. 메인 기판으로서, 13 C-표지 된 글루코스가 실험에 사용 하였다. 기판은 인공 사료를 사용하여 곤충에 공급 하였다.
Introduction
곤충 박테리아의 공생 협회는 곤충 종 7의 큰 숫자에 대한 알려져있다. 이러한 공생 협회에서, 미생물은 곤충의 성장과 발달에 중요한 역할을한다. 미생물은 호스트에 곤충 필수 아미노산 (4)의 합성을 포함하여 재생 1, 페로몬 생합성 3, 영양, 및 액세스 음식의 소화에 기여하는 것으로 나타났다. 장내 세균 협회의 광대 한 다양한에도 불구하고, 훨씬 적은들은 곤충에 찬성 재생 기능 역할에 대한 알려져있다. 만 흰개미의 경우에는 목질 섬유소의 공생 소화가 원핵 생물, 원생 동물, 곰팡이에 의해 수행, 널리 8,9를 공부하고 있습니다. 이와 대조적으로, 거의가 제너럴 곤충의 용기면 leafworm 즉에 존재하는 공생 관계에 대해 잘 알려져 있습니다, 스포 도프 테라는 일반적으로 인해 식물 호스트의 자신의 빈번한 이동에, 또한. 리토 랄IST 곤충과 그들의 창자 관련된 세균성 지역 사회가 영구적으로 자신의 식습관은 식물성 화학 물질의 과다로 식물을 소비에 연결된 새로운 도전에 노출되어 있습니다. 이 옆에 lepidopterans의 창자 환경은 본질적으로 높기 때문에 장내의 pH 10의 박테리아의 성장을위한 가혹한 환경을 나타냅니다. 특히 S.의 경우 리토 랄, 그것은 범위 foregut 10.5에서 중장 캘리포니아. 9 거의 7 hindgut (11)를 PH합니다. 한편, 세균성 커뮤니티 S.의 가트와 관련된 리토 랄은 간단합니다. 당나라, Freitak, 등. (12)는이 곤충과 관련된 세균성 지역 사회의 구성원 만 아니라 7 개의 다른 박테리아 종의 총에 속하는 36 phylotypes 최대를보고했다. 이 외에도, 복잡한 양육 절차는 실험실에서 곤충 성장을 위해 필요하지 않습니다. 또한, 이것과 곤충의 짧은 수명주기가 다 g 용이enerational 연구, 창자 - 미생물 상호 작용 연구를위한 이상적인 모델 시스템에이 종을 선회.
PCR 기반 시퀀싱 기술의 출현으로, 몇개의 미생물 (즉, 인간, 곤충이나 해양 생물)의 가트 생물상 다루는 연구의 수는 증가하고있다. 더욱이, 결과는 과거뿐만 고립과 가트 숨겨 세균 배양으로부터 독립적이다. 박테리아의 약 99 %는 경작되지 않고 장내에서 일반적인 환경 조건의 시뮬레이션은 12 어렵다. PCR을 이용하여 16S rRNA 유전자 단편 (세균 가운데 널리 계통 유전자 마커) 선택적 서열화 가트 세균 공동체의 혼합 DNA 템플릿에서 증폭 및 복제 될 수있다. 이 정보를 통해, 사용자는 공개 13,14 데이터베이스로부터 서열 정보를 검색 한 후 종의 박테리아를 식별 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 순서는 박테리아를 설명하는 접근사회 인해 지역 사회 내의 개별 종의 고유 대사 공헌에 대한 정보의 부족으로 충분한 남아있다.
안정 동위 원소 (SIP)를 프로빙 유망 문화가없는 기술이다. 그것은 종종 특정 신진 대사 활동에 링크 된 미생물의 계통 발생을 분석하는 환경 미생물학에서 사용된다. 이는 같은 인지질 유래 지방산, DNA 및 RNA 5와 같은 미생물의 생체에 기판에서 안정 동위 원소 표지 원자를 추적하여 달성된다. 핵산을 고려하면, 방법론은 밀도 구배 초 원심 분리 (6)에 의해 비 표지 DNA의 13 C-표지 된 DNA 또는 RNA의 분리에 기초한다. 때문에 DNA 라벨과 신진 대사 활동 사이의 직접 연결로, 핵산의 하류 분자 분석은 종을 식별하고 신진 대사 활동에 대한 정보를 제공합니다. 또한, DNA-SIP와 pyrosequencing 기법의 조합에 의해 적용되는Pilloni 폰 쩌르 교수, 등. (15)는 무거운 13 C-표지 된 DNA 분획에 존재하는 세균 종의 특정 간단하고 민감한 식별을 허용합니다. 지금까지이 기술은 호기성 및 혐기성 조건 16, 17, 18, 19에서 토양 생지 화학 과정에 포함 된 세균의 지역 사회를 설명하기 위해 적용되었습니다. 난소 화성 탄수화물에 대한 응답으로 인간의 장내 미생물의 서로 다른 계통 발생 그룹의 신진 대사 활동을 설명 Reichardt, 등. 5에 의해보고 된 환경 과학에서의 사용 외에,이 기술은 의료 과학에 적용되었습니다.
여기에서 우리는 창자의 대사 활성 박테리아 종의 DNA '라벨'에 13 C-포도당을 사용합니다. 포도당은 예외가 20 알려져 있지만, 광범위한 엔트 - Doudoroff (ED) 경로를 따라 대부분의 세균 종에 의해 이용 당합니다. 이또한 대사 확립 경로를 따라 탄소원 간의 링크를 제공 신뢰성 대사 프로브로서 13 C-글루코스 사용을 정당화한다. 과학적 질문에, 다른 기판, 즉 13 C-메탄, 13 CO 2, 13 CO 2 분위기하에 발생 식물에 따라 대사 활동을 해결하는데 사용될 수있다.
이 시점에서, 우리는 제너럴 곤충, 즉 S.의 장내 세균 공동체의 대사 특성에 적용되는 프로토콜을 제시한다 리토 랄 (나비목, Noctuidae). 또한, 기술은 다시 높은 해상도와 정밀도를 가진 곤충 장내 세균 공동체의 식별을 허용 pyrosequencing 기법에 결합했다. 메인 기판으로서, 13 C-표지 된 글루코스는 실험 동안 사용 하였다.
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Protocol
1. 곤충 사육
- 구입 또는 스포 도프 테라의 계란 클러치를 얻을 자신의 양육에서 리토 랄. 부화 할 때까지 실온 (RT)에서 무균 배양 접시에서 그들을 유지합니다.
- 다음과 같이 사육 곤충의 인공 사료를 준비합니다 :
- 물 100 ㎖에 하룻밤 500g 지상 흰 콩을 적신다.
- H 2 O 증류수 1,000 ml로 9.0 g 아스 코르 빈산 및 75g의 한천을 추가하고, 그 후 가열한다.
- 혼합물이 냉각하게하고 (흰색 밀랍 고체 혼합물) 응고 할 때 사용할 때까지 4 ° C에 보관하십시오.
- 조명의 16 시간과 어둠의 8 시간과 긴 하루 정권 깨끗한 플라스틱 상자와 23 ~ 25 ° C에서 인공 사료에 후면을에 부화 된 유생을 전송합니다. 애벌레가 여섯 애벌레 령충을 통과 할 때까지 매일 음식을 변경합니다.
대사 활성 창자 박테리아의 DNA의 2. 13 C-라벨
- 증류수, 탈 이온수 (DDH 2 O)와 완벽하게 13 C-표지 된 포도당 186.1 mg의 용해 및 SIP 실험을위한 인공 사료 100 g을 잘 혼합. 인공 사료에 10 mm의 최종 13 C - 포도당 농도를 확인합니다. 이것은 S.의 창자에있는 현장의 포도당 농도를 모방 샤오 등에 따라면 식물에 리토 랄 유충의 먹이. (제출).
- 전송 9-15 신선한 13 C - 포도당을 함유하는 멸균 플라스틱 페트리 접시 (세균 배양 용 접시 당 하나의 유충)에 사육 상자에서 건강한 두 번째 령 유충은 인공 사료를 아군. 한 바와 같이 대조군 수유를 들어, 네이티브 포도당 (글루코스 C-12)의 동일한 양을 함유하는 인공 사료를 사용한다.
- 배양 기간 (1 일) 동안 자주 인공 사료를 갱신. 단계 1.3에서와 같이 양육 조건을 사용합니다.
- 후 처리 (DNA 추출)에 대한 각각의 치료에서 아홉 애벌레를 수집합니다. 각각의세 개인에 의해 구성되고, 복제, 처리 당 적어도 세 개의 반복을합니다.
3. 곤충 해부
- 깨끗하고 에탄올 70 % (도구 = Vannas 가위, 집게 및 미세 일회용 블레이드 메스)에 대한 작업의 시작 부분에 해부 도구를 소독.
- 부드러운 집게와 곤충을 가지고 증류수로 표면적으로 자신의 피부를 씻는다. 를 마취하기 위해 적어도 30 분 동안 얼음에 배치합니다.
- 여전히 그들을 죽일 1 시간 동안 0 ℃에서 장소를 마취하는 동안. 몇 분 에탄올 (70 %)에서 그들을 담가 표면으로 죽은 곤충을 소독.
- 7.4으로 산도를 조정, 약 15 ㎖의 1X PBS의 멸균 페트리 접시 (1XPBS = 137 밀리의 NaCl, 2.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 2 HPO 4, 1.47 mM의 KH 2 PO 4에 증착의 볼륨으로 곤충 해부를 수행 , 오토 클레이브). 완전히 한 solut에 몰두 전체 곤충의 몸을 갖는하십시오전체 해부 기간 동안 이온.
- 머리에 시작하여 항문에 완료, 오른쪽과 곤충의 왼쪽 측면을 따라 피부를 절개하여 절개를 시작합니다. 피부 전체, Malpighian 세관, 지방의 몸을 제거합니다. 창자를 열고 절단하기 전에 신선한 버퍼로 변경합니다. 절은 앞, 미드, 그리고 hindgut의 용기가 필요합니다. 냉동실에 조직을 보관 (-80 ~ -20 ℃)까지 DNA 추출
4. DNA 추출 및 증폭
- 1.5 ㎖의 멸균 원심 분리 관에있는 곤충의 조직을 놓고 진공 집중 장치에서 45 ° C에서의 모든 샘플을 건조. 멸균 플라스틱 유봉 건조 조직을 분쇄.
- 토양 DNA 추출에 적합한 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다. 키트의 반응 관에 건조 조직을 전송하고 제조업체가 표시된 지시 사항을 따르십시오.
- 분광 광도계를 사용하여 최종 용출 된 DNA의 농도를 결정.
- Verif와 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3) - Eubacterial 일반 프라이머를 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3 5)를 사용하여 진단 PCR 분석을 준비하여 곤충의 창자에서 미생물 metagenomic DNA의 나중에 성공 추출. 다음과 같이 PCR 반응을 설정
- 1X 버퍼, 1.5 mM의 MgCl2를, 10 mM의 네 옥시 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (dNTPs를), 2.5 U의 Taq의 DNA 중합 효소, 각 프라이머의 0.5 ㎜, 템플릿으로 추출 된 DNA의 60 NG를 포함하는 50 ㎕의 반응 액을 설정합니다.
- 30 초 동안 55 ° C에서 45 초, 어닐링 94 ° C, 1 분 72 ° C의 확장 :; 35 회 반복 처음 3 분 동안 94 ° C에서의 변성을 다음과 같이 열 순환기를 사용하여 PCR 반응을 실행 . 10 분 동안 72 ° C에서 최종 확장 단계를 사용합니다.
- 1 % 아가로 오스의 성공적인 PCR 증폭 에티 디움 브로마이드 (EB) 스테인드 젤 (100 1X TAE 버퍼링 ㎖의 1μL EB와 얼룩에 아가로 오스의 1g을 용해) 전기 영동 확인합니다. 일의 예금 5 μL젤 주머니에 배의 로딩 염료 + 1μL 전자 PCR 제품. (1X TAE pH를 8로 조정, 40 MM 트리스 -베이스, 20 mM의 빙하 아세트산, 1 mM의 EDTA를 =).
- CA에 대한 300 V, 115mA에서 1xTAE 버퍼를 사용하여 젤을 실행합니다. 전기 챔버에서 20 분. 젤 문서 실 (디지털 카메라를 컴퓨터에 연결 UV 트랜스 일루미네이터)를 사용하여 젤을 관찰하고도로드 유전자 마커를 사용하여 최종 제품의 크기를 비교, 증폭 산물의 정확한 크기는 약 1.5 KB이어야합니다.
- 우선적으로, 깊은 냉동 조건에서 PCR 제품을 보관 -80 ° C, 사용할 때까지.
5. DNA 분리 - CSCL 그라데이션 초 원심 분리
- 다음과 같이 초 원심의 그라데이션의 시약을 준비
- 점차 DDH 2 O에서 협동 학습의 603.0 g을 용해시켜 7.163 M 염화 세슘 (CSCL) 솔루션을 준비하고 500 ML의 최종 볼륨을 채워.
- 정확하게 해제삼중 의해 세자리 밸런스에 1.0 ml의 분취 량을 계량하여 준비된 CSCL 용액의 밀도 테르. 이것은 일반적으로 1.88 및 1.89 g / ㎖에서 RT에서 배열한다.
- 1 M 트리스-HCl (pH 8.0), 0.5 M EDTA 1 ㎖ (산도 8) 및 마지막에서의 KCl 3.75 g의 50 ㎖를 조합하여 구배 완충액 (100 mM 트리스, 100 ㎜의 KCl, 1 mM의 EDTA)를 준비 DDH 2 O를 사용하여 500 ㎖의 부피 (0.22 μm의) 필터이 솔루션을 살균 압력솥.
- DNA 분리
- 포인트 4.3로 측정 처리 된 곤충의 개별 DNA 농도를 결정하는 데, 함께 복제에 대응하는 하나 하나가 동일하게 풀링 된 샘플에 기여하고 있는지 확인하기 위해 DNA 농도를 정상화하는 곤충을 풀. DNA의 500 ~ 5,000 NG (다시 최종 농도를 측정)의 최종 농도는 원심 분리 공정 (21)에 적합하다.
- 그라데이션 매체를 설정하려면, 정량화 된 DNA, 그라데이션 버퍼를 결합D 4.8 멸균 15 ML 스크류 캡 튜브 (그라데이션 중간 DNA 혼합물의 생성)에 6.0 ㎖를 혼합 볼륨에 함께 7.163 M 협동 학습 솔루션의 ML.
- 조심스럽게 주사기와 바늘을 사용하여 (튜브 목의 기초까지 기입) 5.1 ㎖의 초원 심 분리기 튜브로 제조 된 그라데이션 중간 DNA 혼합물을 배치합니다. 공기 방울을 펌핑하거나 형성하지 마십시오. 참조 그라데이션 각 원심 분리기 실행에 (대신 DNA의 DDH 2 O를 사용하여) 하나 이상의 빈 그라디언트를 포함합니다.
- 각 필수 그라데이션 매체 후 중량 10 ㎎ 이내로 밸런스 관 쌍은 각각의 초원 심 분리기 튜브로 가득 차 있습니다. "튜브 토퍼"로 튜브를 밀봉하고 인감 누출이없는 튜브를 반전 손으로 적당한 압력을 적용하여 있는지 확인합니다.
- 초 원심 5.1 ML의 원심 분리 튜브를 들고 8 개의 우물에 가까운 수직 로터를 사용합니다. 조심스럽게 로터 우물을 봉인하고 엄마에 따라 초 원심 분리기로 로터를로드nufacturer의 지시. 초 원심 분리 조건을 설정 스핀을 진공 40 시간 동안 실행 시간 50,000 (177,000 XG 정도) 회전 수, 온도 20 ° C에서, 및 초 원심에서. 브레이크없이 최대 가속과 감속을 선택합니다.
- 일단 완료, 조심스럽게 집게를 사용하여 원심 분리기 회 전자에서 튜브를 제거합니다. 튜브 내에서 형성 그라데이션을 방해하지 않고 랙에 배치합니다. 가능한 빨리 임의의 확산을 최소화하기 위해 구배 분획 샘플들을 처리한다.
- 분별로 Isopycnic 분리 그라디언트에서 DNA의 검색
- 똑같이 초원 심 분리기 관 정상 변위 방법에서 형성 그라데이션을 구분하는 그라데이션 분별을 수행하기 위해 정확한 HPLC 펌프 시스템을 사용합니다. DDH 2 O 1 L 변위로 채워진 병에 HPLC 펌프 (100 % 흐름 구배를) 연결하고 단단히 주사기 바늘에 23 G 1 오픈 펌프 호스에 연결합니다. 충분한 B 추가그것을 다크 블루 색상을 제공하기 위해 DDH 2 O에 파란색 염료를 romophenol. 이것은 그라데이션 매체 DDH 2 O.의 변위 사이의 인터페이스의 시각화를 용이
- 850 μL / 분의 유속으로 펌프를 설정하고, 블루 컬러 DDH 2 O 주사기 바늘 밖으로 나온다 한 방울까지 시스템을 평형.
- 조심스럽게 클램프 스탠드에 초원 심 분리기 튜브를 수정하고 긴 바늘에 주사기 23 G 1 관의 바닥을 관통. 관의 상부에 펌프 호스에 부착 된 바늘을 삽입하여 초원 심 분리기 튜브에 펌프를 연결하고, 직접 멸균 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 바닥에서 방울을 수집합니다. 약 425 분수 당 μL 및 그라데이션 당 12 분수의 총 금액, 일부마다 30 초를 수집합니다. 마지막 부분 (부분 12) 일반적으로 변위 DDH 2 O를 포함하고 폐기해야합니다.
- 분별 한 후에, 저단계 5.1.2에서 설명한 것처럼 분석 저울을 사용하여 모든 분리 된 분획의 밀도를 asure 수.
- 첫 번째 DNA의 적은 양의 강수량을위한 캐리어로 (멸균 DDH 2 O에서 20 ㎍ / μL) 1 μL 글리코겐을 추가하여 (425 μL 정도) 각 부분의 DNA를 침전. 반전으로 잘 섞는다.
- 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 (500 ml의 총 부피에 폴리에틸렌 글리콜 6000 150g과 DDH 2 염화나트륨 O 46.8 g을 용해의 두 개의 볼륨 (850 μL)를 추가합니다. 필터, 살균 및 오토 클레이브. PEG 용액은 30입니다 % PEG 6000 1.6 M의 NaCl), 및 열 번 반전하여 다시 섞는다.
- (필요한 경우 하룻밤) DNA를 침전 적어도 두 시간 동안 RT에서 튜브를 남긴다.
- RT에서 30 분 동안 13,000 XG에서 침전물을 원심 분리기. 눈에 보이는 펠릿 형성한다.
- 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻으십시오. 동일에서 원심 분리기다시 10 분의 조건.
- 조심스럽게 뜨는을 취소하고 15 분 동안 실온에서 펠렛을 공기 건조.
- DDH 2 O 30 μL에서 건조 된 DNA 펠렛을 재용 부드럽게 튜브를 활용하여 잘 섞는다. 단계 4.3 스토어 -20 또는 -80 ° C에서 샘플을 장기 보관이 필요한 경우에 각 그라데이션 부분에있는 DNA의 양을.
6. pyrosequencing 기법에 의한 DNA 특성
- 13 C-표지 된 DNA는 약 1.720-1.735 ㎍ / ㎖의 밀도를 갖는 반면, 레이블이없는 네이티브 (12 C) DNA는 1.705 ㎍ / ㎖에서 1.720 ㎍ / ㎖의 농도 범위를 차지하고 있는지 확인합니다. 네이티브 및 환경 시료에서 추출 된 13 C-표지 된 DNA가 모두 몇 그라데이션 분수를 확장 할 수 있습니다. 빛 DNA 분수 9-11 분수 4-6과 연관 될 수있는 무거운 DNA와 연관 될 것으로 예상된다.
- 하나의 "컴파일"대표 분수 교류를 만드는 주요 분수를 결합농도 - 해결 DNA의 특정 피크 할당으로 묶는. 대안 적으로, 이러한 구배 겔 전기 영동 (DGGE) (23)을 변성으로, 동위 원소 비율 질량 분석법 (IRMS) (22) 또는 핑거 프린팅 방법을 사용하여 분리 된 분획을 검사하는 다른 방법은 시퀀싱 전에 적절한 분획을 선택하는 것을 도울 수있다.
- 각 그라데이션의 컴파일, 무거운 중간과 빛 분수에서 PCR 증폭 세균의 16S rRNA의의 유전자의 pyrosequencing 기법을 수행합니다. SIP이 방법의 혈통의 식별 및 대사 활성 박테리아 종의 상대 풍부하게 사용이 가능합니다 샘플을 배양 하였다. 다음과 같이 pyrosequencing 기법을 수행
- 티타늄 시약 로슈 454 FLX 악기를 사용하여 앰플 리콘의 pyrosequencing 기법을 수행합니다.
- 번째로 확장 (24, 25) (- - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3 5)과 Gray519r (GTNTTACNGCGGCKGCTG -3 5) Gray28F을 설정 융합 프라이머를 사용하여 다중에 대한 바코드 증폭 산물을 준비전자 각각의 프라이머 어댑터 A / B 및 샘플 별 다중 식별자 (MID).
- 시퀀싱 라이브러리를 생성하기 위해, 핫 스타트의 Taq 중합 효소를 사용하여, 30 사이클을 가진 한 단계 PCR을 적용한다.
- 공급 업체의 프로토콜에 따라 증폭 산물을 시퀀싱 및에 설명 된대로 진행 방향 (Gray28F)에서 읽어 연장 http://www.researchandtesting.com/ .
7. pyrosequencing 기법 데이터 분석
- 원시 시퀀스가 "미생물 생태에 풍부한 통찰력", QIIME 소프트웨어 파이프 라인 (26) 454 pyrosequencing 기법에 의해 생성 된 읽기 분석합니다. 다음과 같이 처리를 수행
- 처음에는 process_sff.py 스크립트 FASTA, QUAL과 Flowgram 파일을 454 기계 생성 SFF 파일을 변환합니다.
- (check_id_map.py 기준) 매핑 파일의 유효성을 검사하고 멀티 플렉스 생물 샘을 읽고 할당PLES split_libraries.py 스크립트를. 낮은 품질의 50의 슬라이딩 윈도우의 크기와 25의 평균 품질 차단 매개 변수로 끝 트림, 데이터 집합의 짧은 모호한 시퀀스 (길이 <200 BP)도 제거한다.
- denoise_wrapper.py를 사용하여 454 데이터를 노이즈 제거.
- 다음에, 여러 OTU 피킹 방법 (pick_otus.py 97 % 서열 유사성 컷 오프 가진)를 사용하여 고품질이 작동 분류학 유닛 (OTUs)로 판독 클러스터.
- pick_rep_set.py 사용하여 각 OTU의 대표 시퀀스를 선택합니다.
- assign_taxonomy.py에 따라 대표 시퀀스 세트에 분류를 지정합니다. 0.80로 설정 기록 할당에 대한 최소한의 신뢰와 리보솜 데이터베이스 프로젝트 (RDP) 분류를 사용합니다.
- 알고리즘 PyNast (align_seqs.py를 사용하여 prealigned Greengenes 코어 16S 시퀀스에 대해 설정을 대표하는 순서를 맞 춥니 다75 최소한의 서열 동일성 %의 집합).
- 또한, identify_chimeric_seqs.py을 실행하여 추가 분석에서 키메라를 고갈.
- 이전의 계통 발생 (make_phylogeny.py)를 구축하는 lanemask 템플릿 (filter_alignment.py)와 (계통 발생 추론에 유용하지 않음) 모든 간격의 위치를 제거합니다.
- 마지막으로, 각 샘플 내의 박테리아 phylotypes의 발생을 설명하는, make_otu_table.py로 OTU 테이블을 생성. 세균 풍부하고 활동을 비교하기위한 히트 맵을 구성하는 OTU 테이블을 사용합니다.
- 필요한 경우, 각각의 샘플 내 사이 알파 및 베타 다양성을 계산한다. 동일하게, 진공 곡선 (시퀀싱 깊이 대 다양성의 그래프) 및 미생물 공동체 간의 관계를 나타내는 주 코디네이트 분석 (PCoA) 플롯도 제조 할 수있다.
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Representative Results
곤충 장내 본 대사 활성 균의 충분한 표시를 달성하기 위해, 곤충 한 비 표지 라이터로부터 용이하게 표지 된 중질 분획의 분리를 허용하기에 충분한 미리 최적화 동안 13 C가 풍부한 기판에 노출되어야한다. 우리의 경우는, 13 C-글루코스는 일일 (도 1a)에 대한 10 mM의 최종 농도 인공 사료에 첨가 하였다. 정상 글루코스 (도 1b)의 동일 량을 제어 곤충의 인공 사료에 공급 하였다. 전술 한 바와 같이, (라이터에서 울트라) DNA 분획의 분리는 전체 과정의 기초이다. 따라서, 수행되는 첫 번째 단계는 또한 조직으로부터 DNA를 추출이며,이 경우, 세균 여행자는 곤충 가트와 연관된. 품질을 확인하기 위해이 모든에서 모든 DNA는 물리 - 화학적 인 매개 변수의 분석에서 얻은 여부를 확인하기 위해 전기 영동 젤을 실행하는 것이 중요합니다제드 자형의 조직. 도 1C에서, 긍정적 DNA 추출을 확인한 화상의 상단 게놈 DNA의 강한 대역 관찰이다. 또, 세균의 DNA (도 1D)의 존재를 결정하기 위하여, 박테리아 유니버설 프라이머를 사용하여 PCR 진단을 수행 할 필요가있다. 이 긍정적 인 결과는 더 추출 metagenomic DNA의 분리를 계속 여부를 결정하는 것이 중요합니다.
각 분리 된 분획의 DNA의 양이 확인 및 밀도의 측정이 완료되면 원심 분리 한 후, 통상 커버 튜브의 적절한 구배 형성을 확인하기 위하여 g / ㎖ 분획 번호 위에있는 평균 분획 밀도 플롯 1.690에서 ㎍ / ㎖ (일부 12 또는 11) 1.760 ㎍ / ㎖로 농도 범위 (부분 1). 양 pyrosequencing 기법은 종의 혈통을 표시하는 대표 SIP 그라디언트에서 직접 수행 및 상대 풍부 (그림 2됩니다 13 C - 포도당 개정 샘플과 지역 사회에서 활동 인구 프로파일 봉사 레이블이없는 컨트롤 모두에서 큰 분수를 순서가. 서열 분석 후, 120,045 고품질의 총 404 개의 뉴클레오티드의 평균 길이가 발생 하였다하여 판독한다. pyrosequencing 기법 프로파일은 표시된 샘플에서 엔테로 및 판토 대조군 (12 C 제어 DNA, 그림 3)에 비해 (13 C-표지 된 DNA, 그림 3) 등의 특정 종의 증가 풍요 로움을 보여 주었다. 따라서 이들 세균은 대사 활성으로 간주하고, 장점을 더 연구하고 있습니다.
도 1. 13 C-글루코스 수유 실험, DNA 추출 및 박테리아 16S rRNA의 겐의 PCR 증폭 전자. (A) 13 C-포도당 스포 도프에 의해 소비되는 인공 사료는 유충 리토 랄 개정. (B) 기본 포도당 (12 C-포도당) 컨트롤 역할 (A)에 사용되는 곤충의 동일한 배치에서 유충에 의해 소비되는 인공 사료를 개정 13 C - 포도당 치료 그룹과 12 C-포도당 대조군 애벌레의 창자 조직에서. (C) 일반 metagenomic DNA 추출. 세 생물은 복제 (레인 1, 2, 3) 각 그룹에 포함되어 있습니다. M 1 킬로바이트 DNA 마커를 의미합니다. (D) PCR 증폭 보편적 인 세균 프라이머 세트 템플릿으로 추출 된 metagenomic DNA를 사용하여 올바른 1.5 KB (16S) rRNA 유전자 제품을 생성과 함께. 레인 1은 PCR 긍정적 인 컨트롤입니다. 레인 2와 3은 각각 13 C-글루코스 처리 샘플 및 12 C-글루코스 컨트롤을 나타낸다. JPG "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 분리 된 DNA의 pyrosequencing 기법과 협동 학습 밀도 구배 초 원심과 분수의 특성을 포함하는 파이로-SIP 실험의 개요. H는 높은 풍부, L = 낮은 풍부. = 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 세균의 다양성과 고유 포도당 공급 유충 (12 C 제어 DNA) 및 13 C-포도당 공급 유충 (13 C-표지 된 DNA)의 무거운 분수의 상대 풍부./ www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
대부분의 곤충의 창자는 풍부하고 복잡한 미생물 군집을 품고, 일반적으로 10 ~ 12 -10 9 원핵 세포는 대부분의 경우 호스트의 자신의 세포를 상회하는, 거기에 제기. 따라서, 곤충의 창자는 상리 공생 (27)를 의무하는 기전에서 미생물 관계의 여러 측면을 대표하는 다양한 미생물의 활동에 대한 "핫 스팟"입니다. 많은 연구가 곤충 장내 미생물 사회의 놀라운 다양성을 설명했지만 장내 미생물의 대사 활동의 특성은 드물다. 안정 동위 원소 프로빙 방법은 현재 재배의 독립, 심지어 생체 내에서 복잡한 미생물의 배경에서 활동중인 회원을 구분하는 가능성을 제공합니다. 우리는 곤충의 모델 시스템,면 잎 웜 (스포 도프 테라 리토 랄)의 장내 미생물을 연구하기 위해이 유용한 도구를 적용했다. 포도당면 leafworm의 창자에있는 지배적 인 설탕이기 때문에,이 데모에서 우리는 고맙다을 공급인공 사료와 VAE는 창자 식물의 대사 활성 박테리아를 추적하는 13 C - 포도당의 추가하지만 생리 학적 선량 스파이크. 기본 포도당으로 설립 동일한 배양은 핵산의 명백한 표시는 분리에 기여 DNA 높은 G+의 C 함량 등의 방법 자체의 이슈가 아닌 것을 확인하기 위해 이후의 비교를위한 중요한 컨트롤을 제공했다. 글루코스 시츄 농도 근처 추가적으로 실험 바이어스를 감소시켰다. DNA-SIP 연구의 엄격한 실험 장치에 관한 기타 고려 사항은 다른 28,29 논의되었습니다. 장내 세균은 일반적으로 대사 매우 활성화되고 대부분의 지상 및 수중 환경에서 미생물에 비해 짧은 생성 시간이있다. 지속적으로 공급 따라서 24 시간이 이미 상당한 라벨을 일으켰습니다. 호스트 게놈 DNA의 대량 또한 고려되어야 가트 조직으로부터 coextracted되었음을 유의고려의 결과를 논의 할 때.
전형적인 구배 분획 특성은 단자 제한 단편 길이 다형성 (T-RFLP)로서 저해상도 핑거 프린팅 방법에 의존 한 데이터를 연결하기 위해 시간이 소요 클론 라이브러리 공사. 그것은 높은 처리량 2 세대 시퀀싱 기술의 출현은 복잡한 미생물 군집의 신속하고 비용 효과적인하고, 상세한 분석을 허용하는 것이 단지 최근이다. 여기에 우리가 직접 밀도 구배 분수의 유전 적 구성을 조사하여 겔 전기 영동 기반의 방법에 비해 향상된 감도를 준 대사 활성 박테리아를 식별하는이 새로운 기술을 적용하고, 이후의 계통 분류를 촉진. 13 C-표지 및 12 C-제어 샘플 모두에서 동등한 무거운 분수를 비교함으로써, 우리는 판토와 엔테로 프로빙 동위 원소에 표시가 된 것을 알게됩니다. 일단 대사와olically 활성 박테리아가 확인 된 같은 특정 프로브 및 표지 DNA의 metagenomic 분석 활발한 커뮤니티 회원들로부터 복구를 사용하여 현장 하이브리드 화에 형광 (FISH)와 같은 다른 분석은 호스트와 연결된 진정한 공생에 포괄적 인 통찰력을 제공하기 위해 수행 할 수있다 . 여기서 확립 시스템에 기초하여, 다른 13 C-표지 된 탄소원 또한 호스트 소화 과정에 관여 활성 박테리아를 식별하는 셀룰로오스 라벨, 예를 들어, 대상 가트 대사 경로에 관여 박테리아를 해부 호스트로 공급 될 수있다. 이러한 새로운 접근 방법의 개발과 함께, 곤충 장내 미생물의 역할은 현재보다 더 명백해질 것이다.
집합 적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 상기 bacte의 특정 역할을 평가하기 위해 적용 할 수있는 장내 미생물의 대사 활동을 결정하기위한, 간단 신속하고 효과적인 방법을 나타낸다호스트 영양, 해독 및 방어 리얼 공생.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 실험실 지원되었습니다 Angelika 버그 감사합니다. 이 작품은 막스 플랑크 사회와 미생물 통신 (JSMC)에 대한 예나 학교에서 지원하고 자금을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
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