Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Identifisering av metabolsk aktiv bakterier i tarmen av generalist Published: November 13, 2013 doi: 10.3791/50734
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology
* These authors contributed equally

Summary

Den aktive bakterie fellesskap forbundet med tarmen av Spodoptera littoralis, ble bestemt ved stabil-isotop-sentret (SIP) som er koplet til pyrosequencing. Ved hjelp av denne metoden, ble identifisering av metabolsk aktive bakterier arter i samfunnet gjort med høy oppløsning og presisjon.

Abstract

Guts av de fleste insekter er bebodd av komplekse samfunn av symbiotiske nonpathogenic bakterier. Innenfor slike mikrobielle samfunn er det mulig å identifisere commensal eller mutualistic bakteriearter. De sistnevnte, har blitt observert å tjene flere funksjoner i insektet, dvs. hjelpe i insekt reproduksjon 1, øker immunresponsen 2, feromon produksjons 3, samt ernæring, inkludert syntese av essensielle aminosyrene 4, blant andre.

På grunn av betydningen av disse foreningene, er mange anstrengelser er gjort for å karakterisere lokalsamfunnene ned til de enkelte medlemmene. Men de fleste av disse tiltakene ble enten basert på dyrkingsmetoder eller støttet seg på generering av 16S rRNA genet fragmenter som ble sekvensert for endelig identifisering. Dessverre er disse metoder bare identifisert de bakterielle arter som er tilstede i tarmene, og forutsatt ingen information på metabolsk aktivitet av mikroorganismene.

Å karakterisere metabolsk aktive bakteriearter i tarmen av et insekt, brukte vi stabile isotop sondering (SIP) in vivo ansette 13 C-glukose som en universell substrat. Dette er et lovende kultur-fri teknikk som gjør det mulig for koblingen av mikrobielle phylogenies til deres spesielle metabolske aktivitet. Dette er mulig ved å spore stabile isotop-merket atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører, slik som DNA og RNA 5. Inkorporering av 13 C isotoper i DNA øker tettheten av det merkede DNA sammenlignet med umerket (12 C) en. Til slutt er det 13 C-merket DNA-eller RNA separert ved densitets-gradient-ultrasentrifugering fra 12 C-umerket lignende en 6. Etterfølgende molekylær analyse av de separerte nukleinsyre isotopomers gir sammenhengen mellom metabolsk aktivitet og identiteten til arten.

Her presenterer vi en protokoll som brukes til å karakterisere de metabolsk aktive bakterier i tarmen av en genera insekt (vår modellsystem), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). De fylogenetisk analyse av DNA ble utført ved hjelp av pyrosequencing, som tillater høy oppløsning og nøyaktighet i identifisering av insekt tarmbakteriemiljøet. Som viktigste substrat, ble 13 C-merket glukose anvendt i eksperimentene. Substratet ble matet til insektene ved hjelp av en kunstig diett.

Introduction

Insekt-bakterielle symbiotiske foreninger er kjent for et stort antall insektarter 7. I disse symbiotiske foreninger, mikroorganismer spiller viktige roller i vekst og utvikling av insekter. Mikrober har vist seg å bidra til en insekt reproduksjon 1, feromon biosyntese 3, ernæring, inkludert syntese av essensielle aminosyrer til 4, og fordøyelsen av mat utilgjengelige til verten. Til tross for den enorme utvalg av gut-bakteriell foreninger, er mye mindre kjent om den funksjonelle rollen de spiller i favør av insekt. Bare i tilfelle av termitter, det symbiotiske fordøyelsen av lignocellulose utført av prokaryoter, protozoer og sopp, har vært mye studert 8,9. I kontrast til dette, er lite kjent om det symbiotiske foreningen til stede i tarmen av genera insekter dvs. bomull leafworm, littoralis Spodoptera. Videre, på grunn av deres hyppige skift av plante verter, generalist insekter og deres gut forbundet bakteriesamfunn er permanent utsatt for nye utfordringer knyttet til deres matvanene forbruker planter med en mengde fytokjemikalier. Foruten dette, tarmmiljøet i sommerfugler, utgjør i seg selv et barskt miljø for vekst av bakterier på grunn av den høye pH 10 tarmen. Spesielt i tilfelle av S. littoralis, varierer det fra 10,5 i forutgående, ca. 9 i midgut til pH nesten 7 i hindgut 11. På den annen side, den bakterielle fellesskap forbundet med tarmen S. littoralis er enkel. Tang, Freitak, et al. 12. rapportert maksimalt 36 phylotypes hører til totalt 7 forskjellige bakteriearter som bare medlemmer av bakterie fellesskap forbundet med dette insekt. I tillegg til dette, er ikke noe komplisert oppdrett prosedyre kreves for insektvekst i laboratoriet. Videre er dette og den korte levetid av insekt lette multi-generational studier, snu denne arten til en ideell modell for å studere gut-mikrobe interaksjoner.

Med bruk av PCR-basert sekvensering teknologier, har antall studier som omhandler gut biota av flere organismer (dvs. mennesker, insekter, eller marine organismer) økt. Videre resultatene er uavhengige fra isolasjon og dyrking av tarm næret bakterier som i det siste. Nesten 99% av bakterier er ikke dyrkbar og simulering av miljøforholdene som råder i tarmen er vanskelig tolv. Ved hjelp av PCR, kunne 16S rRNA genet fragmenter (et mye brukt fylogenetisk gente blant bakterier) selektivt forsterket fra en blandet DNA mal av gut bakteriesamfunn, sekvensert, og klonet. Med denne informasjonen, er brukeren i stand til å identifisere de bakteriearter etter henting sekvensen informasjon fra offentlige databaser 13,14. Likevel nærmer seg sekvensering for å beskrive bakteriellsamfunnene fortsatt utilstrekkelig på grunn av manglende informasjon om den iboende metabolske bidrag av de enkelte arter i samfunnet.

Stabil-isotop sondering (SIP) er en lovende kultur-fri teknikk. Det er ofte brukt i miljømikrobiologi å analysere mikrobielle phylogenies knyttet til bestemte metabolske aktiviteter. Dette oppnås ved å spore stabile isotop-merket atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører som fosfolipid-avledede fettsyrer, DNA og RNA 5. Ved vurdering av nukleinsyrer, er metoden basert på separasjon av 13C-merket DNA eller RNA fra umerket DNA med densitet gradient-ultrasentrifugering 6.. På grunn av den direkte forbindelse mellom DNA-etikett og metabolske aktivitet, en nedstrøms molekylær analyse av nukleinsyrene identifiserer arten og gir informasjon om metabolske aktiviteter. Videre kombinasjon av DNA-SIP og pyrosequencing som anvendes avPilloni, von Netzer, et al. 15, tillater en særlig enkel og sensitiv identifisering av bakterielle arter tilstede i den tunge 13 C-merket DNA-fraksjon. Inntil nå, har denne teknikken er brukt for å beskrive de bakteriesamfunn involvert i biogeokjemiske prosesser i jord under aerobe 16,17 og anaerobe forhold 18,19. I tillegg til bruk i miljø, har teknikken blitt anvendt i medisinsk vitenskap som rapportert av Reichardt, et al. Fem, som beskrev de metabolske aktiviteter av forskjellige fylogenetiske grupper av den menneskelige tarmfloraen som reaksjon på et ikke-fordøyelig karbohydrat.

Her benyttes 13C-glukose til å "label" DNA av metabolsk aktive bakteriearter i tarmen. Glukose er en sukker benyttes av de fleste bakterielle arter langs den utbredte Entner-Doudoroff (ED) veien, selv om unntak er kjent 20. Detterettferdiggjør bruk av 13C-glukose som en pålitelig metabolsk sonde som gir en kobling mellom metabolitter av interesse og karbonkilden langs etablerte veier. Avhengig av den vitenskapelig spørsmålet andre substrater, dvs. 13 C-metan, 13 CO 2 eller planter hevet under en 13 CO2 atmosfære, kan brukes til å adressere metabolske aktiviteter.

På dette punktet, presenterer vi protokollen brukt i metabolsk karakterisering av tarmen bakteriell fellesskap av en generalist insekt, nemlig S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Videre ble teknikk koplet til pyrosequencing, som igjen tillater identifisering av insekt tarmbakterie fellesskap med høy oppløsning og nøyaktighet. Som det viktigste substrat, ble 13 C-merket glukose benyttet under forsøkene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Insect stell

  1. Kjøpe eller få egg klørne til Spodoptera littoralis fra ditt eget oppdrett. Holde dem i sterile petriskåler ved romtemperatur (RT) før klekking.
  2. Forbered kunstig diett for insekter oppdrett som følger:
    1. Sug 500 g malte hvite bønner over natten i 100 ml vann.
    2. Til 9,0 g askorbinsyre og 75 g agar i 1000 ml destillert H2O, og deretter koke den.
    3. La blandingen avkjøles, og når det størkner (til et hvitt voksaktig faststoff-blanding) oppbevares ved 4 ° C inntil bruk.
  3. Overfør nylig klekket larvene til en ren plast-boks og bak dem på kunstig diett på 23 til 25 ° C under en lang-dagers regime med 16 timers belysning og 8 timers mørke. Endre maten hver dag før larvene gå gjennom alle seks larve instars.

2. 13 C-merking av DNA i metabolsk aktiv tarmbakterier

  1. Løs opp 186,1 mg av fullt 13 C-merket glukose med destillert og avionisert vann (DDH 2 O) og bland det godt med 100 g av kunstig diett for SIP-eksperimentet. Sikre en endelig 13 C-glukosekonsentrasjon på 10 mM i kunstig diett. Dette etterligner in situ glukosekonsentrasjonen i tarmen av S. littoralis larver fôring på bomullsplanter i henhold til Shao et al. (sendt).
  2. Transfer 9-15 sunn andre stadiums larver fra oppdrett boksen til steril plast petriskåler (en larve per petriskål) som inneholder fersk 13 C-glukose tilsatt kunstig diett. Bruk kunstig diett inneholdende den samme mengde av nativt glukose (12 C-glukose), som beskrevet, for mating av kontrollgruppen.
  3. Forny den kunstige diett ofte i løpet av inkubasjonstiden (1 dag). Bruk oppdrettsforhold som i trinn 1.3.
  4. Samle ni larver fra hver behandling for senere behandling (DNA-ekstraksjon). Hvertreplikere er konstituert av tre personer; gjøre minst tre gjentak per behandling.

Tre. Insect Dissection

  1. Rengjør og desinfiser dissecting verktøy i begynnelsen av arbeidet med etanol 70% (verktøy = Vännäs saks, pinsett og skalpell med fine engangsblader).
  2. Ta insektene med en myk tang og vaske huden overfladisk med destillert vann. Plassere dem på is i minst 30 min for å bedøve dem.
  3. Mens fortsatt bedøvet sted dem ved 0 ° C i 1 time for å drepe dem. Desinfiser de døde insekter overfladisk ved å dyppe dem i etanol (70%) for et par minutter.
  4. Utfør insekt disseksjon til et volum på ca 15 ml av 1 x PBS avsettes på en steril petriskål (1XPBS = 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na HPO 2 4, 1,47 mM KH PO 2 til 4, justere pH til 7,4 , autoklav). Vær sikker på å ha hele insekt kroppen fullstendig oppslukt i solution under hele dissekere perioden.
  5. Begynn disseksjon ved å gjøre et snitt i huden på høyre og venstre side av insektet, starte på hodet og avslutt på anus. Fjern hele huden, Malpighian tubuli, og fett kroppen. Bytt til frisk buffer før du skjærer åpen tarmen. Seksjon tarmen i forgrunnen-, midt-, og hindgut når det er nødvendig. Oppbevar vevet i fryseren (-80 til -20 ° C) til DNA-ekstraksjon

4. DNA Utvinning og Amplification

  1. Plasser insektvevet i et 1,5 ml sterilt sentrifugerør og tørk alle prøvene ved 45 ° C i en vakuum-konsentrator-enheten. Knus tørket vev med en steril plast støter.
  2. Pakk den genomisk DNA ved hjelp av et egnet kit for jord DNA-ekstraksjon. Overfør det tørre vev til reaksjonsrøret av settet og følger instruksjonene som angitt av fabrikanten.
  3. Bestem konsentrasjonen av den siste eluerte DNA ved hjelp av et spektrofotometer.
  4. Verifya vellykket utvinning av den mikrobielle metagenomic DNA fra det insekt tarmen ved å fremstille en diagnostisk PCR-assay ved å bruke eubakterielle generelle primere 27F (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) og 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Sett PCR reaksjon som følger:
    1. Sett en 50 ul reaksjonsblanding inneholdende 1 x buffer, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM fire deoksynukleosid-trifosfater (dNTPs), 2,5 U av Taq-DNA-polymerase, 0,5 mM av hver primer og 60 ng av det ekstraherte DNA som templat.
    2. Kjør PCR-reaksjoner ved hjelp av en thermocycler som følger: initial denaturering ved 94 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 35 sykluser: 94 ° C i 45 sekunder, annealing ved 55 ° C i 30 sek, og forlengelse ved 72 ° C i 1 min . Bruk en endelig forlengelse trinn ved 72 ° C i 10 min.
    3. Verifisere vellykket PCR forsterkning i en 1% agarose elektroforese etidiumbromid (EB) farget gel (oppløse en g agarose i 100 ml 1x TAE buffer og flekken med 1μl EB). Depositum 5 mL av the PCR produkt + 1μl av 6x lasting fargestoff inn i gel lommer. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM iseddik, 1 mM EDTA, juster til pH 8).
    4. Kjør gelen ved hjelp 1xTAE buffer på 300 V, 115 mA for ca. 20 min i en elektroforese kammer. Ved å bruke en gel dokumentasjon kammer (UV transilluminator koblet til et digitalt kamera og datamaskin) observere gel og sammenligne størrelsen på det endelige produktet med også lastet genet markør, den riktige størrelsen på amplicons må være på ca 1,5 kb.
  5. Oppbevar PCR produkter under dype iskaldt forhold, fortrinnsvis -80 ° C, inntil bruk.

5. DNA Separasjon-CsCl Gradient ultracentrifugation

  1. Klargjør reagenser for gradienter for ultracentrifugation som følger:
    1. Tilbered en 7,163 M cesiumklorid (CsCl)-løsning ved gradvis å løse opp 603,0 g CsCl i DDH 2 O og fyller opp til et sluttvolum på 500 ml.
    2. Nøyaktig utelattTermine tettheten av den tilberedte CsCl-løsning ved å veie en 1,0 ml alikvot i et tresifret balanse ved triplikat. Dette varierer vanligvis fra 1,88 og 1,89 g / ml ved romtemperatur.
    3. Klargjør gradient-buffer (100 mM Tris, 100 mM KCl og 1 mM EDTA) ved å kombinere 50 ml av 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml av 0,5 M EDTA (pH 8) og 3,75 g KCl i en endelig volum på 500 ml ved hjelp av DDH 2 O. Filter (0,22 mikrometer) sterilisere og autoklav denne løsningen.
  2. DNA Separasjon
    1. Etter å ha fastslått den individuelle DNA-konsentrasjonen av de behandlede insekter, målt som i punkt 4.3, basseng de insekter som tilsvarer en gjengivelse sammen og normalisere de DNA-konsentrasjonen for å sikre at hver enkelt, bidrar like mye til den sammenslåtte prøven. En sluttkonsentrasjon på 500-5000 ng av DNA (mål på nytt sluttkonsentrasjonen) er egnet for ultrasentrifugeprosessen 21..
    2. For å sette opp gradient medium, kombinere den kvantifiserte DNA, gradient buffer end 4,8 ml av 7,163 M CsCl løsning sammen til en blandet volum på 6,0 ml i et sterilt 15 ml rør med skrukork (generering av en gradient medium-DNA-blanding).
    3. Plasser forsiktig forberedt gradient medium-DNA blandingen i en 5,1 ml ultrasentrifuge-rør (fyll inntil bunnen av røret halsen) med en sprøyte og nål. Unngå å pumpe eller det dannes luftbobler. Ta med minst én blank gradient (med DDH 2 O i stedet for DNA) i hver sentrifuge løp som en referanse gradient.
    4. Balanse rør parvis til i løpet av 10 mg av vekten etter hvert som kreves gradient medium fylles i den respektive ultrasentrifugerør. Forsegl røret med en "Tube Topper" og sørge for at forseglingen er lekkasjefrie ved å snu røret og påføre moderat trykk med hånden.
    5. Bruk en nær vertikal rotor med åtte brønner for å holde 5,1 ml ultra-sentrifuge rør for ultracentrifugation. Nøye forsegle brønner rotor og laste rotoren inn i ultrasentrifuge i henhold til manufacturer instruksjoner. Sett ultra-sentrifuge vilkår: spin på 50000 rpm (rundt 177 000 xg), temperatur på 20 ° C, og ultracentrifugation gangtid for 40 timer med vakuum. Velg maksimal akselerasjon og retardasjon uten brems.
    6. Når fullført, fjern forsiktig rørene fra sentrifugerotoren ved hjelp av tang. Plassere dem i et stativ uten å forstyrre de dannede gradienter innenfor rørene. Behandle gradient fraksjone prøvene så snart som mulig for å minimere diffusjon.
  3. Gjenfinning av DNA fra Isopycnic Separerte overgangar ved fraksjone
    1. Bruk en nøyaktig HPLC pumpesystem for å utføre gradient fraksjonering, noe som like skiller de dannede gradienter fra ultrasentrifugerør øverste forskyvningsmetoden. Koble HPLC-pumpe (100% strømning gradient) til flasken er fylt med en L forskyvning DDH 2 O og tett feste til den åpne pumpeslangen med en 23 G 1 i sprøytenål. Legg tilstrekkelig bromophenol blått fargestoff til DDH 2 O for å gi det en mørk blå farge. Dette muliggjør visualisering av grenseflaten mellom gradient medium og forskyvningen av DDH 2 O.
    2. Sett pumpen til en strømningshastighet på 850 mL / min, og likevekt i systemet inntil en dråpe av det blå-farget DDH 2 O framgår av sprøytenålen.
    3. Fikse forsiktig ultrasentrifugerør til en klemme stativ og stikke hull i bunnen av røret med en sprøyte 23 G 1 i lang nål. Koble pumpen til ultrasentrifugerør ved innsetting av nålen er festet til pumpeslangen inn i toppen av røret, og samle dråper fra bunnen direkte inn i sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør. Samle en brøkdel hver 30 sek, som beløper seg til ca 425 mL per fraksjon og totalt 12 fraksjoner per gradient. Merk at den siste fraksjon (fraksjon 12) inneholder vanligvis forskyvning DDH 2 O og skal kastes.
    4. Etter fraksjonering, measure tettheten av alle fraksjoner ved hjelp av en analytisk balanse som nevnt i punkt 5.1.2.
    5. Felle ut DNA fra hver fraksjon (ca. 425 ul) ved først å tilsette en ul glykogen (20 mg / mL i DDH 2 O, autoklavert) som bærer for utfelling av lav mengde DNA. Bland det godt ved inversjon.
    6. Til to volumer (850 ul) av polyetylenglykol (PEG)-oppløsning (oppløse 150 g av polyetylenglykol-6000 og 46,8 g NaCl i DDH 2 O i et totalt volum på 500 ml. Filter, sterilisere og autoklaven. PEG-løsning er 30 % PEG 6000 og 1,6 M NaCl), og bland igjen ved å snu ti ganger.
    7. La rørene ved romtemperatur i minst to timer (om nødvendig, over natten) for å utfelle DNA.
    8. Sentrifuger utfellinger ved 13.000 xg i 30 min ved RT. En synlig pellet skal danne.
    9. Fjern forsiktig supernatanten med en pipette og vaskes pelleten med 500 pl av 70% etanol. Sentrifuger under sammeforhold for 10 minst en gang til.
    10. Forkaste forsiktig supernatanten og luft-tørke pellet ved RT i 15 min.
    11. Oppløs tørket DNA pellet i 30 mL av DDH 2 O og bland godt ved å banke forsiktig på røret. Kvantifisere DNA i hver gradient fraksjon som i trinn 4.3 Oppbevar prøvene under -20 eller -80 ° C dersom langsiktig lagring er nødvendig.

6. DNA Karakterisering av pyrosequencing

  1. Påse at umerket native (12 C)-DNA opptar tetthetsområdet fra 1,705 g / ml til 1,720 g / ml, mens 13 C-merket DNA har en densitet på rundt 1,720 til 1,735 g / ml. Legg merke til at både nativt og 13C-merket DNA ekstrahert fra miljøprøver kan strekke seg over flere graderte fraksjoner. Expect lyset DNA for å være forbundet med fraksjoner 9-11 og de tunge DNA for å være forbundet med fraksjonene 4-6.
  2. Kombiner viktige fraksjoner for å lage et enkelt "kompilert" representant brøkdel acsnor til den bestemte topp fordeling av tettheten-løst DNA. Alternativt kan andre midler for å undersøke de separerte fraksjoner ved hjelp av isotop-forhold massespektrometri (IRMS) 22 eller et fingeravtrykk metode, for eksempel denaturerende gradient-gelelektroforese (DGGE) 23, bidra til å velge passende fraksjoner før sekvensering.
  3. Utfør pyrosequencing av PCR-forsterket bakterielle 16S rRNA gener fra den kompilerte tunge, middels og lette fraksjoner av hver enkelt gradient. Ved hjelp av denne metoden, identifikasjon av avstamning og relative overflod av metabolsk aktive bakterier arter i SIP ruges prøvene er mulig. Utfør pyrosequencing som følger:
    1. Utfør amplicon pyrosequencing bruker en Roche 454 FLX instrument med Titanium reagenser.
    2. Forbered strekkode amplicons for multipleksing bruker fusjon primer satt Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) og Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 utvidet med the respektive primer Adaptor A / B og prøvespesifikke multiplex identifikatorer (MID).
    3. Påfør en ett-trinns PCR med 30 sykluser under anvendelse av en Hot Start Taq-polymerase, for å generere sekvensbibliotek.
    4. Sekvensere amplicons basert på leverandør protokollen, og forlenge leser fra retning forover (Gray28F) som beskrevet i http://www.researchandtesting.com/ .

7. Pyrosequencing Data Analysis

  1. Analyser rå sekvensen leser generert av 454 pyrosequencing med "kvantitative innsikt i mikrobiell økologi", QIIME programvare rørledning 26. Utføre behandlingen som følger:
    1. I utgangspunktet konvertere 454-maskin-genererte SFF-fil til FASTA, QUAL og Flowgram filer med process_sff.py script.
    2. Validere kartlegging fil (basert på check_id_map.py) og tilordne multiplex leser til biologisk samsipper med split_libraries.py script. Trim lav kvalitet ender med et glidende vindu størrelse på 50 og en gjennomsnittlig kvalitet cutoff parameter av 25, eliminere også korte tvetydige sekvenser (lengden <200 bp) fra datasettet.
    3. Denoise de 454 data ved hjelp av denoise_wrapper.py.
    4. Deretter klynge høy kvalitet leser i operative taksonomiske enheter (Otus) ved hjelp av multippel OTU plukke metoden (pick_otus.py med 97% sekvenslikhet avskjær).
    5. Plukk en representant sekvens fra hver OTU hjelp pick_rep_set.py.
    6. Tildele taksonomi til representanten sekvens sett basert på assign_taxonomy.py. Bruk Ribosom Database Project (RDP) klassifikator med et minimum tillit til posten oppdrag satt til 0,80.
    7. Juster representant sekvens satt opp mot de prealigned Greengenes kjerne 16S sekvenser ved hjelp av algoritmen PyNast (align_seqs.pymed minst sekvensidentitet prosent satt til 75).
    8. I tillegg utarme chimeras fra videre analyser ved å kjøre identify_chimeric_seqs.py.
    9. Fjern alle gap posisjoner (ikke nyttige for fylogenetisk slutning) med lanemask mal (filter_alignment.py) før bygge et fylogenetisk tre (make_phylogeny.py).
    10. Til slutt, generere otu tabeller med make_otu_table.py, beskriver forekomsten av bakterielle phylotypes innenfor hvert av utvalgene. Bruk OTU bordet for å konstruere heatmap for å sammenligne bakterie overflod og aktivitet.
    11. Hvis det er nødvendig, beregn alfa og beta mangfold innen og mellom prøver, henholdsvis. På samme måte, kan vakuum, kurver (grafer av mangfold versus sekvense dybde) og Principal Koordinater Analysis (PCoA) tomter som representerer forholdet mellom mikrobielle samfunn skal også utarbeides.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å oppnå tilstrekkelig merking av metabolsk aktive bakterier tilstede i insekt tarmen, må insektet utsettes for de 13 C-rikt substrat for en tidligere optimalisert periode som er tilstrekkelig til å tillate separasjon av den merkede tyngre fraksjon lett fra den umerkede lysere en. I vårt tilfelle var 13 C-glucose supplert i kunstig diett i en endelig konsentrasjon på 10 mM i 1 time (figur 1A). Den samme mengde av normal glukose (figur 1B) ble levert i kunstig diett av styre insekter. Som nevnt før, er separering av DNA-fraksjoner (tyngre fra lysere) basis av hele prosessen. Derfor er det første trinn som skal utføres ekstraksjon av DNA fra vevet av interesse, i dette tilfellet, den bakterielle fellesskap forbundet med insekt tarmen. For å bekrefte dens kvalitet er det viktig å kjøre en elektroforese-gel for å bestemme om noen i det hele tatt DNA ble oppnådd fra analysezed vev. I figur 1C, er det observeres en sterk band av genomisk DNA ved toppen av bildet som bekrefter de positive DNA-ekstraksjon. I tillegg er det nødvendig å utføre en diagnostisk PCR, ved bruk av bakterielle universalprimerne, for å bestemme nærvær av bakteriell DNA (fig. 1D). Det positive resultatet er viktig å avgjøre om ytterligere fortsette med separasjon av den utpakkede metagenomic DNA.

Etter ultrasentrifugering, når mengden av DNA i hver separerte fraksjon er bekreftet, og måling av tettheten er gjort, plotte den gjennomsnittlige fraksjon densitet i g / ml i løpet fraksjonstall for å bekrefte den riktige gradient dannelse i rør, som normalt omfatter et tettheten varierer fra 1,690 (for fraksjon 12 eller 11) til g / ml 1,760 g / ml (For fraksjon 1). Kvantitativ pyrosequencing utføres direkte på de representative SIP gradienter å avsløre arter avstamning og relativ overflod (figur 2 13 C-glukose endret prøven og den umerkede kontroll, som fungerte for profilering aktive bestander i samfunnet. Etter sekvensering, totalt 120045 høy kvalitet leser med en gjennomsnittlig lengde på 404 nukleotider ble generert. Den pyrosequencing profilen viste en økt mengde av visse arter inkludert Enterococcus og Pantoea i den merkede prøven (13 C-merket DNA, figur 3) i forhold til den i kontrollgruppen (12 C Kontroll DNA, figur 3). Derfor disse bakteriene regnes for å være metabolsk aktiv, og fortjener videre studier.

Figur 1
Figur 1. 13C-glukose foringsforsøket, DNA ekstraksjon og PCR-amplifikasjon av den bakterielle 16S rRNA-gen e. (B) 13 C-glucose endret kunstig diett som forbrukes av Spodoptera littoralis larver. (B) Native glukose (12 C-glucose) endret kunstig diett som forbrukes av larver fra den samme batch av insekter som brukes i (A), som tjener som styre . (C) Typisk metagenomic DNA-ekstrakt fra tarmvevet av larver i 13 C-glukose-behandlingsgruppe, og i det 12 C-glukose-kontroll-gruppen. Tre biologiske replikater (kolonne 1, 2 og 3) er inkludert i hver gruppe. M står for 1 kb DNA-markør. (D) PCR amplifikasjon med en universal bakteriell primer sett genererer de korrekte 1,5 kb 16S rDNA-produkter ved hjelp av den ekstraherte metagenomic DNA som mal. Felt 1 er en PCR-positiv kontroll. Spor 2 og 3 representerer den 13 C-glukose behandlet prøve og 12 C-glukose-kontroll, respektivt. jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Omrisset av en Pyro-SIP eksperiment med CsCl tettshetsgradient ultracentrifugation og brøkdel karakterisering med pyrosequencing av den separerte DNA. H = høyere overflod, L = lavere overflod. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
Figur 3. Bakteriell mangfold og relative overflod i de tunge fraksjoner av den opprinnelige glukose matet larver (12 C-kontroll-DNA), og 13C-glukose matet larver (13 C-merket DNA)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarmen av de fleste insekter havner en rik og kompleks mikrobielle samfunn, vanligvis 10 7 -10 9 prokaryote celler losjere det, outnumbering vertens egne celler i de fleste tilfeller. Dermed er insekt gut en "hot spot" for ulike mikrobielle aktiviteter, som representerer flere aspekter av mikrobielle forhold, fra patogenesen å forplikte mutualism 27. Selv om mange studier har beskrevet en utrolig variasjon av insekt gut mikrobielle samfunn, karakterisering av metabolsk aktivitet av tarmen bakterieflora er sjeldne. Stabile isotoper sondering tilnærminger tilbyr nå en mulighet for å skille de aktive medlemmer fra en kompleks bakterieflora bakgrunn uavhengig av dyrking og selv in vivo. Vi brukte denne verdifullt verktøy for å studere tarmen bakterieflora i et insekt modellsystem, bomull blad ormen (Spodoptera littoralis). Siden glukose er den dominerende sukker i tarmen av bomull leafworm, i denne demonstrasjonen vi matet LARVAE med en kunstig diett tilsatt en ekstra, men fysiologiske dose av 13C-glukose til å spore de metabolsk aktive bakterier i tarmfloraen. En identisk inkubasjon etablert med opprinnelige glukose gitt en kritisk kontroll for påfølgende sammenligning for å sikre at enhver åpenbar merking av nukleinsyre som ikke var en artefakt av metoden i seg selv, for eksempel høy G+ C-innhold i DNA som bidrar til separasjon. Den nesten in situ konsentrasjon av glukose i tillegg redusert eksperimentell bias. Andre hensyn knyttet til en streng eksperimentelt oppsett av DNA-SIP studien har vært diskutert andre steder 28,29. Tarmbakterier som normalt er metabolsk svært aktiv og har kort generasjonstid forhold til mikroorganismer fra de fleste terrestriske og akvatiske miljøer. Dermed en 24 timers kontinuerlig fôring forårsaket allerede en betydelig merking. Legg merke til at en stor mengde av verten genom-DNA ble også coextracted fra tarmvevet, som skal ta oppbetraktning når man diskuterer resultatene.

Den typiske gradient brøkdel karakterisering avhengig lavoppløste fingerprinting metoder, for eksempel terminal begrensning fragment lengde polymorfisme (T-RFLP), og tidkrevende klone bibliotek konstruksjon for å koble dataene. Det er først nylig at bruk av high-throughput andre generasjons sekvensering teknikk muliggjør rask, kostnadseffektiv, og detaljert analyse av komplekse mikrobielle samfunn. Her har vi brukt denne nye teknologien for å direkte kartlegge den genetiske sammensetningen av tettshetsgradient fraksjoner og identifisere metabolsk aktive bakterier, noe som ga økt følsomhet sammenlignet med de gelelektroforesesystemer baserte metoder, og tilrettelagt påfølgende fylogenetiske klassifisering. Ved å sammenligne tilsvarende tunge fraksjoner fra både 13 C-merket og 12 C-kontrollprøver, finner vi at Pantoea og Enterococcus ble merket på isotop sondering. Når metabolically aktive bakterier har blitt identifisert, kan andre analyser som fluorescens in situ hybridisering (FISH) ved hjelp av spesifikke prober og metagenomic analyse av merket DNA utvinnes fra aktive medlemmer bli gjennomført for å gi en helhetlig innsikt i den sanne symbionter forbundet med verten . På grunnlag av den etablerte system her, kan andre 13 C-merkede karbonkilder også bli matet inn i verten for å dissekere bakterier som er involvert i den målrettede tarmen metabolismeveien, for eksempel, merking av cellulose for å identifisere aktive bakterier involvert i verts fordøyelsen. Med utviklingen av slike nye tilnærminger, vil betydningen av insekt gut mikrobiota bli mer tydelig enn i dag.

Kollektivt, protokollen beskrevet her representerer en grei, rask og effektiv metode for å bestemme metabolske aktiviteter av tarmen bakterieflora, noe som ytterligere kan brukes til å vurdere den spesifikke rollen som bakterial symbionter i verts ernæring, avgiftning, og forsvar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Angelika Berg for laboratorie assistanse. Dette arbeidet ble støttet og finansiert av Max Planck Society og Jena School for Microbial Communication (JSMC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Mirror Finish Forceps Fine Science Tools 11251-23  
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00  
Speed Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Germany 5305 000.304  
Plastic pestle Carl Roth GmbH Co. Germany P986.1  
NanoVue spectrophotometer GE HealthCare, UK 28-9569-58  
Mastercycler pro/thermocycler Eppendorf Germany 6321 000.515  
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber Biometra Discontinued  
Ultracentrifuge (Optima L-90K) Beckman A20684  
Ultracentrifuge rotor (NVT 90) Beckman 362752  
HPLC pump Agilent 1100  
Quick-Seal, Polyallomer tube Beckman 342412  
Transilluminator UVstar 15  Biometra  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
  2. Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
  3. Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
  4. Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
  5. Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
  6. Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
  7. Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
  8. Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
  9. Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
  10. Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
  11. Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
  12. Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
  13. Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
  14. Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
  15. Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
  16. Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
  17. Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
  18. Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
  19. Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
  20. Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
  21. Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
  22. Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
  23. Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
  24. Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
  25. Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
  26. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
  27. Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
  28. Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
  29. Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).

Tags

Mikrobiologi Insekter Sequence Analysis genetikk mikrobiologi Bakterier Lepidoptera, Stabil-isotop-sondering (SIP) pyrosekvensering, gut bakterieflora bakterier
Identifisering av metabolsk aktiv bakterier i tarmen av generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA stabile isotoper Verifiserer Bruke<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glukose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shao, Y., Arias-Cordero, E. M.,… More

Shao, Y., Arias-Cordero, E. M., Boland, W. Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose. J. Vis. Exp. (81), e50734, doi:10.3791/50734 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter