Summary
Die aktive Bakteriengemeinschaft mit dem Darm von Spodoptera littoralis verbunden sind, wurde von stabilen Isotopen-Probing (SIP) zu Pyrosequenzierung gekoppelt bestimmt. Mit dieser Methode wurde die Identifizierung der metabolisch aktiven Bakterienarten innerhalb der Gemeinde mit hoher Auflösung und Genauigkeit durchgeführt.
Abstract
Guts der meisten Insekten werden durch komplexe Gemeinschaften von symbiotischen Bakterien nicht pathogen bewohnt. Innerhalb dieser mikrobiellen Gemeinschaften ist es möglich, kommen oder mutualistic Bakterienarten identifizieren. Letztere sind beobachtet worden, um mehrere Funktionen zu den Insekten dienen, also hilft in Insekten Wiedergabe ein, die Förderung der Immunantwort 2, Pheromonproduktion 3, sowie Ernährung, einschließlich der Synthese von essentiellen Aminosäuren 4, unter anderem.
Aufgrund der Bedeutung dieser Vereine haben viele Anstrengungen unternommen, um die Gemeinden bis zu den einzelnen Mitgliedern zu charakterisieren. Die meisten dieser Bemühungen wurden entweder auf Kultivierungsmethoden basieren oder auf der Erzeugung von 16S-rRNA-Gen-Fragmente, die für die endgültige Identifizierung sequenziert wurden herangezogen. Leider sind diese Ansätze nur dann erkannt, die in der Darmbakterienarten vorhanden und sofern keine informatIonen auf die metabolische Aktivität der Mikroorganismen.
Die metabolisch aktive Bakterienarten im Darm eines Insekts zu charakterisieren, haben wir stabile Isotop Sondierung (SIP) in vivo Anwendung 13 C-Glucose als universelle Substrat. Dies ist eine vielversprechende Kultur freie Technik, die die Verknüpfung der mikrobiellen Stammbäume ihrer besonderen Stoffwechselaktivität ermöglicht. Dies ist durch die Verfolgung stabilen Isotop markierten Atome von Substraten in mikrobiellen Biomarkern, wie DNA und RNA 5 möglich. Der Einbau von 13 C-Isotope in DNA erhöht die Dichte der markierten DNA im Vergleich zum unmarkierten (12 C) ein. Am Ende wird das 13 C-markierte DNA oder RNA, die durch Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation aus dem 12 C-unmarkierten ähnliches 6 getrennt. Anschließende molekulare Analyse der getrennten Nukleinsäure Isotopologen stellt die Verbindung zwischen der metabolischen Aktivität und der Identität der Spezies.
Hier präsentieren wir die verwendet werden, um die stoffwechselaktiven Bakterien im Darm der Insekten-Generalist (unser Modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae) charakterisieren Protokoll. Die phylogenetische Analyse der DNA wurde mit Pyrosequenzierung, die hohe Auflösung und Genauigkeit bei der Identifizierung von Insektendarmbakteriengemeinschaft erlaubt getan. Als Hauptsubstrat wurde 13 C-markierter Glukose in den Experimenten verwendet. Das Substrat wurde auf die Insekten mit einer künstlichen Nahrung gefüttert.
Introduction
Insekten-Bakterien-Symbiose Verbände sind für eine Vielzahl von Insektenarten 7 bekannt. In diesen symbiotischen Verbände, spielen Mikroorganismen eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Entwicklung von Insekten. Mikroben haben gezeigt, Insektenreproduktions 1, Pheromonbiosynthese 3, Ernährung, einschließlich der Synthese von essentiellen Aminosäuren 4 und Verdauung von Lebensmitteln ungeeignet zum Host beitragen. Trotz der Vielzahl von gut-Bakterienverbände, viel weniger ist über die funktionelle Rolle, die sie zugunsten des Insekts spielen, bekannt. Nur im Falle der Termiten, die symbiotische Verdauung von Lignocellulose durch Prokaryonten, Protozoen und Pilzen durchgeführt wird, wurde ausführlich untersucht 8,9. Im Gegensatz dazu, ist wenig über die Symbiose im Darm der Insekten Generalist, dh die Baumwollwurms heute bekannten Spodoptera littoralis. Darüber hinaus wurden aufgrund ihrer häufigen Verschiebung der Wirtspflanzen, allgemeineIST Insekten und deren darmassoziierten Bakteriengemeinschaften sind ständig neue Herausforderungen, um ihre Ernährungsgewohnheiten Verbrauchsanlagen mit einer Vielzahl von sekundären Pflanzenstoffen verknüpft ausgesetzt. Daneben ist die Darmumgebung Lepidoptera, stellt an sich eine raue Umgebung für das Wachstum von Bakterien, die wegen der hohen pH 10 gut. Insbesondere in dem Fall von S. littoralis reicht sie von 10,5 in der Vorderdarm, ca.. 9 im Mitteldarm auf fast 7 im Enddarm 11 pH-Wert. Auf der anderen Seite, die bakterielle Gemeinschaft mit dem Darm von S. verbunden littoralis ist einfach. Tang, Freitak, 12 et al. Berichtet maximal 36 Phylotypen auf insgesamt 7 verschiedene Bakterienarten als die einzigen Mitglieder der Bakteriengemeinschaft mit diesem Insekt verbunden gehört. Neben dieser, ist keine komplizierte Aufzuchtverfahren für die Insektenwachstums im Labor erforderlich. Weiterhin dieser und der kurzen Lebenszyklus der Insekten zu erleichtern Multi-generational Studien, drehen diese Art in ein ideales Modellsystem zur Untersuchung der Darm-Mikroben-Interaktionen.
Mit dem Aufkommen der PCR-basierten Sequenzierungstechnologien, ist die Zahl der Studien, die sich mit Darm Biota von mehreren Organismen (dh Menschen, Insekten oder Meeresorganismen) erhöht. Darüber hinaus sind die Ergebnisse aus der Isolation und Kultivierung der Darm beherbergt Bakterien als in der Vergangenheit unabhängig. Fast 99% der Bakterien nicht kultivierbaren und die Simulation der im Darm herrschenden Umweltbedingungen ist schwierig 12. Durch PCR konnte 16S-rRNA-Gen-Fragmenten (ein weit verbreitetes phylogenetische Marker-Gen unter Bakterien) selektiv aus einer gemischten DNA-Matrize der Darmbakteriengemeinschaften, sequenziert amplifiziert, kloniert. Mit diesen Informationen kann der Benutzer die Bakterienspezies nach Erfassen der Sequenzinformation aus öffentlichen Datenbanken 13,14 identifizieren. Dennoch nähert sich die Sequenzierung, um bakterielle beschreibenGemeinden vor unzureichend aufgrund fehlender Informationen über die Stoffwechseleigenbeitrag der einzelnen Arten innerhalb der Gemeinschaft.
Stabil-Isotopen-Probing (SIP) ist ein vielversprechender Kultur-freie Technik. Es wird oft in der Umweltmikrobiologie zur mikrobiellen Stammbäume, um bestimmte Stoffwechselaktivitäten verknüpft analysieren. Dies wird durch das Verfolgen stabilen Isotop markierten Atome von Substraten in mikrobiellen Biomarkern, z. B. Phospholipid-Fettsäuren abgeleitet sind, DNA, RNA und 5 gelöst. Bei der Betrachtung von Nukleinsäuren wird die Methodik bei der Trennung von 13 C-markierter DNA oder RNA aus der unmarkierten DNA durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation 6 basiert. Wegen dieser direkten Verbindung zwischen der DNA-Markierung und die metabolische Aktivität, einem nachgeschalteten molekularen Analyse der Nukleinsäuren identifiziert die Arten und liefert Informationen über Stoffwechselaktivitäten. Außerdem Kombination von DNA-SIP und Pyrosequenzierung durch AnwendungPilloni, von Netzer, et al. 15. ermöglicht eine besonders einfache und sensitive Identifizierung der Bakterienarten in der schweren 13 C-markierten DNA-Fraktion vor. Bisher wurde diese Technik angewandt, um die Bakteriengemeinschaften in biogeochemischen Prozesse im Boden unter aeroben und anaeroben Bedingungen 16,17 18,19 beteiligt zu beschreiben. Neben der Verwendung in der Umweltwissenschaft ist die Technik, die in den medizinischen Wissenschaften angewendet worden, wie durch Reichardt et al. 5, die die Stoffwechselaktivitäten der verschiedenen phylogenetischen Gruppen der menschlichen Darmflora in Reaktion auf ein unverdauliches Kohlenhydrat beschrieben gemeldet.
Hier verwenden wir 13 C-Glucose auf 'label' die DNA der metabolisch aktiven Bakterienarten im Darm. Glucose ist ein Zucker von den meisten Bakterienarten entlang der weit verbreiteten Entner-Doudoroff (ED)-Weg verwendet, obwohl Ausnahmen sind bekannt 20. Diesrechtfertigt den Einsatz von 13 C-Glucose als zuverlässiger Stoffwechsel Sonde, die eine Verbindung zwischen Stoffwechselprodukte von Interesse und der Kohlenstoffquelle entlang etablierten Wege bietet. Je nach wissenschaftlicher Frage andere Substrate, dh 13 C-Methan, 13 CO 2 oder Pflanzen unter einer 13 CO 2-Atmosphäre angehoben ist, kann verwendet werden, um Stoffwechselaktivitäten zu adressieren.
An dieser Stelle, die im Stoffwechsel Charakterisierung der Bakteriengemeinschaft im Darm der Insekten-Generalist, nämlich S. verwendete Protokoll präsentieren wir littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Darüber hinaus wurde das Verfahren auf Pyrosequenzierung, was wiederum ermöglicht die Identifizierung von Insektendarmbakteriengemeinschaften mit hoher Auflösung und Genauigkeit gekoppelt. Als Hauptsubstrat wurde 13 C-markierter Glukose in den Experimenten verwendet.
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Protocol
1. Insekten-Aufzucht
- Kaufen oder zu erhalten Eier von Spodoptera littoralis Kupplungen von Ihrer eigenen Aufzucht. Pflegen sie in sterile Petrischalen bei Raumtemperatur (RT) bis zum Schlüpfen.
- Bereiten Sie die künstliche Ernährung für die Insekten Aufzucht, wie folgt:
- Soak 500 g gemahlener weißer Bohnen über Nacht in 100 ml Wasser.
- In 9,0 g Ascorbinsäure und 75 g Agar auf 1000 ml destilliertem H 2 O und danach kochen.
- Ließ die Mischung abkühlen, und wenn es sich verfestigt (zu einem weißen wachsartigen Feststoff-Gemisch) lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Übertragen Sie die frisch geschlüpften Larven in einen sauberen Plastikdose ziehen sie sie auf der künstlichen Ernährung bei 23-25 ° C unter einem langen Tag mit 16 Stunden Regime von Beleuchtungs-und 8 Stunden Dunkelheit. Ändern Sie das Essen jeden Tag, bis die Larven durch alle sechs Larvenstadien zu gehen.
2. 13 C-Markierung von DNA in metabolisch aktiven Darmbakterien
- Man löst 186,1 mg voll 13 C-markierter Glucose mit destilliertem und entionisiertem Wasser (ddH 2 O) und gut mischen mit 100 g künstliche Nahrung für die SIP-Experiment. Gewährleisten eine endgültige 13 C-Glucose-Konzentration von 10 mM in der künstlichen Ernährung. Dies ahmt die in situ Glukosekonzentration im Darm von S. littoralis Larven auf Baumwollpflanzen nach Shao et al. (eingereicht).
- Über 9-15 gesunde zweiten Larvenstadium von der Aufzucht-Box, um sterile Plastikpetrischalen (eine Larve pro Petrischale) mit frischen 13 C-Glucose versetzt künstliche Ernährung. Künstliche Ernährung mit der gleichen Menge an nativer Glucose (12 C-Glukose), wie beschrieben, zum Zuführen der Kontrollgruppe.
- Erneuern Sie die künstliche Ernährung häufig während der Inkubationszeit (1 Tag). Verwenden Aufzuchtbedingungen wie in Schritt 1.3.
- Sammeln neun Larven aus jeder Behandlung für die spätere Verarbeitung (DNA-Extraktion). Jederreplizieren, wird von drei Personen besteht, machen mindestens drei Wiederholungen pro Behandlung.
3. Insekten-Dissection
- Reinigen und desinfizieren Sie die Präparationswerkzeuge zu Beginn der Arbeit mit Ethanol 70% (Extras = Vannas Schere, Pinzette und Skalpell mit feinen Einwegklingen).
- Nehmen Sie die Tiere mit einem weichen Pinzette und ihre Haut waschen oberflächlich mit destilliertem Wasser. Legen sie auf Eis für mindestens 30 Minuten, um sie zu betäuben.
- Während noch betäubt Ort sie bei 0 ° C für 1 Stunde um sie zu töten. Desinfizieren Sie die toten Insekten oberflächlich durch Eintauchen in Ethanol (70%) für ein paar Minuten.
- Führen die Insekten Zerlegung in einem Volumen von etwa 15 ml 1x PBS auf eine sterile Petrischale (= 1 × PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4 abgeschieden, der pH-Wert auf 7,4 , Autoklav). Seien Sie sicher, dass das gesamte Insektenkörper vollständig in der SOLUT tauchtIonen während der ganzen Periode Seziersaal.
- Beginnen Sie mit der Präparation durch einen Einschnitt in der Haut an der rechten und linken Seite des Insekts, beginnen auf dem Kopf und endet am After. Entfernen Sie die ganze Haut, Malpighischen und fetten Körper. Ändern Sie die frische Puffer vor Aufschneiden der Darm. Abschnitt der Darm in Vorder-, Mittel-und Enddarm, wenn erforderlich. Speichern des Gewebes in den Gefrierschrank (-80 bis -20 ° C), bis die DNA-Extraktion
4. DNA-Extraktion und Amplifikation
- Platzieren Sie den Insekten Gewebe in einem 1,5 ml sterilen Zentrifugenröhrchen und trocknen alle Proben bei 45 ° C in einer Vakuumkonzentrationsvorrichtung. Crush getrocknet Gewebe mit einem sterilen Kunststoff Stößel.
- Entpacken Sie die genomische DNA mit einem geeigneten Bodensatz für die DNA-Extraktion. Übertragen Sie die trockenen Gewebe in das Reaktionsrohr des Kits und befolgen Sie die Anweisungen, wie vom Hersteller angegeben.
- Bestimmung der Konzentration des letzten eluierten DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers.
- Verifya erfolgreiche Extraktion der mikrobiellen Metagenom-DNA aus dem Insektendarm durch Herstellung eines diagnostischen PCR-Test unter Verwendung eubakteriellen allgemeinen Primer 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) und 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Stellen Sie die PCR-Reaktion wie folgt:
- Set von 50 ul Reaktionsmischung, enthaltend 1x Puffer, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM vier Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs), 2,5 U Taq-DNA-Polymerase, 0,5 mM von jedem Primer und 60 ng der extrahierten DNA als Matrize.
- Führen Sie die PCR-Reaktionen unter Verwendung eines Thermocycler wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 94 ° C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen: 94 ° C für 45 sec, Annealing bei 55 ° C für 30 sec und Verlängerung bei 72 ° C für 1 min . Verwenden eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 min.
- Überprüfen Sie, ob die erfolgreiche PCR-Amplifikation in einem 1% igen Elektrophorese Ethidiumbromid (EB) gefärbten Gel (1 g Agarose in 100 ml 1x TAE-Puffer und Fleck mit 1 ul EB). Kaution 5 ul thE-PCR-Produkt + 1 ul 6x Ladefarbstoff in die Geltaschen. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA, auf pH 8).
- Führen Sie das Gel mit 1xTAE Puffer bei 300 V, 115 mA für ca. 20 min in einem Elektrophorese-Kammer. Durch die Verwendung eines Gel-Dokumentation Kammer (UV-Transilluminator mit einer digitalen Kamera und Computer angeschlossen ist) beobachten das Gel und vergleichen Sie die Größe des Endprodukts mit der ebenfalls geladen Gen-Marker, die richtige Größe der Amplikons müssen von ca. 1,5 kb sein.
- Bewahren Sie die PCR-Produkte unter Tiefkühlbedingungen, bevorzugt -80 ° C bis zur Verwendung.
5. DNA-Separation-CsCl-Ultrazentrifugation
- Bereiten Sie die Reagenzien für die Gradienten für Ultrazentrifugation wie folgt:
- Vorbereitung einer 7.163 M Cäsiumchlorid (CsCl)-Lösung durch Auflösen von 603,0 allmählich g CsCl in ddH 2 O und Auffüllen auf ein Endvolumen von 500 ml.
- Genau demen Sie die Dichte des hergestellten CsCl-Lösung durch Auswiegen einer 1,0-ml-Aliquot einer dreistelligen Waage mit dreifacher Ausführung. Dies reicht für gewöhnlich von 1,88 und 1,89 g / ml bei Raumtemperatur.
- Vorbereitung der Gradienten-Puffer (100 mM Tris, 100 mM KCl und 1 mM EDTA) durch die Kombination von 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) und 3,75 g KCl in einem abschließenden Volumen von 500 ml mit ddH 2 O. Filter (0,22 um) Autoklaven sterilisieren und diese Lösung.
- DNA-Trennung
- Nach der Bestimmung der einzelnen DNA-Konzentration der behandelten Insekten, gemessen wie in Punkt 4.3, bündeln diese Insekten, die einem Replikat zusammen und normalisieren ihre DNA-Konzentration, um sicherzustellen, dass jeder an die Sammelprobe trägt gleichermaßen. Eine Endkonzentration von 500-5000 ng DNA (Messung wieder die endgültige Konzentration) ist geeignet für das Verfahren 21 Ultrazentrifugation.
- Um den Gradienten Medium, kombinieren die quantifizierten DNA, Gradientenpuffer eind 4,8 ml 7,163 M CsCl-Lösung zusammen, um eine gemischte Volumen von 6,0 ml in einem sterilen 15 ml mit Schraubverschluss Rohr (Erzeugung eines Gradienten mittel-DNA-Gemisch).
- Legen Sie das vorbereitete-Medium-DNA-Gemisch in ein 5,1 ml Ultrazentrifugenröhrchen (füllen, bis die Basis des Röhrenhals) mit einer Spritze und Nadel. Vermeiden Pumpen oder Luftblasen bilden. Fügen Sie mindestens ein Leerzeichen Gradienten (mit ddH2O statt DNA) in jedem Zentrifugenlauf als Referenzverlauf.
- Ausgleichsrohr Paare innerhalb von 10 mg Gewicht nach jedem vorgeschriebenen Gradienten Medium in den jeweiligen Ultrazentrifugenröhrchen gefüllt. Verschließen Sie den Schlauch mit einer "Tube Topper" und stellen Sie sicher, dass die Dichtung leckfrei durch Umdrehen der Röhre und mit etwas Druck mit der Hand.
- Verwenden Sie einen nahezu vertikalen Rotor mit acht Vertiefungen zur Aufnahme 5,1 ml Ultrazentrifugation Rohre für die Ultrazentrifugation. Sorgfältig verschließen die Rotor Brunnen und laden den Rotor in der Ultrazentrifuge nach der masteller die Anweisungen. Stellen Sie die Ultrazentrifugation Bedingungen: Schleudern bei 50.000 UpM (etwa 177.000 · g), die Temperatur bei 20 ° C und Ultrazentrifugation Laufzeit für 40 h mit Vakuum. Wählen Sie die maximale Beschleunigung und die Verzögerung ohne Bremse.
- Sobald Sie fertig sind, sorgfältig die Rohre aus dem Zentrifugenrotor mit einer Pinzette entfernen. Legen Sie sie in einem Rack ohne die gebildeten Gradienten in den Rohren zu stören. Verarbeiten der Gradientenfraktionierung Proben so schnell wie möglich, jede Diffusions minimieren.
- Retrieval von DNA aus Isopyknische Getrennt Steigungen von Fraktionierung
- Einen genauen HPLC-Pumpensystem für die Durchführung der Gradientenfraktionierung, die gleichermaßen die gebildeten Gradienten aus der Ultrazentrifugenröhrchen oben Verdrängungsmethode trennt. Schließen Sie die HPLC-Pumpe (100% Durchfluss Gradient) an der Flasche mit 1 l Hubraum gefüllt ddH2O und dicht mit dem offenen Pumpenschlauch befestigen mit einer 23 G-1 in Spritzennadel. Ausreichend bromophenol blauen Farbstoff in die ddH2O es eine dunkelblaue Farbe zu geben. Dies erleichtert die Visualisierung der Grenzfläche zwischen dem Medium und dem Gradienten Verschiebung ddH 2 O.
- Die Pumpe auf einer Strömungsgeschwindigkeit von 850 ml / min äquilibriert und das System, bis ein Tropfen des blau gefärbten ddH 2 O ergibt sich aus der Spritzennadel.
- Sorgfältig fixieren Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Klemmständer und durchbohren die Unterseite des Rohres mit einer Spritze 23 G 1 in langen Nadel. Die Pumpe mit der Ultrazentrifugenröhrchen durch Einführen der Nadel in den Pumpschlauch in das obere Ende des Rohrs befestigt ist, und sammeln Tropfen von unten direkt in sterile 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Sammle ein Bruch alle 30 sec, in Höhe von ca. 425 ul pro Fraktion und insgesamt 12 Fraktionen pro Steigung. Beachten Sie, dass die letzte Fraktion (Fraktion 12) enthält in der Regel die Verschiebung ddH 2 O und sollte verworfen werden.
- Nach der Fraktionierung michasure die Dichte aller getrennten Fraktionen mit einer Analysenwaage, wie in Schritt 5.1.2 erwähnt.
- Ausfällung der DNA aus jeder Fraktion (etwa 425 ul) hergestellt, indem zuerst 1 &mgr; l Glycogen (20 &mgr; g / &mgr; l in ddH 2 O, autoklaviert) als Träger für die Fällung von geringen DNA. Mischen Sie es gut durch Inversion.
- Hinzufügen beiden Volumina (850 ul) von Polyethylenglykol (PEG)-Lösung (150 aufzulösen g Polyethylenglykol 6000 und 46,8 g NaCl in ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 500 ml. Filter, sterilisiert und Autoklaven. Die PEG-Lösung 30 % PEG 6000 und 1,6 M NaCl), und mischen durch Invertieren zehn Mal.
- Lassen Sie die Röhrchen bei RT für mindestens zwei Stunden (falls nötig, über Nacht), um die DNA auszufällen.
- Zentrifugieren der Niederschläge bei 13.000 × g für 30 min bei RT. Ein sichtbares Pellet sollte zu bilden.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und waschen das Pellet mit 500 ul 70% Ethanol. Zentrifugieren unter den gleichenBedingungen für 10 min wieder.
- Vorsichtig den Überstand verwerfen und an der Luft trocknen das Pellet bei RT für 15 min.
- Abgeblasen, und der getrocknete DNA-Pellet in 30 ul ddH 2 O und gut mischen durch leichtes Antippen des Röhrchens. Quantifizierung der DNA in jeder Gradientenfraktion wie in Schritt 4.3 Lagern Sie die Proben unter -20 oder -80 ° C, wenn die Langzeitlagerung erforderlich ist.
6. DNA-Charakterisierung durch Pyrosequenzierung
- Sicherzustellen, dass die unmarkierte nativen (12 C)-DNA nimmt den Dichtebereich von 1,705 g / ml bis 1,720 g / ml, während 13 C-markierten DNA hat eine Dichte von etwa 1,720 bis 1,735 g / ml. Beachten Sie, dass sowohl die native und 13 aus Umweltproben extrahiert C-markierte DNA kann mehrere Gradientenfraktionen überspannen. Erwarten Sie das Licht, mit DNA-Fraktionen 9-11 und der schweren DNA mit 4-6 Fraktionen zugeordnet werden zugeordnet werden.
- Kombinieren Taste, um eine einzelne Fraktionen "kompiliert" repräsentativen Teil ac erstellengemäß der speziellen Spitzen Zuordnung der Dichte-DNA gelöst. Alternativ können andere Mittel, um die getrennten Fraktionen unter Verwendung der Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) 22 oder ein Fingerprinting-Verfahren, wie denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) 23, weiter zu untersuchen entsprechenden Fraktionen vor der Sequenzierung zu wählen.
- Führen Pyrosequenzierung der PCR-amplifizierte bakteriellen 16S rRNA-Gene aus den kompilierten schweren, mittleren und leichten Fraktionen der einzelnen Gradienten. Unter Verwendung dieses Verfahrens Identifizierung der Linie und relative Häufigkeit von metabolisch aktive Bakterienspezies in der SIP-inkubierten Proben möglich ist. Führen Pyrosequenzierung wie folgt:
- Führen Amplikon Pyrosequenzierung mit einem Roche 454 FLX Titanium Reagenzien mit.
- Bereiten Barcode-Amplikons zum Multiplexen mit der Fusion Primersatz Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) und Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 mit th verlängertE jeweiligen Primer-Adapter A / B und probenspezifischen Multiplex-Identifier (MID).
- Tragen Sie eine Ein-Schritt-PCR mit 30 Zyklen, mit einem Hot Start Taq-Polymerase, um die Sequenzierung Bibliothek zu erzeugen.
- Sequenz, die auf der Grundlage der Amplikons Lieferanten-Protokoll, und erweitern die liest aus der Vorwärtsrichtung (Gray28F) wie in http://www.researchandtesting.com/ .
7. Pyrosequenzierung Datenanalyse
- Analysieren Sie die rohen Sequenzabschnitte von der 454 Pyrosequenzierung mit den "quantitativen Einblicke in mikrobielle Ökologie", QIIME Software-Pipeline 26 erzeugt. Führen Sie die Verarbeitung wie folgt:
- Zunächst wandeln das 454-Maschine erzeugten sff Datei auf FASTA, QUAL und Flowgram Dateien mit der process_sff.py Skript.
- Bestätigen Sie die Mapping-Datei (basierend auf check_id_map.py) und weisen Multiplex liest, um biologische samsätze mit der split_libraries.py Skript. Schneiden Sie die Low-Qualität endet mit einem Schiebefenster Größe von 50 und einer durchschnittlichen Qualität-Cutoff von 25, beseitigen auch kurze Sequenzen mehrdeutig (die Länge <200 bp) aus dem Datensatz.
- DeNoise die Daten mit Hilfe der 454 denoise_wrapper.py.
- Als nächstes Cluster die hochwertige liest in operative taxonomischen Einheiten (OTUs) mit dem mehrfachen Kommissionierung OTU-Methode (pick_otus.py mit 97% Sequenzähnlichkeit cut-offs).
- Wählen Sie einen Vertreter aus jeder Sequenz OTU mit pick_rep_set.py.
- Weisen Taxonomie an den Vertreter Sequenz Satzes basierend auf assign_taxonomy.py. Nutzen Sie die ribosomale Database Project (RDP)-Klassifikator mit einem Minimum an Vertrauen auf 0,80 eingestellt Rekordbelegung.
- Richten Sie den Vertreter Folge gegen die vorausgerichteten Greengenes Kern 16S-Sequenzen unter Verwendung des Algorithmus PyNast (align_seqs.py eingestelltmit der minimalen Sequenzidentität zu 75 Prozent Satz).
- Zusätzlich führen Chimären von der weiteren Analyse, indem Sie identify_chimeric_seqs.py.
- Entfernen Sie alle Lücke Positionen vor dem Aufbau einer phylogenetischen Baum (make_phylogeny.py) (nicht nützlich für phylogenetische Rückschluss) mit dem lanemask Vorlage (filter_alignment.py).
- Schließlich erzeugen OTU Tabellen mit make_otu_table.py, die Bakterien Phylotypen innerhalb jeder Probe beschreibt. Verwenden Sie die Tabelle, um die OTU Heatmap für den Vergleich der bakteriellen Hülle und Fülle und Aktivität zu konstruieren.
- Falls erforderlich, berechnen die Alpha-und Beta-Diversität innerhalb und zwischen den Proben. Auf die gleiche Weise können Verdünnung Kurven (Graphen der Vielfalt gegenüber Sequenzierung Tiefe) und Hauptkoordinaten-Analyse (HKoA) Grundstücke, die die Beziehungen zwischen den mikrobiellen Gemeinschaften ebenfalls hergestellt werden.
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Representative Results
Um eine ausreichende Markierung der im Insektendarm vorliegenden metabolisch aktiver Bakterien zu erreichen, muß das Insekt die 13 C-reiche Substrat für einen vorher optimierten ausreichenden Zeitraum, um die Trennung des markierten schwerere Fraktion leicht von der unmarkierten leichtere ermöglichen ausgesetzt werden. In unserem Fall wurde 13 C-Glucose in der künstlichen Ernährung bei einer Endkonzentration von 10 mM für 1 Tag (1A) ergänzt. Die gleiche Menge an normalen Glukose (1B) wurde in der künstlichen Ernährung der Insekten Steuerung zugeführt. Wie bereits erwähnt, ist die Trennung der DNA-Fraktionen (schwereren von den leichteren) der Basis des gesamten Prozesses. Daher ist der erste durchzuführende Schritt der Extraktion der DNA aus dem Gewebe von Interesse, in diesem Fall ist die bakterielle Gemeinschaft mit dem Insektendarm verbunden. Um seine Qualität zu bestätigen ist es wichtig, ein Elektrophorese-Gel laufen gelassen, um festzustellen, ob überhaupt DNA wurde aus der Analyse erhaltenzed Gewebe. In 1C ist beobachtbar eine starke Bande der genomischen DNA an der Oberseite des Bildes Bestätigung der positiven DNA-Extraktion. Darüber hinaus ist es notwendig, eine diagnostische PCR durchzuführen unter Verwendung bakterieller universelle Primer, um die Anwesenheit von Bakterien-DNA (Fig. 1D) zu bestimmen. Dieses positive Ergebnis ist wichtig, um zu entscheiden, ob weitere mit der Trennung der extrahierten DNA metagenomic fortzusetzen.
Nach Ultrazentrifugation, sobald die Menge der DNA in jeder Fraktion getrennt wird bestätigt, und der Messung der Dichte durchgeführt wird, zeichnen die durchschnittliche Bruchdichte in g / ml über Fraktionszahl, um die richtige Steigung Bildung in Rohren, die in der Regel umfasst eine Bestätigung Dichtebereich von 1,690 (für Fraktion 12 oder 11) zu 1,760 g / ml g / ml (Für Fraktion 1). Quantitative Pyrosequenzierung wird direkt auf den repräsentativen SIP-Gradienten durchgeführt, um Arten Linie offenbaren und relative Häufigkeit (Abbildung 2 13 C-Glucose geändert Probe und dem unmarkierten Kontrolle, die für die Profilierung von aktiven Bevölkerung in der Gemeinde serviert. Nach der Sequenzierung liest insgesamt 120.045 hoher Qualität mit einer durchschnittlichen Länge von 404 Nukleotiden erzeugt. Die Pyrosequenzierung Profil zeigten eine erhöhte Häufigkeit bestimmter Arten einschließlich Enterococcus und Pantoea in der markierten Probe (13 C-markierter DNA, Fig. 3) verglichen mit der Kontrollgruppe (12 C Control DNA, Abbildung 3). Daher sollten die Bakterien gelten als metabolisch aktiv und Verdienst weitere Studie.
1. 13 C-Glucose Fütterungsversuch, DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation der 16S rRNA-Gen E. (A) 13 C-Glucose geändert künstliche Ernährung von Spodoptera littoralis-Larven verbraucht. (B) Natives Glucose (12 C-Glukose) geändert künstliche Ernährung von Larven aus der gleichen Charge von Insekten in (A) verwendet, das als Kontrolle dient verbraucht . (C) Typische Metagenom-DNA-Extrakt aus dem Darmgewebe von Larven in der 13 C-Glucose-Behandlungsgruppe und 12 in der C-Glucose-Kontrollgruppe. Drei biologische Replikate (Spur 1, 2 und 3) werden in jeder Gruppe enthalten. M steht für 1 kb DNA-Marker. (D) PCR-Amplifikation mit einem universellen bakteriellen Primer-Set erzeugt die richtige 1,5 kb 16S rRNA-Gen-Produkte mit dem extrahierten Metagenom-DNA als Matrize. Die Bahnen 1 ist die PCR-positiven Kontrolle. Lane 2 und 3 stellen die 13 C-Glucose behandelten Probe und der 12 C-Zuckerkontrolle auf. jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Entwurf einer Pyro-SIP Experiment mit CsCl Dichtegradienten Ultrazentrifugation und Fraktion mit Pyrosequenzierung Charakterisierung der getrennten DNA. H = höhere Fülle, L = untere Hülle und Fülle. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3. Bakterielle Vielfalt und relative Häufigkeit in den schweren Fraktionen des nativen Glukose zugeführt Larven (12 C-Kontroll-DNA) und 13 C-Glucose zugeführt Larven (13 C-markierten DNA)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
Der Darm der meisten Insekten beherbergt eine reiche und komplexe mikrobielle Gemeinschaft, in der Regel 10 7 10 9 prokaryotischen Zellen einlegen dort Überzahl der Gastgeber die eigenen Zellen in den meisten Fällen. Somit ist das Insektendarm eine "Hot Spot" für diverse mikrobielle Aktivitäten, die mehrere Aspekte der mikrobiellen Beziehungen, von der Pathogenese zur mutualism 27 verpflichten. Obwohl viele Studien haben eine erstaunliche Vielfalt an Insektendarm mikrobiellen Gemeinschaften, beschrieben Charakterisierung der Stoffwechselaktivität der Darmflora ist selten. Stabiler Isotope Probing Ansätze bieten jetzt eine Möglichkeit zur Unterscheidung der aktiven Mitglieder aus einem komplexen Hintergrund der Mikrobiota Anbau unabhängig und auch in vivo. Wir wandten diese wertvolles Werkzeug, um die Darmflora in einer Insektenmodellsystem, Baumwollblattwurm (Spodoptera littoralis) zu studieren. Da Glukose ist die dominierende Zucker im Darm von Baumwollwurms, an dieser Demonstration wir die lar eingespeistvae mit einer künstlichen Ernährung gespickt mit einer extra, aber physiologischen Dosis von 13 C-Glucose, die metabolisch aktive Bakterien in der Darmflora zu verfolgen. Eine identische Inkubation mit nativen Glucose fest ein kritischer Kontroll für einen nachfolgenden Vergleich zu gewährleisten, dass jede scheinbare Kennzeichnung Nukleinsäure war kein Artefakt des Verfahrens selbst, wie hohe G+ C-Gehalt der DNA zur Trennung beitragen. Die in der Nähe von in-situ-Konzentration von Glukose zusätzlich reduziert experimentellen Bias. Andere Überlegungen einer strengen experimentellen Aufbau der DNA-SIP-Studie bezogen wurde an anderer Stelle 28,29 diskutiert. Die Darmbakterien sind normalerweise metabolisch sehr aktiv und haben kurze Generationszeit im Vergleich zu den meisten Mikroorganismen aus terrestrischen und aquatischen Umwelt. So wird ein 24-Stunden kontinuierlich Fütterung verursacht bereits eine deutliche Kennzeichnung. Beachten Sie, dass eine große Menge an Wirts genomische DNA wurde auch aus dem Darmgewebe, die Einnahme sollte in extrahierterBerücksichtigung bei der Diskussion der Ergebnisse.
Die typische Gradientenfraktion Charakterisierung stützt sich auf die in niedriger Auflösung Fingerprinting Methoden, wie terminalen Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (T-RFLP), und zeitaufwendig Klonbibliothek Konstruktion, um die Daten zu verknüpfen. Es ist erst vor kurzem, dass das Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnik der zweiten Generation ermöglicht eine schnelle, kosteneffiziente und detaillierte Analyse komplexer mikrobieller Gemeinschaften. Hier verwendeten wir die Technologie, um direkt überblicken die genetische Zusammensetzung der Dichtegradienten-Fraktionen und identifizieren metabolisch aktiven Bakterien, die eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der Gel-Elektrophorese-basierten Methoden gab, und erleichtert spätere phylogenetische Klassifikation. Durch den Vergleich gleichwertig schwere Fraktionen sowohl aus der 13 C-markierten und 12 C-Kontrollproben, finden wir, dass Pantoea und Enterococcus wurde auf Isotop Sondieren. Sobald die Metabolically aktiven Bakterien identifiziert worden sind, können auch andere Analyse, wie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit spezifischen Sonden und Metagenom-Analyse des markierten DNA gewonnen aus der aktiven Community-Mitglieder durchgeführt werden, um einen umfassenden Einblick in die wahren Symbionten mit dem Host verbundene Dienstleistungen zu erbringen . Basierend auf dem bewährten System hier, andere 13 C-markierten Kohlenstoffquellen könnte auch in den Wirt zum Beispiel zugeführt werden, um die Bakterien im Darm gezielt Stoffwechselweg beteiligt sezieren, die Kennzeichnung der Cellulose zu aktiven Bakterien in der Wirtsverdauungsprozess beteiligt sind. Mit der Entwicklung solcher neuen Ansätze, wird die Rolle der Insekten Darmflora deutlicher als derzeit.
Gemeinsam das hier beschriebene Protokoll stellt eine einfache, schnelle und effektive Methode für die Bestimmung der Stoffwechselaktivitäten Darmflora, das könnte weiter angewandt, um die spezifische Rolle der Bak beurteilenrial Symbionten in der Wirts Ernährung, Entgiftung und Verteidigung.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Angelika Berg für Labor-Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und der Jena School for Microbial Communication (JSMC) unterstützt und finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
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