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Biology

Generalist के पेट में metabolically सक्रिय बैक्टीरिया की पहचान Published: November 13, 2013 doi: 10.3791/50734
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology
* These authors contributed equally

Summary

स्पोडोप्टेरा littoralis के पेट के साथ जुड़े सक्रिय जीवाणु समुदाय, pyrosequencing के लिए युग्मित स्थिर आइसोटोप जांच (एसआईपी) द्वारा निर्धारित किया गया था. इस पद्धति का उपयोग करना, समुदाय के भीतर metabolically सक्रिय बैक्टीरिया की प्रजातियों की पहचान उच्च संकल्प और परिशुद्धता के साथ किया गया था.

Abstract

सबसे कीड़ों की हिम्मत सहजीवी nonpathogenic बैक्टीरिया की जटिल समुदायों द्वारा बसे हुए हैं. ऐसे माइक्रोबियल समुदायों के भीतर यह खानेवाला या पारस्परिक बैक्टीरिया की प्रजातियों की पहचान करने के लिए संभव है. बाद वाले, यानी दूसरों के बीच में, आवश्यक अमीनो एसिड 4 के संश्लेषण सहित, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 2, फेरोमोन उत्पादन 3, साथ ही पोषण बढ़ाने, कीट प्रजनन 1 में मदद करने, कीट को कई कार्यों की सेवा करने के लिए मनाया गया है.

कारण इन संगठनों के महत्व को, कई प्रयासों के व्यक्तिगत सदस्यों के लिए नीचे समुदायों को चिह्नित किया गया है. हालांकि, इन प्रयासों से अधिकांश या तो खेती के तरीकों के आधार पर या अंतिम पहचान के लिए अनुक्रम थे जो -16 rRNA जीन टुकड़े की पीढ़ी पर भरोसा किया गया. दुर्भाग्य से, इन तरीकों केवल आंत में मौजूद बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान की है और कोई informat प्रदान कीसूक्ष्मजीवों की चयापचय क्रिया पर आयन.

एक कीट के पेट में metabolically सक्रिय बैक्टीरियल प्रजातियों को चिह्नित करने के लिए, हम एक सार्वभौमिक सब्सट्रेट के रूप में 13 सी ग्लूकोज रोजगार विवो में (एसआईपी) की जांच कर स्थिर आइसोटोप इस्तेमाल किया. यह उनके विशेष चयापचय गतिविधि को माइक्रोबियल phylogenies का लिंकेज की अनुमति देता है कि एक होनहार संस्कृति से मुक्त तकनीक है. इस तरह के डीएनए और आरएनए के रूप में 5 माइक्रोबियल बायोमार्कर, में substrates से स्थिर, आइसोटोप लेबल परमाणुओं पर नज़र रखने के द्वारा ही संभव है. डीएनए unlabeled (12 सी) एक की तुलना में लेबल डीएनए का घनत्व बढ़ जाती है में 13 सी के समावेश आइसोटोप. अंत में, 13 सी लेबल डीएनए या शाही सेना 12 सी unlabeled इसी तरह एक 6 से घनत्व ढाल ultracentrifugation द्वारा अलग किया जाता है. अलग हो न्यूक्लिक एसिड isotopomers के बाद आणविक विश्लेषण प्रजातियों की चयापचय गतिविधि और पहचान के बीच कनेक्शन प्रदान करता है.

यहाँ, हम एक generalist कीट (हमारे मॉडल प्रणाली), स्पोडोप्टेरा littoralis (लेपिडोप्टेरा, Noctuidae) के पेट में metabolically सक्रिय बैक्टीरिया विशेषताएँ इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल उपस्थित थे. डीएनए की वंशावली विश्लेषण कीट आंत जीवाणु समुदाय की पहचान में उच्च संकल्प और सटीक अनुमति दी है जो pyrosequencing, उपयोग किया गया था. मुख्य सब्सट्रेट के रूप में, 13 सी लेबल ग्लूकोज प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था. सब्सट्रेट एक कृत्रिम आहार का उपयोग कीड़ों को खिलाया गया था.

Introduction

कीट बैक्टीरियल सहजीवी संघों कीट प्रजातियों 7 की एक बड़ी संख्या के लिए जाना जाता है. इन सहजीवी संघों में सूक्ष्मजीवों कीड़ों की वृद्धि और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. रोगाणुओं होस्ट करने के लिए कीट आवश्यक अमीनो एसिड 4 के संश्लेषण सहित प्रजनन 1, फेरोमोन जैवसंश्लेषण 3, पोषण, और दुर्गम भोजन के पाचन के लिए योगदान करने के लिए दिखाया गया है. पेट बैक्टीरियल संघों की विशाल विविधता के बावजूद बहुत कम वे कीट के पक्ष में खेलने के कार्यात्मक भूमिका के बारे में जाना जाता है. केवल दीमक के मामले में, lignocellulose की सहजीवी पाचन प्रोकीर्योट्स, प्रोटोजोआ, और कवक द्वारा किए गए व्यापक रूप से 8,9 अध्ययन किया गया है. इस के विपरीत, थोड़ा generalist कीड़ों का पेट कपास leafworm IE में उपस्थित सहजीवी संघ के बारे में जाना जाता है, स्पोडोप्टेरा सामान्य होने के कारण संयंत्र सेनाओं के उनके लगातार बदलाव करने के लिए, इसके अलावा. LittoralisIST कीटों और उनके पेट जुड़े बैक्टीरियल समुदायों स्थायी रूप से अपने भोजन की आदतों फाइटोकेमिकल्स की अधिकता के साथ पौधों लेने से जुड़ा हुआ नई चुनौतियों को उजागर कर रहे हैं. इस के अलावा, lepidopterans में पेट पर्यावरण, दर असल क्योंकि उच्च पेट पीएच 10 के जीवाणुओं के विकास के लिए एक कठोर वातावरण का प्रतिनिधित्व करता है. विशेष रूप से एस के मामले में littoralis, यह पर्वतमाला अग्रांत्र में 10.5 से, आद्यमध्यांत्र में सीए. 9 लगभग 7 पश्चांत्र 11 में पीएच के लिए. दूसरी ओर, जीवाणु समुदाय एस के पेट के साथ जुड़े littoralis सरल है. तांग, Freitak, एट अल. 12 इस कीट के साथ जुड़े जीवाणु समुदाय के केवल सदस्यों के रूप में 7 अलग अलग प्रजातियों के जीवाणु की कुल से संबंधित 36 phylotypes की एक अधिकतम की सूचना दी. इस के अलावा, कोई जटिल पालन प्रक्रिया प्रयोगशाला में कीट विकास के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, यह और कीट का संक्षिप्त जीवन चक्र बहु ​​- जी की सुविधाenerational पढ़ाई, पेट सूक्ष्म जीव बातचीत के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली में इस प्रजाति बदल रहे हैं.

पीसीआर आधारित अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, कई जीवों (यानी मनुष्य, कीड़े, या समुद्री जीवों) के पेट बायोटा के साथ काम कर पढ़ाई की संख्या बढ़ गई है. इसके अलावा, परिणाम अतीत में के रूप में अलगाव और पेट harbored बैक्टीरिया की खेती से सम्बंधित नहीं हैं. बैक्टीरिया का लगभग 99% कृषि योग्य नहीं हैं और पेट में प्रचलित पर्यावरण की स्थिति का अनुकरण 12 मुश्किल है. पीसीआर का उपयोग करके, -16 rRNA जीन टुकड़े (बैक्टीरिया के बीच एक व्यापक रूप से इस्तेमाल वंशावली जीन मार्कर) चुनिंदा अनुक्रम आंत जीवाणु समुदायों की एक मिश्रित डीएनए टेम्पलेट से परिलक्षित, और क्लोन किया जा सकता है. इस जानकारी के साथ, उपयोगकर्ता सार्वजनिक डेटाबेस 13,14 से अनुक्रम जानकारी पुन: प्राप्त करने के बाद बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान करने में सक्षम है. फिर भी, अनुक्रमण जीवाणु का वर्णन करने के लिए दृष्टिकोणसमुदायों के कारण समुदाय के भीतर व्यक्तिगत प्रजातियों के आंतरिक चयापचय योगदान के बारे में जानकारी की कमी के कारण अपर्याप्त रहते हैं.

स्थिर आइसोटोप (एसआईपी) की जांच एक होनहार संस्कृति से मुक्त तकनीक है. यह अक्सर विशेष चयापचय गतिविधियों से जुड़ा हुआ माइक्रोबियल phylogenies का विश्लेषण करने के लिए पर्यावरण सूक्ष्म जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है. इस तरह के फॉस्फोलिपिड व्युत्पन्न फैटी एसिड, डीएनए, और शाही सेना के रूप में 5 माइक्रोबियल बायोमार्कर, में substrates से स्थिर, आइसोटोप लेबल परमाणुओं नज़र रखने के द्वारा हासिल की है. न्यूक्लिक एसिड पर विचार कर, कार्यप्रणाली घनत्व ढाल ultracentrifugation 6 से unlabeled डीएनए से 13 सी लेबल या डीएनए की जुदाई पर आधारित है. कारण डीएनए लेबल और चयापचय गतिविधि के बीच यह सीधा संबंध के लिए, न्यूक्लिक एसिड की एक बहाव आणविक विश्लेषण प्रजातियों की पहचान करता है और चयापचय गतिविधियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है. इसके अलावा, डीएनए पीएं और pyrosequencing के संयोजन से लागू के रूप मेंPilloni, वॉन Netzer, एट अल. 15, भारी 13 सी लेबल डीएनए अंश में मौजूद बैक्टीरियल प्रजातियों की एक विशेष सरल और संवेदनशील पहचान परमिट. अब तक, इस तकनीक एरोबिक 16,17 और अवायवीय स्थितियों 18,19 के तहत मिट्टी में biogeochemical प्रक्रियाओं में शामिल बैक्टीरियल समुदायों का वर्णन करने के लिए लागू किया गया है. एक nondigestible कार्बोहाइड्रेट के जवाब में मानव आंतों microbiota के विभिन्न वंशावली समूहों की चयापचय गतिविधियों का वर्णन किया जो REICHARDT, एट अल. 5, द्वारा रिपोर्ट के रूप में पर्यावरण विज्ञान के क्षेत्र में उपयोग के अलावा, तकनीक चिकित्सा विज्ञान में लागू किया गया है.

यहाँ हम आंत में पाचन सक्रिय प्रजातियों के जीवाणु के डीएनए 'लेबल' के लिए 13 सी ग्लूकोज का उपयोग करें. ग्लूकोज अपवादों 20 से जाना जाता है, बड़े पैमाने पर Entner-Doudoroff (ईडी) मार्ग के साथ सबसे बैक्टीरियल प्रजातियों द्वारा उपयोग एक चीनी है. यहब्याज की मेटाबोलाइट्स और स्थापित रास्ते साथ कार्बन स्रोत के बीच एक लिंक प्रदान करता है कि एक विश्वसनीय चयापचय जांच के रूप में 13 सी ग्लूकोज के उपयोग को सही ठहराते हैं. वैज्ञानिक सवाल है, अन्य substrates, यानी 13 सी मीथेन, 13 सीओ 2, या एक 13 सीओ 2 माहौल के तहत उठाए गए पौधों पर निर्भर करता है, चयापचय गतिविधियों का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस बिंदु पर, हम एक generalist कीट, अर्थात् एस के पेट जीवाणु समुदाय की उपापचयी लक्षण वर्णन में लागू किया प्रोटोकॉल पेश littoralis (लेपिडोप्टेरा, Noctuidae). इसके अलावा, तकनीक बदले में उच्च संकल्प और परिशुद्धता के साथ कीट आंत जीवाणु समुदाय की पहचान की अनुमति देता है जो pyrosequencing, करने के लिए मिलकर किया गया था. मुख्य सब्सट्रेट के रूप में, 13 सी लेबल ग्लूकोज प्रयोगों के दौरान उपयोग किया गया था.

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Protocol

1. कीट पालन

  1. खरीद या स्पोडोप्टेरा के अंडे चंगुल प्राप्त अपने खुद के पालन से littoralis. अंडे सेने तक कमरे के तापमान (आर टी) में बाँझ पेट्री डिश में उन्हें बनाए.
  2. के रूप में निम्नानुसार पालन कीड़ों के लिए कृत्रिम आहार तैयार:
    1. पानी की 100 मिलीलीटर में रातोंरात 500 ग्राम जमीन सफेद सेम भिगोएँ.
    2. एच 2 ओ आसुत 1000 मिलीलीटर के लिए 9.0 ग्राम एस्कॉर्बिक एसिड और 75 ग्राम अगर जोडें और बाद में यह फोड़ा.
    3. मिश्रण को ठंडा करने के लिए करते हैं और यह (एक सफेद मोमी ठोस मिश्रण करने के लिए) solidifies जब उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  3. रोशनी के 16 घंटे और अंधेरे की 8 घंटे के साथ एक लंबा दिन के शासन के तहत एक साफ प्लास्टिक का डिब्बा और 23-25 ​​डिग्री सेल्सियस पर कृत्रिम आहार पर पीछे उन्हें नव रची लार्वा स्थानांतरण. लार्वा सभी छह लार्वा instars के माध्यम से जाना जब तक हर दिन भोजन में बदलें.

Metabolically सक्रिय आंत जीवाणु के डीएनए में 2. 13 सी लेबलिंग

  1. आसुत और विआयनीकृत पानी (DDH 2 हे) के साथ पूरी तरह से 13 सी लेबल ग्लूकोज के 186.1 मिलीग्राम भंग करने और एसआईपी प्रयोग के लिए कृत्रिम आहार के 100 ग्राम के साथ अच्छी तरह से मिश्रण. कृत्रिम आहार में 10 मिमी के अंतिम 13 सी ग्लूकोज एकाग्रता सुनिश्चित करें. यह एस के पेट में में सीटू ग्लूकोज एकाग्रता mimics शाओ एट अल के अनुसार कपास के पौधों पर littoralis लार्वा खिला. (प्रस्तुत).
  2. स्थानांतरण 9-15 ताजा 13 सी ग्लूकोज युक्त बाँझ प्लास्टिक पेट्री डिश (पेट्री डिश प्रति एक लार्वा) को पालन बॉक्स से स्वस्थ दूसरा instar लार्वा कृत्रिम आहार नुकीला. वर्णित के रूप में नियंत्रण समूह के भोजन के लिए, देशी ग्लूकोज (12 सी ग्लूकोज) का एक ही राशि युक्त कृत्रिम आहार का प्रयोग करें.
  3. ऊष्मायन अवधि (1 दिन) के दौरान अक्सर कृत्रिम आहार नवीनीकृत. 1.3 चरण में के रूप में पालन शर्तों का उपयोग करें.
  4. बाद में प्रसंस्करण (डीएनए निष्कर्षण) के लिए प्रत्येक उपचार से नौ लार्वा लीजिए. प्रत्येकतीन व्यक्तियों द्वारा गठित की है दोहराने; उपचार अनुसार कम से कम तीन प्रतिकृति बनाते हैं.

3. कीट विच्छेदन

  1. स्वच्छ और इथेनॉल 70% (उपकरण = Vannas कैंची, संदंश और ठीक डिस्पोजेबल ब्लेड के साथ स्केलपेल) के साथ काम की शुरुआत में विदारक उपकरण कीटाणुरहित.
  2. एक नरम संदंश के साथ कीड़े लो और आसुत जल से अल्पज्ञता उनकी त्वचा धो लो. उन्हें anesthetize के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें.
  3. अब भी उन्हें मारने के लिए 1 घंटे के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर जगह उन्हें anesthetized है. कुछ मिनट के लिए इथेनॉल (70%) में उन्हें डुबो कर अल्पज्ञता मृत कीड़े कीटाणुरहित.
  4. 7.4 पीएच को समायोजित, लगभग 15 मिलीलीटर 1x पीबीएस के एक बाँझ पेट्री डिश (1XPBS = 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 4.3 मिमी ना 2 4 HPO, 1.47 मिमी के.एच. 2 पीओ 4 पर जमा के एक मात्रा में कीट विच्छेदन प्रदर्शन , आटोक्लेव). पूरी तरह से solut में डूबे पूरे कीट शरीर होने के बारे में सुनिश्चित होपूरे विदारक अवधि के दौरान आयन.
  5. सिर पर शुरू और गुदा पर खत्म, सही और कीट के बाएँ पक्षों के साथ त्वचा में एक चीरा द्वारा विच्छेदन शुरू. पूरे त्वचा, Malpighian नलिकाओं, और वसा शरीर निकालें. पेट खुला काटने से पहले ताजा बफर में बदलें. धारा सामने, मध्य, और पश्चांत्र में पेट की आवश्यकता है. फ्रीजर में ऊतक की दुकान (-80 -20 डिग्री सेल्सियस) तक डीएनए निष्कर्षण

4. डीएनए निष्कर्षण और प्रवर्धन

  1. एक 1.5 मिलीलीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में कीट ऊतक प्लेस और एक शून्य concentrator डिवाइस में 45 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों सूखी. एक बाँझ प्लास्टिक मूसल के साथ सूखे ऊतक क्रश.
  2. मिट्टी डीएनए निष्कर्षण के लिए एक उपयुक्त किट का उपयोग जीनोमिक डीएनए निकालने. किट की प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए सूखी ऊतक स्थानांतरण और निर्माता ने संकेत दिया निर्देशों का पालन करें.
  3. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग अंतिम eluted डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण.
  4. Verifऔर 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3) - Eubacterial सामान्य प्राइमरों 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3 5) का उपयोग कर एक नैदानिक ​​पीसीआर परख की तैयारी द्वारा कीट पेट से माइक्रोबियल metagenomic डीएनए का फिर सफल निष्कर्षण. इस प्रकार के रूप पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें:
    1. 1x बफर, 1.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी चार deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), 2.5 यू Taq का डीएनए पोलीमरेज़, प्रत्येक प्राइमर का 0.5 मिमी और टेम्पलेट के रूप में निकाले डीएनए के 60 एनजी युक्त 50 μl प्रतिक्रिया मिश्रण सेट करें.
    2. 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर 45 सेकंड, annealing के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार:, 35 चक्रों के बाद प्रारंभिक 3 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण इस प्रकार है: एक thermocycler का उपयोग पीसीआर प्रतिक्रियाओं भागो . 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार कदम का प्रयोग करें.
    3. एक 1% agarose में सफल पीसीआर प्रवर्धन ethidium ब्रोमाइड (ईबी) दाग जेल (100 1x TAE बफर के मिलीग्राम और 1μl EB के साथ दाग में agarose की 1 ग्राम भंग) वैद्युतकणसंचलन सत्यापित करें. वीं की जमा 5 μlजेल जेब में 6x लोड हो रहा है डाई की + 1μl ई पीसीआर उत्पाद. (1x TAE पीएच 8 को समायोजित, 40 मिमी Tris बेस, 20 मिमी हिमनदों एसिटिक एसिड, 1 मिमी EDTA =).
    4. सीए के लिए 300 वी, 115 मा 1xTAE बफर का उपयोग कर जेल चला. एक वैद्युतकणसंचलन कक्ष में 20 मिनट. एक जेल प्रलेखन कक्ष (एक डिजिटल कैमरा और कंप्यूटर से जुड़ा यूवी transilluminator) का उपयोग करके जेल का निरीक्षण और भी भरी हुई जीन मार्कर के साथ अपने अंतिम उत्पाद के आकार की तुलना; amplicons का सही आकार लगभग 1.5 केबी का होना चाहिए.
  5. रियायत के तौर पर, गहरी ठंड परिस्थितियों में पीसीआर उत्पाद स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस, उपयोग करें जब तक.

5. डीएनए जुदाई CsCl ढाल ultracentrifugation

  1. इस प्रकार के रूप ultracentrifugation के लिए ढ़ाल के लिए अभिकर्मकों तैयार:
    1. धीरे - धीरे DDH 2 हे में CSCL के 603.0 छ भंग करके एक 7.163 एम सीज़ियम क्लोराइड (CSCL) समाधान तैयार और 500 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा को भरने.
    2. सही रूप में deतीन प्रतियों से एक तीन अंकों संतुलन पर एक 1.0 एमएल विभाज्य वजन द्वारा तैयार CsCl समाधान के घनत्व termine. यह आमतौर पर 1.88 और 1.89 मिलीग्राम / छ से आरटी पर चलता है.
    3. 1 एम Tris-एचसीएल (8.0 पीएच), 0.5 एम EDTA के 1 मिलीलीटर (पीएच 8) और एक फाइनल में KCl की 3.75 ग्राम की 50 मिलीलीटर के संयोजन से ढाल बफर (100 मिमी Tris, 100 मिमी KCl और 1 मिमी EDTA) तैयार करें DDH 2 ओ का प्रयोग कर 500 मिलीलीटर की मात्रा (0.22 मीटर) तक इस समाधान बाँझ और आटोक्लेव.
  2. डीएनए जुदाई
    1. बिंदु 4.3 में के रूप में मापा इलाज कीड़ों की व्यक्तिगत डीएनए एकाग्रता, निर्धारित करने के बाद, एक साथ एक दोहराने के लिए इसी है और हर एक को समान रूप से जमा नमूना के लिए योगदान देता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए उनके डीएनए एकाग्रता मानक के अनुसार उन कीड़ों पूल. डीएनए की 500-5,000 एनजी (फिर अंतिम एकाग्रता को मापने) के अंतिम एकाग्रता ultracentrifugation प्रक्रिया 21 के लिए उपयुक्त है.
    2. ढाल मध्यम स्थापित करने के लिए, मात्रा निर्धारित डीएनए, ढाल बफर एक गठबंधनडी 4.8 एक बाँझ 15 मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब (एक ढाल मध्यम डीएनए मिश्रण की पीढ़ी) में 6.0 मिलीलीटर की एक मिश्रित मात्रा को एक साथ 7.163 एम CsCl समाधान के मिलीलीटर.
    3. ध्यान से एक सिरिंज और सुई का उपयोग (ट्यूब गर्दन के आधार तक भरने में) एक 5.1 मिलीलीटर ultracentrifuge ट्यूब में तैयार ढाल मध्यम डीएनए मिश्रण रखें. किसी भी हवाई बुलबुले पम्पिंग या बनाने से बचें. एक संदर्भ ढाल के रूप में प्रत्येक अपकेंद्रित्र समय में (के बजाय डीएनए के DDH 2 ओ का प्रयोग करके) कम से कम एक रिक्त ढाल शामिल करें.
    4. प्रत्येक आवश्यक ढाल मध्यम बाद वजन के 10 मिलीग्राम के भीतर करने के लिए शेष राशि ट्यूब जोड़े संबंधित ultracentrifuge ट्यूब में भर जाता है. एक "ट्यूब अव्वल" के साथ ट्यूब सील और सील रिसाव से मुक्त ट्यूब inverting और हाथ से मध्यम दबाव लागू करने से है कि यह सुनिश्चित करें.
    5. Ultracentrifugation के लिए 5.1 मिलीलीटर ultracentrifugation ट्यूब कराने के लिए आठ कुओं के साथ एक के पास खड़ी रोटर का प्रयोग करें. ध्यान से रोटर कुओं सील और मा के अनुसार ultracentrifuge में रोटर लोडnufacturer के निर्देश. Ultracentrifugation की स्थिति निर्धारित करें: स्पिन वैक्यूम के साथ 40 घंटे के लिए समय से चल रहे 50,000 (177,000 XG आसपास) आरपीएम, तापमान 20 डिग्री सेल्सियस पर, और ultracentrifugation पर. ब्रेक के बिना अधिकतम त्वरण और मंदी का चयन करें.
    6. समाप्त होने पर, ध्यान से संदंश का उपयोग अपकेंद्रित्र रोटर से ट्यूबों निकालें. ट्यूब के भीतर का गठन ढ़ाल परेशान बिना एक रैक में रखें. जितनी जल्दी हो सके किसी भी प्रसार को कम करने के लिए ढाल fractionation नमूने की प्रक्रिया.
  3. Fractionation द्वारा Isopycnic अलग के अनुपात में से डीएनए की पुनर्प्राप्ति
    1. समान रूप से ultracentrifuge ट्यूब टॉप विस्थापन विधि से बनाई ढ़ाल जो अलग ढाल fractionation, बाहर ले जाने के लिए एक सटीक HPLC पंप प्रणाली का प्रयोग करें. DDH 2 हे 1 एल विस्थापन से भर बोतल के लिए HPLC पंप (100% प्रवाह ढाल) कनेक्ट और कसकर सिरिंज सुई में एक 23 जी 1 के साथ खुला पंप टयूबिंग के लिए देते हैं. पर्याप्त ख जोड़ेंयह एक गहरे नीले रंग देने के लिए DDH 2 ओ के लिए नीले रंग की डाई romophenol. इस ढाल मध्यम और DDH 2 ओ के विस्थापन के बीच इंटरफेस के दृश्य की सुविधा
    2. 850 μl / मिनट की एक प्रवाह दर को पंप सेट और नीले रंग का DDH 2 हे सिरिंज सुई के बाहर उभर की एक बूंद तक प्रणाली संतुलित करना.
    3. ध्यान से एक दबाना खड़ा करने के लिए ultracentrifuge ट्यूब को ठीक करने और लंबी सुई में एक सिरिंज 23 जी 1 के साथ ट्यूब के नीचे घुसाना. ट्यूब के शीर्ष में पंप टयूबिंग से जुड़ी सुई डालने से ultracentrifuge ट्यूब पंप कनेक्ट करें, और सीधे बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में नीचे से बूँदें इकट्ठा. लगभग 425 अंश प्रति μl और ढाल प्रति 12 भागों की कुल राशि, एक अंश हर 30 सेकंड लीजिए. पिछले अंश (अंश 12) आमतौर पर विस्थापन DDH 2 हे होता और त्याग होना चाहिए ध्यान दें.
    4. विभाजन के बाद, मुझेकदम 5.1.2 में वर्णित के रूप में एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर सब अलग भागों का घनत्व asure.
    5. पहले डीएनए की कम राशि की वर्षा के लिए एक कैरियर के रूप में (autoclaved DDH 2 ओ में 20 माइक्रोग्राम / μl,) 1 μl ग्लाइकोजन जोड़कर (425 μl के आसपास) प्रत्येक अंश से डीएनए वेग. उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण.
    6. Polyethylene glycol (खूंटी) समाधान (500 मिलीलीटर की कुल मात्रा को पॉलीथीन ग्लाइकोल 6000 की 150 ग्राम और DDH 2 में NaCl हे की 46.8 छ भंग के दो संस्करणों (850 μl) जोड़ें. तक, बाँझ और आटोक्लेव. खूंटी समाधान 30 है % खूंटी 6000 और 1.6 एम NaCl), और दस बार inverting द्वारा फिर मिश्रण.
    7. (यदि आवश्यक हो तो रातोंरात,) डीएनए वेग को कम से कम दो घंटे के लिए आरटी पर ट्यूब छोड़ दें.
    8. आरटी पर 30 मिनट के लिए 13,000 XG पर अवक्षेप अपकेंद्रित्र. एक दृश्य गोली फार्म चाहिए.
    9. ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें और 70% इथेनॉल के 500 μl के साथ गोली धोने. इसी के तहत अपकेंद्रित्रफिर 10 मिनट के लिए शर्तें.
    10. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 15 मिनट के लिए आरटी पर गोली हवा शुष्क.
    11. DDH 2 हे के 30 μl में सूखे डीएनए गोली redissolve और धीरे ट्यूब दोहन द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. 4.3 चरण स्टोर -20 या -80 डिग्री सेल्सियस के तहत नमूने लंबी अवधि के भंडारण की आवश्यकता है के रूप में प्रत्येक ढाल अंश में डीएनए यों.

6. Pyrosequencing द्वारा डीएनए विशेषता

  1. 13 सी लेबल डीएनए के आसपास 1.720-1.735 मिलीग्राम / छ के एक घनत्व है जबकि unlabeled देशी (12 सी) डीएनए, 1.705 ग्राम / मिलीलीटर से 1.720 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व रेंज में रह रहे हैं सुनिश्चित करें. देशी और पर्यावरण के नमूने से निकाले 13 सी लेबल डीएनए दोनों कई ढाल अंशों तक जा सकता है ध्यान दें. प्रकाश डीएनए भिन्न 9-11 और भिन्न 4-6 के साथ जुड़े होने के लिए भारी डीएनए के साथ जुड़े होने की उम्मीद है.
  2. एक एकल "संकलित" प्रतिनिधि अंश एसी बनाने के लिए कुंजी भिन्न जुडाघनत्व हल डीएनए के विशिष्ट शिखर आवंटन करने के मुताबिक. वैकल्पिक रूप से, इस तरह ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन (DGGE) 23 denaturing के रूप में, समस्थानिक अनुपात मास स्पेक्ट्रोमेट्री (IRMS) 22 या एक फिंगरप्रिंटिंग विधि का उपयोग कर अलग कर अंशों की जांच करने के लिए अन्य साधनों का अनुक्रमण से पहले उचित अंशों का चयन करने में मदद कर सकते हैं.
  3. प्रत्येक व्यक्ति ढाल की संकलित, भारी, मध्यम और प्रकाश भागों से पीसीआर प्रवर्धित जीवाणु -16 rRNA जीन की pyrosequencing प्रदर्शन करना. एसआईपी में इस विधि, वंश की पहचान और metabolically सक्रिय बैक्टीरिया की प्रजातियों के रिश्तेदार बहुतायत का उपयोग करना संभव है नमूने incubated. इस प्रकार के रूप pyrosequencing कार्य करें:
    1. टाइटेनियम अभिकर्मकों के साथ एक रॉश 454 FLX साधन का उपयोग कर amplicon pyrosequencing प्रदर्शन करना.
    2. वें के साथ बढ़ाया 24,25 (- - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3 5) और Gray519r (GTNTTACNGCGGCKGCTG -3 5) Gray28F सेट संलयन प्राइमर का उपयोग कर बहुसंकेतन के लिए बारकोड वाले amplicons की तैयारीई संबंधित प्राइमर अडैप्टर ए / बी और नमूना विशिष्ट मल्टीप्लेक्स पहचानकर्ता (मध्य).
    3. अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए, एक गर्म शुरू Taq पोलीमरेज़ का उपयोग, 30 चक्र के साथ एक एक कदम पीसीआर लागू करें.
    4. आपूर्तिकर्ता प्रोटोकॉल पर आधारित amplicons अनुक्रम, और में वर्णित के रूप में आगे की दिशा (Gray28F) से पढ़ता विस्तार http://www.researchandtesting.com/ .

7. Pyrosequencing डेटा विश्लेषण

  1. कच्चे अनुक्रम "सूक्ष्म पारिस्थितिकी में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि", QIIME सॉफ्टवेयर पाइपलाइन 26 के साथ 454 pyrosequencing द्वारा उत्पन्न पढ़ता का विश्लेषण करें. इस प्रकार के रूप प्रसंस्करण प्रदर्शन:
    1. प्रारंभ में, process_sff.py स्क्रिप्ट के साथ FASTA, qual और Flowgram फाइल करने के लिए 454 मशीन जनित SFF फ़ाइल में परिवर्तित.
    2. (Check_id_map.py पर आधारित) मैपिंग फ़ाइल मान्य है और मल्टिप्लेक्स जैविक सैम को पढ़ता आवंटितमंदिरों split_libraries.py स्क्रिप्ट के साथ. कम गुणवत्ता वाले 50 साल की एक रपट विंडो का आकार और 25 के एक औसत गुणवत्ता कटऑफ पैरामीटर के साथ समाप्त होता है ट्रिम, डाटासेट से कम अस्पष्ट दृश्यों (लम्बाई <200 बीपी) भी खत्म.
    3. Denoise_wrapper.py का उपयोग कर 454 डेटा denoise.
    4. इसके बाद, कई OTU उठा विधि (pick_otus.py 97% अनुक्रम समानता कटौती नापसंद के साथ) का उपयोग उच्च गुणवत्ता परिचालन वर्गीकरण इकाइयों (otus) में पढ़ता क्लस्टर.
    5. Pick_rep_set.py का उपयोग कर प्रत्येक OTU से एक प्रतिनिधि के अनुक्रम उठाओ.
    6. Assign_taxonomy.py पर आधारित प्रतिनिधि अनुक्रम सेट करने के लिए वर्गीकरण निरुपित. 0.80 करने के लिए सेट रिकॉर्ड काम करने के लिए एक न्यूनतम आत्मविश्वास के साथ Ribosomal डाटाबेस परियोजना (आरडीपी) क्लासिफायरफ़ाइल का प्रयोग करें.
    7. एल्गोरिथ्म PyNast (align_seqs.py का उपयोग prealigned Greengenes कोर -16 दृश्यों के खिलाफ सेट प्रतिनिधि अनुक्रम संरेखित75 को न्यूनतम अनुक्रम पहचान प्रतिशत सेट के साथ).
    8. इसके अतिरिक्त, identify_chimeric_seqs.py चलाकर आगे के विश्लेषण से काइमेरा गिरेगा.
    9. पिछले एक वंशावली पेड़ (make_phylogeny.py) के निर्माण के लिए lanemask टेम्पलेट (filter_alignment.py) के साथ (वंशावली निष्कर्ष के लिए उपयोगी नहीं) सभी खाई पदों निकालें.
    10. अंत में, प्रत्येक नमूना भीतर बैक्टीरियल phylotypes की घटना का वर्णन, make_otu_table.py साथ OTU तालिकाओं उत्पन्न करते हैं. बैक्टीरियल बहुतायत और गतिविधि की तुलना के लिए हीटमैप का निर्माण करने OTU तालिका का उपयोग करें.
    11. यदि आवश्यक हो, क्रमशः, नमूने के भीतर और बीच अल्फा और बीटा विविधता की गणना. इसी तरह, विरल करना घटता (अनुक्रमण बनाम गहराई विविधता का रेखांकन) और सूक्ष्म समुदायों के बीच रिश्तों का प्रतिनिधित्व प्रधान निर्देशांक विश्लेषण (PCoA) प्लाट भी तैयार किया जा सकता है.

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Representative Results

कीट पेट में मौजूद metabolically सक्रिय बैक्टीरिया की पर्याप्त लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए, कीट एक unlabeled लाइटर से आसानी से लेबल भारी अंश की जुदाई की अनुमति के लिए पर्याप्त एक पहले से अनुकूलित अवधि के लिए 13 सी युक्त सब्सट्रेट से अवगत कराया जाना चाहिए. हमारे मामले में, 13 सी ग्लूकोज 1 दिन (चित्रा 1 ए) के लिए 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में कृत्रिम आहार में पूरक किया गया था. सामान्य ग्लूकोज (चित्रा 1 बी) की एक ही राशि के नियंत्रण कीटों की कृत्रिम आहार में आपूर्ति की गई थी. पहले उल्लेख किया है, (हल्का से भारी) डीएनए अंशों की जुदाई पूरी प्रक्रिया का आधार है. इसलिए, प्रदर्शन किया जा करने के लिए पहले कदम के हित के ऊतकों से डीएनए की निकासी है, इस मामले में, जीवाणु समुदाय कीट पेट के साथ जुड़े. इसकी गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए यह सब पर किसी भी डीएनए analy से प्राप्त हुई थी, तो यह निर्धारित करने के लिए एक वैद्युतकणसंचलन जेल चलाने के लिए महत्वपूर्ण हैजेड ऊतक. चित्रा 1C में, यह सकारात्मक डीएनए निष्कर्षण की पुष्टि छवि के शीर्ष पर जीनोमिक डीएनए के एक मजबूत बैंड नमूदार है. इसके अलावा, यह जीवाणु के डीएनए (चित्रा -1) की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए, बैक्टीरियल सार्वभौमिक प्राइमरों का उपयोग कर, एक नैदानिक ​​पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है. यह सकारात्मक परिणाम आगे निकाले metagenomic डीएनए की जुदाई के साथ जारी अगर तय करना जरूरी है.

प्रत्येक अलग किया अंश में डीएनए की मात्रा की पुष्टि की है, और घनत्व की माप एक बार किया जाता ultracentrifugation के बाद, सामान्य रूप से शामिल किया गया है जो नलियों में उचित ढाल गठन, पुष्टि करने के लिए जी / एमएल अंश संख्या से अधिक में औसत अंश घनत्व की साजिश एक 1.690 से छ / एमएल (अंश 12 या 11 के लिए) 1.760 ग्राम / मिलीलीटर घनत्व रेंज (अंश के लिए 1). मात्रात्मक pyrosequencing प्रजातियों वंश प्रकट करने के लिए प्रतिनिधि एसआईपी ढ़ाल पर सीधे प्रदर्शन किया और रिश्तेदार बहुतायत (चित्रा 2 है 13 सी ग्लूकोज में संशोधन नमूना और समुदाय में सक्रिय आबादी की रूपरेखा के लिए जो कार्य किया unlabeled नियंत्रण, दोनों से भारी भिन्न अनुक्रम. अनुक्रमण के बाद, 120,045 उच्च गुणवत्ता के कुल 404 nucleotides के एक औसत लंबाई उत्पन्न किया गया साथ पढ़ता है. pyrosequencing प्रोफाइल लेबल नमूना में Enterococcus और Pantoea नियंत्रण समूह (12 सी कंट्रोल डीएनए, चित्रा 3) में उस के साथ तुलना में (13 सी लेबल डीएनए, चित्रा 3) सहित कुछ प्रजातियों में से एक वृद्धि की बहुतायत से पता चला है. इसलिए उन बैक्टीरिया metabolically सक्रिय माना जाता है, और योग्यता आगे अध्ययन कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. 13 सी ग्लूकोज खिला प्रयोग, डीएनए निष्कर्षण और बैक्टीरियल -16 rRNA जनरल की पीसीआर प्रवर्धन ई. (ए) 13 सी ग्लूकोज स्पोडोप्टेरा द्वारा खपत कृत्रिम आहार लार्वा littoralis में संशोधन. (बी) निवासी ग्लूकोज (12 सी ग्लूकोज) के नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जो (ए) में इस्तेमाल किया कीड़ों का एक ही बैच से लार्वा से भस्म कृत्रिम आहार संशोधन 13 सी ग्लूकोज इलाज समूह में और 12 सी ग्लूकोज नियंत्रण समूह में लार्वा के पेट ऊतक से. (सी) विशिष्ट metagenomic डीएनए निकालने. तीन जैविक प्रतिकृति (लेन 1, 2 और 3) प्रत्येक समूह में शामिल किए गए हैं. एम 1 केबी डीएनए मार्कर के लिए खड़ा है. (डी) पीसीआर प्रवर्धन एक सार्वभौमिक बैक्टीरियल प्राइमर सेट टेम्पलेट के रूप में निकाला metagenomic डीएनए का उपयोग करके सही 1.5 केबी -16 rRNA जीन उत्पादों उत्पन्न करता है. 1 गलियों पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण है. लेन 2 और 3 क्रमश: 13 सी ग्लूकोज इलाज नमूना और 12 सी ग्लूकोज नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं. तस्वीरें "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. अलग किया डीएनए की pyrosequencing साथ CsCl घनत्व ढाल ultracentrifugation और अंश लक्षण वर्णन शामिल आतिशबाज़ी एसआईपी प्रयोग की रूपरेखा. एच उच्च बहुतायत, एल = कम बहुतायत. = बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. बैक्टीरियल विविधता और देशी ग्लूकोज खिलाया लार्वा (12 सी नियंत्रण डीएनए) और 13 सी ग्लूकोज खिलाया लार्वा (13 सी लेबल डीएनए) की भारी भागों में रिश्तेदार बहुतायत./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

सबसे कीड़ों का पेट एक अमीर और जटिल माइक्रोबियल समुदाय बंदरगाहों, आम तौर पर 10 7 -10 9 प्रोकार्योटिक कोशिकाओं ज्यादातर मामलों में मेजबान की अपनी कोशिकाओं outnumbering, वहाँ दर्ज. इस प्रकार, कीट पेट पारस्परिक 27 बाध्य करने के रोगजनन से माइक्रोबियल रिश्तों के कई पहलुओं का प्रतिनिधित्व विविध माइक्रोबियल गतिविधियों के लिए एक "हॉट स्पॉट", है. कई अध्ययनों कीट पेट माइक्रोबियल समुदायों का एक अद्भुत विविधता, का वर्णन किया है हालांकि पेट microbiota के चयापचय गतिविधि के लक्षण वर्णन दुर्लभ है. स्थिर आइसोटोप की जांच के दृष्टिकोण अब खेती के स्वतंत्र और भी विवो में एक जटिल microbiota पृष्ठभूमि से सक्रिय सदस्यों भेद के लिए एक संभावना प्रदान करते हैं. हम एक कीट मॉडल प्रणाली, कपास के पत्ते कीड़ा (स्पोडोप्टेरा littoralis) में पेट microbiota अध्ययन करने के लिए इस महत्वपूर्ण उपकरण लागू होता है. ग्लूकोज कपास leafworm के पेट में प्रमुख चीनी है, इस प्रदर्शन में हम LAR खिलायाएक कृत्रिम आहार के साथ VAE आंत वनस्पति में metabolically सक्रिय बैक्टीरिया को ट्रैक करने के लिए 13 सी ग्लूकोज की एक अतिरिक्त लेकिन शारीरिक खुराक के साथ नुकीला. देशी ग्लूकोज के साथ स्थापित एक समान ऊष्मायन न्यूक्लिक एसिड की कोई स्पष्ट लेबलिंग इस तरह की जुदाई में योगदान करने के लिए डीएनए में उच्च जी सी सामग्री के रूप में इस पद्धति को ही की एक विरूपण साक्ष्य नहीं था, यह सुनिश्चित करने के लिए बाद में तुलना के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण प्रदान की. ग्लूकोज की सीटू एकाग्रता में पास अतिरिक्त प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह कम कर दिया. डीएनए एसआईपी अध्ययन की एक कठोर प्रयोगात्मक स्थापना से संबंधित अन्य कारणों से कहीं 28,29 चर्चा की गई है. आंत जीवाणु सामान्य रूप से पाचन अत्यधिक सक्रिय हैं और सबसे स्थलीय और जलीय वातावरण से सूक्ष्मजीवों की तुलना में कम पीढ़ी का समय है. लगातार खिला इस प्रकार एक 24 घंटा पहले से ही एक महत्वपूर्ण लेबलिंग का कारण बना. मेजबान जीनोमिक डीएनए की एक बड़ी राशि भी में ले जाना चाहिए जो पेट के ऊतकों से coextracted गया था कि नोटविचार के परिणाम की चर्चा करते समय.

ठेठ ढाल अंश लक्षण वर्णन इस तरह टर्मिनल प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (टी RFLP) के रूप में कम संकल्प फिंगरप्रिंटिंग तरीकों पर निर्भर करता है, और डेटा लिंक करने के लिए समय लेने वाली क्लोन पुस्तकालय निर्माण. यह उच्च throughput दूसरी पीढ़ी के अनुक्रमण तकनीक के आगमन के जटिल सूक्ष्म समुदायों के तेजी से, लागत प्रभावी, और विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कि केवल हाल ही में है. यहाँ हम सीधे घनत्व ढाल अंशों की आनुवंशिक संरचना सर्वेक्षण और जेल वैद्युतकणसंचलन आधारित विधियों के साथ तुलना में बढ़ाकर संवेदनशीलता दिया जो metabolically सक्रिय बैक्टीरिया, की पहचान करने के लिए इस नई तकनीक लागू है, और बाद में phylogenic वर्गीकरण में मदद की. 13 सी लेबल और 12 सी नियंत्रण के नमूने दोनों से बराबर भारी अंशों की तुलना करके, हम Pantoea और उदर की जांच कर आइसोटोप पर लेबल बन गए हैं. एक बार Metabolically सक्रिय बैक्टीरिया की पहचान की गई है, इस तरह के विशेष जांच और लेबल डीएनए के metagenomic विश्लेषण सक्रिय समुदाय के सदस्यों से बरामद उपयोग कर स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति (मछली) के रूप में अन्य विश्लेषण मेजबान के साथ जुड़े सच symbionts में एक व्यापक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए आयोजित किया जा सकता है . यहां स्थापित प्रणाली के आधार पर, अन्य 13 सी लेबल कार्बन सूत्रों ने यह भी मेजबान पाचन प्रक्रिया में शामिल सक्रिय बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए सेलूलोज़ लेबलिंग, उदाहरण के लिए, लक्षित पेट चयापचय मार्ग में शामिल बैक्टीरिया काटना मेजबान में खिलाया जा सकता है. इस तरह के नए तरीकों के विकास के साथ, कीट पेट microbiota की भूमिका वर्तमान की तुलना में अधिक स्पष्ट हो जाएगा.

सामूहिक रूप से, यहां वर्णित प्रोटोकॉल आगे bacte की विशिष्ट भूमिका का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो पेट microbiota, की चयापचय गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए एक, सरल तेजी से, और प्रभावी विधि का प्रतिनिधित्व करता हैमेजबान पोषण, detoxification, और बचाव में रियाल symbionts.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम प्रयोगशाला सहायता के लिए एंजलिका बर्ग धन्यवाद. इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी और माइक्रोबियल कम्युनिकेशन (JSMC) के लिए जेना स्कूल द्वारा समर्थित और वित्त पोषण किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Mirror Finish Forceps Fine Science Tools 11251-23  
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00  
Speed Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Germany 5305 000.304  
Plastic pestle Carl Roth GmbH Co. Germany P986.1  
NanoVue spectrophotometer GE HealthCare, UK 28-9569-58  
Mastercycler pro/thermocycler Eppendorf Germany 6321 000.515  
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber Biometra Discontinued  
Ultracentrifuge (Optima L-90K) Beckman A20684  
Ultracentrifuge rotor (NVT 90) Beckman 362752  
HPLC pump Agilent 1100  
Quick-Seal, Polyallomer tube Beckman 342412  
Transilluminator UVstar 15  Biometra  

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References

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Shao, Y., Arias-Cordero, E. M.,… More

Shao, Y., Arias-Cordero, E. M., Boland, W. Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose. J. Vis. Exp. (81), e50734, doi:10.3791/50734 (2013).

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