Summary
Активный бактериальная сообщество связано с кишечнике Spodoptera littoralis, определялась конюшни изотопно-зондирования (SIP), соединенного с пиросеквенирования. С помощью этой методики выявление метаболически активных видов бактерий в рамках сообщества было сделано с высоким разрешением и точностью.
Abstract
Кишки большинства насекомых обитают сложных сообществ симбиотических непатогенных бактерий. В таких микробных сообществ можно определить синантропных или мутуалистических бактерий видов. Последние, были обнаружены служить несколько функций к насекомым, т.е. помогает в воспроизведении насекомых 1, повышая иммунный ответ, продукцию 2 феромона 3, а также питание, в том числе синтеза незаменимых аминокислот 4, среди других.
В связи с важностью этих ассоциаций, многие были предприняты усилия, чтобы охарактеризовать общины вплоть до индивидуальных членов. Тем не менее, большинство из этих усилий были либо на основе методов выращивания или полагались на генерации 16S рРНК фрагментов гена, которые были секвенированных для окончательной идентификации. К сожалению, эти подходы только определили видов бактерий, присутствующих в кишечнике и не предоставил Informatион на метаболической активности микроорганизмов.
Для характеристики метаболически активных видов бактерий в кишечнике насекомого, мы использовали стабильный изотоп зондирования (SIP) в естественных условиях, использующей 13 С-глюкозы в качестве универсального субстрата. Это перспективная культура без метод, который позволяет связь микробных филогений их конкретной метаболической активности. Это возможно путем отслеживания стабильных изотопов, меченых атомов с субстратов в микробных маркеров, таких как ДНК и РНК 5. Включение 13С изотопов в ДНК увеличивает плотность меченого ДНК по сравнению с немеченого (12 C) один. В конце концов, 13 С-меченого ДНК или РНК отделяется в градиенте плотности ультрацентрифугирования от 12 C-немеченого аналогичным один 6. После молекулярный анализ отделенных изотопомеров нуклеиновых кислот обеспечивает связь между метаболической активности и личности вида.
Здесь мы представляем протокол, используемый для характеристики метаболически активные бактерии в кишечнике универсалом насекомого (наша модель системы), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Совки). Филогенетический анализ ДНК было сделано с использованием пиросеквенирования, что позволило высокое разрешение и точность в выявлении кишечной насекомое бактериального сообщества. Как основной подложке, 13 С-меченого глюкозы был использован в экспериментах. Субстрат подавали насекомых с использованием искусственного диету.
Introduction
Насекомых-бактериальные симбиотические ассоциации известны большим количеством видов насекомых 7. В этих симбиотических ассоциаций, микроорганизмы играют важную роль в росте и развитии насекомых. Микробы, как было показано способствовать воспроизводства насекомых 1, феромонов биосинтеза 3, питание, в том числе синтеза незаменимых аминокислот 4, и переваривание пищи недоступной к хосту. Несмотря на огромное разнообразие кишечной-бактериальная объединений, гораздо меньше известно о функциональной роли, которую они играют в пользу насекомого. Только в случае термитов, симбиотические переваривание лигноцеллюлозы осуществляется прокариот, простейших и грибов, был широко изучен 8,9. В отличие от этого, мало что известно о симбиотической ассоциации, присутствующих в кишечнике широкого профиля насекомых т.е. хлопка leafworm, Spodoptera littoralis. Кроме того, из-за их частого смещения растений-хозяев, генеральныйист насекомые и их кишки, связанные бактериальных сообществ постоянно подвергается новым вызовам, связанным с их привычки питания потребляют растения с множеством фитохимические. Кроме этого, в кишечнике среда в чешуекрылых, представляет само по себе жесткую среду для роста бактерий из-за высокого рН содержимого кишечника 10. В частности, в случае S. littoralis, она колеблется от 10,5 в передней кишки, ок. 9 в средней кишке до рН почти 7 в задней кишки 11. С другой стороны, бактериальный сообщество, связанный с кишечнике S. littoralis прост. Тан, Freitak и др. 12. Сообщили максимум 36 филотипов принадлежащих в общей сложности 7 различных видов бактерий в качестве единственных членов сообщества бактерий, связанного с этим насекомым. Кроме того, нет сложной процедурой разведение не требуется для роста насекомых в лаборатории. Кроме того, это и короткий жизненный цикл насекомого облегчить мульти-гenerational исследования, превращая этот вид в идеальном модельной системы для изучения кишка-микробных взаимодействий.
С появлением технологий секвенирования на основе ПЦР, число исследований, посвященных кишки биоты нескольких организмов (т.е. люди, насекомых или морских организмов), увеличилось. Кроме того, результаты не зависят от выделения и культивирования кишечной питал бактерий, как и в прошлом. Почти 99% бактерий не пригодной для обработки и моделирования условий окружающей среды, существующих в кишечнике трудно 12. С помощью ПЦР, 16S рРНК фрагменты генов (широко используемый филогенетическое маркерный ген среди бактерий), могут быть селективно амплифицированы из шаблона смешанной ДНК кишечных бактериальных сообществ, секвенировали и клонировали. С этой информацией, пользователь может определить видов бактерий после получения информации о последовательности из государственных баз данных 13,14. Тем не менее, последовательность подходов для описания бактериальныхобщины остаются недостаточными в связи с отсутствием информации о внутренней метаболической вклада отдельных видов в сообществе.
Стабильный изотоп зондирования (SIP) является перспективным методом культура обслуживания. Он часто используется в экологической микробиологии для анализа микробных филогении связаны с определенными метаболической активности. Это достигается путем отслеживания стабильных изотопов, меченых атомов с субстратов в микробных маркеров, таких как фосфолипидных производных жирных кислот, ДНК и РНК 5. При рассмотрении нуклеиновых кислот, методика основана на разделении 13 C-меченой ДНК или РНК от немеченого ДНК с помощью градиенте плотности ультрацентрифугирования 6. В связи с этим прямой связи между меткой ДНК и метаболической активности, ниже по течению молекулярный анализ нуклеиновых кислот определяет виды и предоставляет информацию о метаболической активности. Кроме того, сочетание ДНК-SIP и пиросеквенирования применительно кPilloni, фон Netzer и соавт. 15, допускает определенную простой и чувствительный идентификации видов бактерий, присутствующих в тяжелой 13 С-меченого ДНК-фракции. До сих пор эта методика была применена для описания бактериальных сообществ, участвующих в биохимических процессов в почве в аэробных 16,17 и анаэробных условиях 18,19. Кроме использования в экологической науки, техника была применена в медицине как сообщает Рейхардта и соавт. 5, который описал метаболические деятельности различных филогенетических групп кишечной микрофлоры человека в ответ на неперевариваемых углеводов.
Здесь мы используем 13 C-глюкозы в 'этикетке "ДНК из метаболически активных видов бактерий в кишечнике. Глюкоза является сахар используется в большинстве видов бактерий вдоль широкого Энтнер-Doudoroff (ЭД) пути, хотя исключения, как известно, 20. Этооправдывает использование 13 С-глюкозы в качестве надежного обмена веществ зонда, который обеспечивает связь между метаболитов, представляющих интерес и источника углерода на существующих путей. В зависимости от научной вопрос, другие субстраты, т.е. 13 C-метана, CO 2 13, или растений, заданным в 13 CO 2 атмосфере, могут быть использованы для решения метаболических действий.
На данный момент, мы представляем протокол применяется в метаболической характеристики кишечной бактериальной общины универсалом насекомого, а именно S. littoralis (Lepidoptera, Совки). Кроме того, техника была соединена с пиросеквенирования, что в свою очередь позволяет идентифицировать насекомых кишечника бактериального сообщества с высоким разрешением и точностью. В качестве основного субстрата, 13 С-меченого глюкозы был использован в ходе экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Насекомое Разведение
- Купить или получить яйца лап Spodoptera littoralis с вашего собственного выращивания. не поддерживать их в стерильные чашки Петри при комнатной температуре (RT) до вылупления.
- Подготовка искусственного корма для насекомых выращивания следующим образом:
- Замочите 500 г молотого белого фасоль на ночь в 100 мл воды.
- Добавить 9,0 г аскорбиновой кислоты и 75 г агара в 1000 мл дистиллированной H 2 O, а затем варить.
- Пусть смеси остыть и когда он затвердевает (в виде белого воскообразного твердого вещества смеси) не хранить его при температуре 4 ° С до использования.
- Перенести недавно вылупившихся личинок в чистую пластиковую коробку и сзади их на искусственной питательной на 23-25 ° С в долгосрочной режима дня с 16 часов освещения и 8 часов темноты. Измените пищу каждый день, пока личинки не пройти через все шесть личиночных возрастов.
2. 13 С-маркировка ДНК в метаболически активных бактерий кишки
- Растворить 186,1 мг полностью 13C-меченой глюкозы дистиллированной и деионизированной водой (DDH 2 O) и хорошо перемешать с 100 г искусственного корма для SIP эксперимента. Обеспечить конечную концентрацию 13 С-глюкозы 10 мМ в искусственной диете. Это имитирует в концентрации Ситу глюкозы в кишечнике S. littoralis личинки, питающиеся хлопчатника в соответствии с Шао и соавт. (представленный).
- Передача 9-15 здоровым второй стадии личинок из коробки выращивания в стерильных пластиковых чашках Петри (один личинки за чашку Петри), содержащих свежие 13 C-глюкозу шипами искусственное питание. Использование искусственной диеты, содержащей такое же количество нативного глюкозы (12 C-глюкозы), как описано, для подачи контрольную группу.
- Обновить искусственный диеты часто в течение инкубационного периода (1 день). Используйте Разведение условия, как в пункте 1.3.
- Соберите девять личинок от каждой обработки для последующей обработки (выделения ДНК). Каждыйповторить состоит трех лиц; сделать по крайней мере три дубликатов на лечение.
3. Насекомое Рассечение
- Очистите и продезинфицируйте рассекает инструменты в начале работы с этанолом 70% (Инструменты = Vannas ножницы, щипцы и скальпель с мелкими одноразовых лезвий).
- Возьмите насекомых с мягкой пинцетом и мыть кожу поверхностно дистиллированной водой. Поместите их на льду в течение не менее 30 мин, чтобы обезболить их.
- В то время как все еще под наркозом место им при 0 ° С в течение 1 часа, чтобы убить их. Лечить мертвых насекомых поверхностно, погружая их в этаноле (70%) в течение нескольких минут.
- Выполните насекомых рассечение в объеме примерно 15 мл 1x PBS наносят на стерильную чашку Петри (1xPBS = 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na 2 HPO 4, 1,47 мМ KH 2 PO 4, доведения рН до 7,4 , автоклав). Обязательно иметь всю насекомых тело полностью погружен в Solutионный течение всего периода вскрытии.
- Начните рассечение, делая разрез в коже вдоль правой и левой сторон насекомого, начинается с головы и закончить на анус. Снять целый кожу, мальпигиевых и жира в организме. Перейдите в свежем буфере до резки открытым кишку. Раздел кишка в план-, средне-, и кишки, когда это требуется. не хранить ткани в морозильной камере (от -80 до -20 ° C) до экстракции ДНК
4. ДНК Добыча и Усиление
- Поместите насекомых ткани в 1,5 мл стерильную центрифужную пробирку и высушить все образцы при 45 ° С в вакуумном концентраторе устройства. Давка сушеные ткани со стерильным пластиковым пестиком.
- Извлечение геномной ДНК с помощью подходящего набора для экстракции ДНК почвы. Передача сухой ткани в реакционную трубку комплекта и следовать инструкциям, как указано производителем.
- Определить концентрацию конечного элюированной ДНК с использованием спектрофотометра.
- Verifя успешно добыча микробной метагеномной ДНК из насекомых кишечнике путем подготовки диагностический ПЦР-анализ с помощью эубактериальных общие праймеры 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) и 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Установите ПЦР следующим образом:
- Установка 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1х буфера, 1,5 мМ MgCl 2, 10 мМ четыре дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), 2,5 ед Taq ДНК-полимеразы, 0,5 мМ каждого праймера и 60 нг экстрагированной ДНК в качестве матрицы.
- Запуск реакции ПЦР с использованием Термоциклер следующим образом: первоначальной денатурации при 94 ° С в течение 3 мин с последующим 35 циклов: 94 ° С в течение 45 секунд, отжиг при 55 ° С в течение 30 сек и удлинение при 72 ° С в течение 1 мин . С помощью окончательной стадией удлинения при 72 ° С в течение 10 мин.
- Убедитесь, успешное ПЦР-амплификации в 1% агарозе бромид этидия (EB) окрашивали гель (растворить 1 г агарозы в 100 мл 1x TAE буфер и пятно с 1 мкл EB). Депозит 5 мкл-гоэ ПЦР продукт + 1 мкл 6x красителем в карманах геля. (1x TAE = 40 мМ Трис-основание, 20 мМ ледяной уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА, доведения рН до 8).
- Запустите гель с помощью 1xTAE буфер на 300 В, 115 мА в течение примерно. 20 мин в камеру электрофореза. Используя гель документации камеру (УФ трансиллюминаторе подключен к цифровой камерой и компьютером) наблюдать гель и сравнить размер вашего конечного продукта с также загруженной маркерный ген; правильного размера ампликонов должны быть примерно 1,5 кб.
- Храните продуктов ПЦР условиях глубокого замораживания, преимущественно -80 ° С, до использования.
5. Разделение-CsCl ДНК Градиент Ультрацентрифугирование
- Подготовьте реагентов для градиентов для ультрацентрифугированием следующим образом:
- Подготовьте М хлорида цезия (CsCl) решение 7,163 постепенно растворяя 603,0 г CsCl в DDH 2 O и заполнить до конечного объема 500 мл.
- Точно деTermine плотность полученного раствора CsCl путем взвешивания 1,0 мл аликвоты по трехзначное баланса по три раза. Это обычно находится в диапазоне от 1,88 и 1,89 г / мл при комнатной температуре.
- Подготовьте градиента буфера (100 мМ Трис, 100 мМ KCl и 1 мМ ЭДТА) путем объединения 50 мл 1 М Трис-HCl (рН 8,0), 1 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8) и 3,75 г KCl в финале Объем 500 мл с использованием DDH 2 O. Фильтр (0,22 мкм) стерилизации и автоклава это решение.
- Разделение ДНК
- Определив индивидуальный концентрацию ДНК обработанных насекомых, измеренную как в пункте 4.3, объединить эти насекомые, соответствующие репликации вместе и нормализации их концентрацию ДНК, чтобы гарантировать, что каждый, одинаково способствует объединенного образца. Конечная концентрация 500-5000 нг ДНК (измерение снова конечной концентрации) подходит для процесса ультрацентрифугирования 21.
- Чтобы настроить градиент среду, смешайте количественных ДНК, градиент буфера апг 4,8 мл 7,163 М раствора CsCl вместе к смешанной объема 6,0 мл в стерильный 15 мл с завинчивающейся крышкой трубки (поколение градиентной смесью среднего ДНК).
- Аккуратно положите подготовленную градиентной смеси среднего ДНК в 5,1 мл ультрацентрифужную пробирку (не заполнять до основания шеи трубки) с помощью шприца и иглы. Избегайте откачки или формирования пузырьков воздуха. Включите по крайней мере одну пустую градиент (используя DDH 2 O вместо ДНК) в каждой центрифуге в качестве опорного градиента.
- Остаток трубки пар в течение 10 мг веса после каждого требуемого градиентной среды помещают в соответствующем ультрацентрифужную пробирку. Закройте трубку с "Tube Топпер" и убедитесь, что уплотнение без утечек по переворачивая пробирку и применения умеренное давление вручную.
- Используйте почти вертикальный ротор с восемью скважин для проведения 5,1 мл ультрацентрифугирования трубки для ультрацентрифугированием. Тщательно закрыть ротора скважин и загрузить ротор в ультрацентрифуге соответствии с маИнструкции nufacturer в. Задайте условия ультрацентрифугирования: спина при 50000 оборотов в минуту (около 177 000 мкг), температура на 20 ° C, и ультрацентрифугированием время работы в течение 40 часов с вакуумом. Выберите максимальное ускорение и замедление без тормоза.
- После завершения, осторожно снимите трубки из ротора центрифуги с помощью щипцов. Поместите их в стойку, не нарушая сформированные градиенты внутри трубок. Обработайте градиентные образцы фракционирования как можно скорее, чтобы свести к минимуму любые диффузии.
- Извлечение ДНК из изопикнических разлученных градиентов путем фракционирования
- Использование точной системой ВЭЖХ насоса проводить фракционирование градиента, который в равной степени разделяет сформированные градиенты от способа перемещения верхней ультрацентрифужную пробирку. Подключите ВЭЖХ насос (градиент потока 100%) к бутылке, заполненной 1 л смещения DDH 2 O и плотно прикрепить к трубке открытой насоса с 23 G 1 в иглу шприца. Добавьте достаточное количество бromophenol синюю краску в DDH 2 O, чтобы дать ему темно-синий цвет. Это облегчает визуализацию поверхности раздела между градиентной среды и перемещению DDH 2 O.
- Установка насоса со скоростью потока 850 мкл / мин и не уравновесить систему до одной капли синего цвета DDH 2 O выходит из иглы шприца.
- Тщательно устранить ультрацентрифужную пробирку на зажим стенда и прокалывают нижнюю часть трубки со шприцем 23 G 1 в длинной иглой. Подключение насоса к ультрацентрифужную пробирку, вставив иглу, прикрепленную к трубке насоса в верхней части трубки, и собирать капли из нижней непосредственно в стерильные 1,5 мл микроцентрифужных пробирках. Сбор долю каждые 30 сек, что составляет примерно 425 мкл на фракции и в общей сложности 12 фракций за градиента. Отметим, что последний фракция (фракция 12) обычно содержит смещение DDH 2 O и должен быть отброшен.
- После фракционирования, мнеуверяем плотность всех разделенных фракций с использованием аналитических весов, как указано в шаге 5.1.2.
- Осадок ДНК из каждой фракции (около 425 мкл) сначала добавлением 1 мкл гликогена (20 мкг / мкл в DDH 2 O, в автоклаве) в качестве носителя для осаждения низким количеством ДНК. Смешайте это хорошо инверсией.
- Добавить два тома (850 мкл) раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (растворить 150 г полиэтиленгликоля 6000 и 46,8 г NaCl в DDH 2 O до полного объема 500 мл. Фильтр, стерилизации и автоклав. Раствор ПЭГ составляет 30 % ПЭГ 6000 и 1,6 М NaCl), и снова перемешать путем обращения в десять раз.
- Оставьте пробирки при комнатной температуре в течение не менее двух часов (при необходимости, в течение ночи), чтобы осадить ДНК.
- Центрифуга осадок при 13000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Видимый гранул должны сформировать.
- Осторожно удалите супернатант с помощью пипетки и мыть гранул с 500 мкл 70% этанола. Центрифуга при тех жеусловия для 10 мин снова.
- Осторожно удалите супернатант и воздушно-сухой осадок при КТ в течение 15 мин.
- Растворяться высушенного осадка ДНК в 30 мкл DDH 2 O и хорошо перемешать аккуратным постукиванием трубки. Количественная ДНК в каждой градиента фракции, как в пункте 4.3 Магазин образцы под -20 или -80 ° С, если требуется долгосрочное хранение.
6. ДНК Характеристика по пиросеквенирования
- Убедитесь, что немеченого родной (12 C) ДНК занимает диапазон плотности от 1,705 г / мл до 1,720 мкг / мл, тогда как 13 С-меченого ДНК имеет плотность около 1.720-1.735 г / мл. Обратите внимание, что оба родной и 13 С-меченого ДНК, выделенную из проб окружающей среды может занимать несколько градиентных фракций. Ожидать свет ДНК, связаны с фракций 9-11 и тяжелой ДНК, связаны с фракций 4-6.
- Комбинат ключевых фракций создать единую ", составленный" представительство фракции переменного токаСогласно конкретному пик распределения плотности разрешением ДНК. С другой стороны, другие средства, чтобы изучить, разделенных фракций с помощью изотопного соотношения масс-спектрометрии (IRMS) 22 или метод снятия отпечатков пальцев, например, денатурирующих градиентного гель-электрофореза (DGGE) 23, может помочь выбрать соответствующие фракции перед секвенирования.
- Выполните пиросеквенирования из ПЦР-амплификации бактериальной 16S рРНК из скомпилированных тяжелых, средних и легких фракций каждого отдельного градиента. Используя этот метод, идентификацию линии и относительное обилие метаболически активных видов бактерий в SIP инкубировали образцы можно. Выполнение Пиросеквенирование следующим образом:
- Выполните Amplicon пиросеквенирования использованием Рош 454 FLX инструмент с Titanium реагентов.
- Подготовка штрих ампликоны для мультиплексирования с помощью слияния набор праймеров Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) и Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 продлен с гоэ соответствующие грунтовки адаптер A / B и примеры конкретных мультиплекс идентификаторы (MID).
- Нанесите один шаг ПЦР с 30 циклов, с использованием полимеразы Горячий старт Taq, для создания библиотеки секвенирования.
- Выстраивание последовательности ампликоны, основанные на протоколе с поставщиком, а также расширить читает из прямом направлении (Gray28F), как описано в http://www.researchandtesting.com/ .
7. Пиросеквенирования Анализ данных
- Анализ сырой последовательность чтения, про 454 пиросеквенирования с "количественных проникновения в микробной экологии», QIIME программного обеспечения трубопроводом 26. Выполнять обработку следующим образом:
- Первоначально преобразовать 454-машина-сгенерированный SFF файл FASTA, Кач и Flowgram файлов со сценарием process_sff.py.
- Подтвердить файл сопоставления (на основе check_id_map.py) и назначить Мультиплексированные читает биологической СэмомПлес со сценарием split_libraries.py. Обрезать некачественный заканчивается с выдвижной размером окна 50 и средним качеством среза параметра 25, устранить также короткие неоднозначные последовательности (длина <200 б.п.) из набора данных.
- Удаляет малые данные 454 с помощью denoise_wrapper.py.
- Затем кластер высококачественный читает в оперативные таксономических единиц (ОТЕ), используя несколько метод OTU сбор (pick_otus.py с подобия последовательность 97% отключений).
- Выберите представительство последовательность из каждого ОТУ помощью pick_rep_set.py.
- Связать таксономии для представительного множества последовательности на основе assign_taxonomy.py. Используйте Рибосомная проекта базы данных (RDP) классификатор с минимальным доверием к записи назначения установлен в 0,80.
- Совместите представительство последовательность, против prealigned Greengenes основных 16S последовательностей с помощью алгоритма PyNast (align_seqs.pyс минимальным процент идентичности последовательности установить до 75).
- Кроме того, к истощению химеры из дальнейшего анализа, запустив identify_chimeric_seqs.py.
- Удалить все позиции разрыв (не полезные для филогенетического вывода) с шаблоном lanemask (filter_alignment.py) до построения филогенетического дерева (make_phylogeny.py).
- Наконец, создания таблиц ОТУ с make_otu_table.py, описывая возникновение бактериальных филотипов в пределах каждого образца. Используйте таблицу OTU построить HeatMap для сравнения бактерий численности и активности.
- При необходимости вычислить альфа-и бета разнообразия внутри и между образцами, соответственно. Таким же образом, разрежения кривые (графики разнообразия от глубины секвенирования) и главный Координаты анализ (PCoA) участки, представляющие отношения между микробных сообществ также могут быть получены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для достижения достаточного маркировка метаболически активных бактерий, присутствующих в кишечнике насекомого, насекомое должны быть подвержены 13 C-богатых подложки для оптимизированной ранее периода времени, достаточного, чтобы позволить разделение меченого тяжелой фракции легко от немеченого легче один. В нашем случае 13 С-глюкозы была дополнена в искусственной диете при конечной концентрации 10 мМ в течение 1 дня (фигура 1А). То же самое количество нормальной глюкозы (рис. 1В) подавали в искусственной питательной контрольных насекомых. Как упоминалось ранее, разделение фракций ДНК (тяжелее от светлее) является основой всего процесса. Таким образом, первым шагом должна быть выполнена является экстракция ДНК из интересующей ткани; в этом случае бактериального сообщества, связанный с насекомыми кишечнике. Чтобы подтвердить свои качества важно, чтобы запустить гель-электрофорез, чтобы определить, если таковые вообще ДНК была получена из анализа парамзет ткани. На фиг 1С, то наблюдается сильная полоса геномной ДНК в верхней части изображения, подтверждающего положительный экстракции ДНК. Кроме того, необходимо выполнить диагностический ПЦР, с использованием бактериальных универсальных праймеров, чтобы определить присутствие бактериальной ДНК (фигура 1D). Этот положительный результат важно решить, если дальше продолжать с разделением извлеченного метагеномной ДНК.
После ультрацентрифугирования, когда количество ДНК в каждой выделенной фракции подтверждена, и измерение плотности будет сделано, участок среднюю плотность фракции в г / мл в течение номера фракции подтвердить надлежащее образование градиента в трубках, которые обычно покрывает диапазон плотности от 1,690 (для фракции 12 или 11), чтобы г / мл 1,760 г / мл (Для фракции 1). Количественный Пиросеквенирование выполняется непосредственно на представительных SIP градиентов выявить видовой происхождение и относительное изобилие (рис. 2 13 С-глюкозы поправками образца и немеченного контроля, который служил для профилирования активные группы населения в обществе. После секвенирования, в общей сложности 120 045 высокого качества читает с средняя продолжительность 404 нуклеотидов были получены. Профиль Пиросеквенирование показали повышенный обилие определенных видов, включая Enterococcus и Pantoea в меченого образца (13 С-меченого ДНК, рисунок 3) по сравнению с, что в контрольной группе (12 C управление ДНК, рисунок 3). Поэтому те бактерии считаются метаболически активными, и заслуживают дальнейшего изучения.
Рисунок 1. 13 подача C-глюкоза эксперимент, экстракция ДНК и ПЦР-амплификация бактериальной 16S рРНК ген э. (A) 13 С-глюкозы поправками искусственный диета потребляется Spodoptera littoralis личинок. (B) Родной глюкозы (12 C-глюкоза) с изменениями искусственным кормом, потребляемой личинок из той же партии насекомых, используемых в (А), который служит в качестве контроля . (C) Типичный метагеномных экстракт ДНК из ткани кишечника личинок в С-глюкозы группе лечения 13 и 12 в C-глюкозы контрольной группы. Три биологических повторяет (полоса 1, 2 и 3) включены в каждой группе. М обозначает 1 кб ДНК-маркера. (D) ПЦР-амплификации с универсальным набором праймеров бактериальной генерирует правильные генных продуктов 1,5 кб 16S рРНК с помощью извлеченной метагеномных ДНК в качестве матрицы. Дорожки 1 является положительный контроль ПЦР. Дорожка 2 и 3 представляют 13 С-глюкозы обработанного образца и контроля С-глюкозы 12, соответственно. JPG "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Набросок эксперимента Pyro-SIP с участием плотности CsCl градиента ультрацентрифугирование и фракции характеристику с пиросеквенирования отделенной ДНК. H = выше изобилие, L = ниже изобилие. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Бактериальный разнообразие и относительное изобилие в тяжелых фракций родной глюкозы подается личинок (12 C-контроль ДНК) и 13 С-глюкозы поступает личинок (13 С-меченого ДНК)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кишечник большинства насекомых таит в себе богатую и сложную микробное сообщество; обычно 10 7 -10 9 прокариотических клеток подать там, превосходящими собственные клетки хозяина в большинстве случаев. Таким образом, насекомое кишка "горячей точкой" для разнообразных микробных деятельности, представляющих многие аспекты микробных отношений, от патогенеза обязать взаимности 27. Хотя многие исследования описали удивительное разнообразие насекомых кишки микробных сообществ, характеристика метаболической активности микрофлоры кишечника встречается редко. Стабильный изотоп зондирования подходы предлагают теперь возможность для разграничения активных членов из сложной микробиоты фоне независимо от выращивания и даже в естественных условиях. Мы применили этот ценный инструмент для изучения кишечную флору в модели насекомое системы, хлопок листьев червя (Spodoptera littoralis). Поскольку глюкоза является основным сахара в кишечнике хлопка leafworm, в этой демонстрации мы кормили ЛарVae с искусственным кормом шипами с дополнительной, но физиологической дозе 13 С-глюкозы отслеживать метаболически активных бактерий в кишечной флоре. Идентичный инкубации установлено с родной глюкозы явились важным контроль за последующим сравнением обеспечить, чтобы любые очевидно маркировка нуклеиновой кислоты не был артефактом самого метода, такие как высокая G+ содержания С в ДНК, способствующих разделению. Почти в концентрации месте глюкозы уменьшаются экспериментальный уклон. Другие соображения, связанные с строгой экспериментальной установки исследования ДНК-SIP уже обсуждалось в других 28,29. Кишечнике бактерии обычно являются метаболически очень активным и иметь время короткого поколения по сравнению с микроорганизмами из большинства наземных и водных средах. Таким образом с 24 часами непрерывной подачи вызвало уже значительное маркировку. Следует отметить, что большое количество принимающей геномной ДНК также coextracted из кишечника тканей, которые должны принимать ворассмотрение при обсуждении результатов.
Типичный градиент доля характеристика зависит от методов снятия отпечатков пальцев с низким разрешением, таких как терминал полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (T-ПДРФ), и отнимает много времени строительство библиотеки клон связать данные. И только недавно, что появление высокой пропускной техники секвенирования второго поколения позволяет быстро и экономически эффективно, и детального анализа сложных микробных сообществ. Здесь мы применили эту новую технологию для непосредственного обследования генетический состав градиента плотности фракций и определить метаболически активные бактерии, которые дали повышенную чувствительность по сравнению с гель-электрофореза на основе методов, и способствовало последующему филогенетического классификацию. Сравнивая эквивалентные тяжелые фракции как с 13 С-меченого и 12 образцов С-контроля, мы находим, что Pantoea и Enterococcus стал помечены на изотопа зондирования. Как только Metabolically активные бактерии были выявлены, других видов анализа, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH) с использованием специфических зондов и метагеномных анализ меченого ДНК, выделенной из активных членов сообщества может проводиться для обеспечения полное представление истинных симбионтов, связанных с хозяином . На основе созданной системы здесь, другие 13 С-меченых источники углерода также может быть подан в хосте рассекать бактерии, участвующие в целевой кишки метаболического пути, например, маркировка целлюлозу, чтобы идентифицировать активные бактерии, участвующие в процессе варки хоста. С развитием таких новых подходов, роль насекомых микрофлоры кишечника станут более очевидными, чем в настоящее время.
В совокупности, протокол, описанный здесь представляет собой простой, быстрый, и эффективный метод для определения метаболической активности кишечной микрофлоры, что еще можно было бы применять для оценки конкретной роли bacteальных симбионты в принимающей питания, детоксикации, и обороны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Angelika Berg для лабораторного помощи. Эта работа была поддержана и финансируется Общества Макса Планка и Йена школе микробной коммуникации (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D.
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al.
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
