Summary
ハスモンヨトウのサキシマスオウノキの腸に関連するアクティブ細菌群集は、ピロシーケンスに結合された安定同位体プロービング（SIP）により決定した。この方法論を使用して、コミュニティ内の代謝的に活性な細菌種の同定は、高分解能かつ高精度に行った。
Abstract
ほとんどの昆虫の根性が共生非病原性細菌の複雑な共同体が生息している。そのような微生物群集内では、相利共生又は細菌種を同定することができる。後者のものは、特に必須アミノ酸4の合成を含む免疫応答2、フェロモン産3、ならびに栄養を、昇圧、 すなわち昆虫再生1に助け、昆虫に複数の機能を果たすことが観察されている。
により、これらの団体の重要性に、多くの努力が、個々のメンバーにまで社会を特徴づけるために行われてきた。しかしながら、これらの努力のほとんどは、いずれかの栽培方法に基づいて、または最終同定のために配列決定した16S rRNA遺伝子断片の生成に依拠した。残念ながら、これらのアプローチは、腸内に存在する細菌種を特定しないのinformatありません微生物の代謝活性へのイオン。
昆虫の腸内で代謝的に活性な細菌種を特徴づけるために、我々は、ユニバーサル基質として13 C-グルコースを用いたin vivoで （SIP）をプロービング安定同位体を使用した。これは彼らの特定の代謝活性のための微生物系統発生の連結を可能にする有望な文化のない手法である。これは、DNAやRNAなどの微生物のバイオマーカー5の中に基質から安定な同位体標識された炭素原子を追跡することが可能である。 13 Cの取り込みは、非標識（12 C）標識されたものと比較してDNAの濃度を増加させるDNAに同位。最後に、13 C-標識されたDNAまたはRNAは、12 C-標識されていない同様のものを6から密度勾配超遠心分離によって分離される。分離された核酸のアイソトポマーのその後の分析は、分子種の代謝活性とアイデンティティとの間の接続を提供する。
ここでは、ジェネラリスト昆虫（我々のモデル系）、 スポドプテラ·リトラリス （ 鱗翅目、ヤガ科 ）の腸内で代謝活性細菌を特徴づけるために使用されるプロトコルを提示する。 DNAの系統解析は、昆虫の腸内細菌集団の同定を高い分解能と精度を可能にピロシーケンスを使用して行った。メイン基板として、13 C-標識されたグルコースは、実験で使用した。基板は、人工飼料を使用して、昆虫に供給した。
Introduction
昆虫、細菌の共生アソシエーションは昆虫種7多数のために知られている。これらの共生協会では、微生物は、昆虫の成長と発展に重要な役割を果たしている。微生物は、必須アミノ酸4の合成、およびホストへアクセスできなく食物の消化を含む昆虫再生1、フェロモン生合成3、栄養に貢献することが示されている。腸の細菌団体の広大な様にもかかわらず、はるかに少ない彼らは昆虫の賛成で遊ぶ機能的役割についてはほとんど知られていない。シロアリのみの場合には、リグノセルロースの共生消化は、原核生物、原生動物、および真菌によって行う、8,9広く研究されている。これとは対照的に、少しはコットンリーフワーム、すなわち 、 ハスモンヨトウのサキシマスオウノキ。また、原因植物宿主の彼らの頻繁なシフトに、一般的なジェネラリスト昆虫の消化管に存在する共生関連についてはほとんど知られていないIST昆虫とその消化管関連細菌群集は永続的にその食性は植物化学物質の過多で植物を消費するにリンクされ、新たな課題にさらされている。この他に、鱗翅目における腸環境は、 それ自体が高いため、腸pH 10の細菌の増殖のための過酷な環境を表す。特にSの場合、 サキシマスオウノキ 、それはカリフォルニア 、前腸内の10.5の範囲である。腸内の9のpHにほぼ7後腸11。一方、細菌群集はSの腸に関連するサキシマスオウノキは簡単です。唐、Freitak ら 12は、この虫に関連する細菌群集の唯一のメンバーとして7種類の細菌種の合計に属する36系統型の最大値を報告した。この他にも、複雑な飼育手順は、実験室での昆虫成長のために必要ありません。さらに、この昆虫の短いライフサイクルは、マルチグラムを容易にするenerational研究、腸管微生物の相互作用を研究するための理想的なモデルシステムにこの種を回す。
PCRベースのシーケンシング技術の出現により、いくつかの生物（ すなわち 、人間、昆虫、または海洋生物）の腸の生物相を扱う多くの研究が増加している。また、結果は、従来のように腸保有菌の分離と栽培から独立しています。細菌のほぼ99％が耕作されず、腸内で優勢な環境条件のシミュレーションが12困難である。 PCRを用いて、16S rRNA遺伝子断片（細菌の間で広く使用される系統発生遺伝子マーカー）を選択的に、腸管細菌群集との混合DNA鋳型から増幅され、配列決定し、クローン化することができる。この情報により、ユーザは、公開データベース13,14からの配列情報を取得した後、細菌の種を同定することができる。それにもかかわらず、配列決定は、細菌を記述するために近づくコミュニティは、コミュニティ内の個々の種の本質的な代謝の貢献に関する情報の不足のために不十分なままです。
（SIP）をプロービング安定同位体は、有望な文化のない手法である。これは、しばしば特定の代謝活動にリンクされた微生物の系統発生を分析するために、環境微生物学で使用される。これは、リン脂質由来の脂肪酸、DNA、RNAおよび5のような微生物のバイオマーカーへの基材から、安定同位体標識された炭素原子を追跡することによって達成される。核酸を考慮すると、方法論は、密度勾配超遠心分離することにより、非標識DNA 6から13 C標識DNAまたはRNAの分離に基づいている。原因のDNAラベルと代謝活性の間のこの直接の接続に、核酸の下流分子解析は、種を識別し、代謝活動に関する情報を提供しています。さらに、DNA-SIP及びパイロシーケンシングの組み合わせによって適用されるPilloni、フォンNetzer ら 15は 、重い13 C標識DNA画分に存在する細菌種の特定の単純で敏感な同定を可能にする。これまで、この技術は、好気性および嫌気性条件下16,17 18,19の下で、土壌中の生物地球化学的プロセスに関与する細菌群集を記述するために適用されている。難消化性炭水化物に反応して、人間の腸内細菌叢の異なる系統発生のグループの代謝活動を説明しライハルトら 5によって報告されるように環境科学での使用のほかに、技術は医学に適用されている。
ここでは、「ラベル」に、腸内の代謝活性のある細菌種のDNAを13 C-グルコースを使用しています。グルコースは、例外が20知られているが、広範なエントナー·（ED）経路に沿ってほとんどの細菌種によって利用糖である。この関心と確立された経路に沿って炭素源の代謝物との間のリンクを提供して信頼性の代謝プローブとして13 C-グルコースの使用を正当化する。科学的な質問、他の基質、 すなわち 13 C-メタン、13 CO 2、又は13 CO 2雰囲気下で昇植物に依存して、代謝活性をアドレス指定するために使用することができる。
この時点で、我々はジェネラリスト昆虫の消化管細菌群集の代謝特性評価、すなわち、Sに適用されるプロトコルを提示サキシマスオウノキ （ 鱗翅目、ヤガ科 ）。さらに、技術が順番に高い分解能と精度で昆虫の腸細菌群集の同定を可能にするパイロシーケンシングに結合した。メイン基板として、13 C-標識されたグルコースは、実験中に使用した。
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Protocol
1。昆虫飼育
- ハスモンヨトウの卵のクラッチを購入するか、入手し、独自の飼育からサ キシマスオウノキ 。孵化するまで室温（RT）での滅菌ペトリ皿でそれらを維持する。
- 次のように飼育昆虫人工飼料を準備します。
- 100mlの水に一晩500グラムのグランド白い豆を浸す。
- H 2 Oを蒸留千ミリリットルに9.0グラムのアスコルビン酸および75グラム寒天を追加し、後でそれを沸かす。
- 混合物を冷却するしましょう、それを（白いワックス状固体混合物に）固化する際に使用するまで4℃で保管してください。
- 照明の16時間と闇の8時間と長日体制の下で23〜25℃で人工飼料に清潔なプラスチックの箱とリア、それらを新たに孵化した幼虫を転送します。幼虫はすべて6幼虫齢を経るまで、毎日食べ物を変更します。
代謝的に活性な腸細菌におけるDNAの2。13 C標識
- 蒸留し、脱イオン水（のddH 2 O）と完全に13 C標識グルコースの186.1ミリグラムを溶解し、SIP実験用人工飼料を100グラムとよく混ぜる。人工飼料に10 mMの最終13 C-グルコース濃度を確認してください。これは、S.の腸内でその場でのグルコース濃度を模倣するシャオら （提出）に応じて綿植物上の幼虫の摂食をサキシマスオウノキ 。
- 新鮮な13 C-グルコースを含む滅菌プラスチックペトリ皿（シャーレにつき1幼虫）の飼育箱からの転送9月15日、健康な二齢幼虫を人工飼料をスパイク。説明したように、対照群を供給するための、天然のグルコース（12 C-グルコース）を同量含有する人工飼料を使用する。
- 潜伏期間（1日）の間、頻繁に人工飼料を新たにする。ステップ1.3のように、飼育条件を使用してください。
- 後で処理（DNA抽出）のために各治療から9幼虫を収集します。各3個人によって構成されている複製、治療ごとに少なくとも3回の反復を行います。
3。昆虫解剖
- 清潔で、エタノール70％（ツール= Vannasはさみ、ピンセット、高級替刃で、メス）で作業の最初に解剖ツールを消毒。
- 柔らかピンセットで虫を取り、蒸留水で表面的に彼らの皮膚を洗浄する。それらを麻酔するために、少なくとも30分間氷上に置きます。
- まだそれらを殺すために1時間0℃で行われ、それらを麻酔している間。数分間のエタノール（70％）でそれらを浸漬することによって表面的に死んだ虫を駆除。
- pHを7.4に調整し、約15ミリリットルの滅菌1×PBSペトリ皿（1×PBS = 137mMのNaCl、2.7mMのKCl、4.3のNa 2 HPO 4、1.47 mMのKH 2 PO 4の上に堆積されたボリュームに昆虫切開を行うオートクレーブ）。完全solutを中に浸漬し、全昆虫の体を持っていることの確認してください全体解剖期間中にイオン。
- 頭に開始し、肛門に仕上げて、右と昆虫の左側に沿って皮膚を切開することによって解剖を開始します。肌全体、マルピーギ細管、および脂肪体を取り外します。腸を切開する前に、新鮮な緩衝液に変更します。セクションの腸前後、中、そして必要なときに後腸。冷凍庫に組織を保存（-80〜-20℃）までのDNA抽出
4。 DNA抽出および増幅
- 1.5ミリリットルの滅菌遠心管中昆虫組織を置き、真空濃縮器装置中で45℃ですべてのサンプルを乾燥させる。滅菌プラスチック乳棒で乾燥させた組織をつぶす。
- 土壌DNA抽出に適したキットを用いてゲノムDNAを抽出する。キットの反応チューブに乾いたティッシュを転送し、製造業者によって示される指示に従ってください。
- 分光光度計を使用して、最終的な溶出したDNAの濃度を測定する。
- 付くYA真正細菌の一般的なプライマー27F（5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3）を使用した診断PCR法を用意することで昆虫の腸からの微生物メタゲノムDNAの抽出成功と1492r（5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3）。 PCR反応は以下のように設定します。
- 1×緩衝液を含有する50μlの反応混合物を設定し、1.5のMgCl 2、10 mMの4種のデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）のTaq DNAポリメラーゼ2.5 Uの各プライマー、0.5 mMおよび抽出されたDNAを鋳型として60ngの。
- 次のようにサーモサイクラーを用いてPCR反応を実行する：3分94℃での初期変性、続いて35サイクル：45秒、30秒、55℃でのアニーリング、および1分間72℃、伸長94℃ 。 10分間72℃での最終伸長工程を使用してください。
- 1％アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド（EB）染色ゲル（1μlのEBで1×TAE緩衝液と染色100mlにアガロース1gを溶かす）に成功したPCR増幅を確認してください。目の寄託5μLEのPCR産物+ゲルポケットに6Xローディング色素1μlの。 （1×TAEでpHを8に調整し、40mMトリス - 塩基、20mMの氷酢酸、1mMのEDTAを=）。
- CAの300 V、115ミリアンペア時1xTAE緩衝液を使用したゲルを実行します。電気泳動チャンバー内の20分。ゲルドキュメンテーション室（デジタルカメラやコンピュータに接続されているUVトランスイルミネーター）を使用してゲルを観察し、また、ロードされた遺伝子マーカーを使用して、最終製品のサイズを比較して、アンプリコンの正確な大きさは約1.5kbである必要があります。
- 優先的に、急速冷凍条件でPCR産物を格納-80°C、使用するまで。
5。 DNA分離 - 塩化セシウム勾配超遠心
- 次のように超遠心分離のための勾配のための試薬を準備
- 徐のddH 2 Oに塩化セシウムの603.0グラムに溶解することにより7.163 M塩化セシウム（CsClの）溶液を調製し、500ミリリットルの最終容量に埋める。
- 正確にデ三連による3桁のバランスに1.0ミリリットル分量を計量することにより準備された塩化セシウム溶液の密度をtermine。これは通常、室温で1.88及び1.89グラム/ mlの範囲である。
- 1 Mトリス-HCl（pH8.0）、0.5 M EDTA 1mlの液（pH 8）、決勝でのKCl、3.75gの50mlのを組み合わせることによって、勾配緩衝液（100mMトリス、100mMのKCl及び1mM EDTA）を調製のddH 2 Oを使用して500ミリリットルの容量フィルター（0.22μm）を、このソリューションを殺菌し、オートクレーブ。
- DNA分離
- 点4.3のように測定扱わ昆虫の個々のDNA濃度を、決定すると、一緒に複製するように対応し、それぞれの1は、同じようにプールしたサンプルに寄与することを確実にするために彼らのDNA濃度を正常化するもの昆虫プール。 DNAの500〜5,000 ngの（再度の最終濃度を測定）の最終濃度は、超遠心分離工程21に適している。
- グラデーションメディアを設定するには、定量化されたDNAを、勾配バッファANを組み合わせるD一緒に7.163 M塩化セシウム水溶液4.8ミリリットルの滅菌15ミリリットルのスクリューキャップチューブ中の6.0ミリリットルの混合量（勾配中期DNA混合物の生成）する。
- 慎重に注射器と針を用いて（チューブ首の付け根まで記入）5.1ミリリットル超遠心管に準備された勾配、中のDNAの混合物を配置します。気泡をポンプまたは形成することは避けてください。基準傾きとして各遠心実行で（代わりにDNAののddH 2 Oを使用して）1つ以上の空白グラデーションが含まれています。
- 各必須勾配媒体後の重量を10mg以内に平衡管ペアは、それぞれの超遠心管に充填される。 "チューブトッパー」でチューブをシールし、シールは漏れのないチューブを反転させて、手で適度な圧力を加えていることを確認してください。
- 超遠心分離のために5.1ミリリットル超遠心管を保持するための8ウェルを備えたほぼ垂直ローターを使用してください。慎重にローター井戸をシールし、MAに応じて超遠心機にローターを読み込むnufacturerの指示に従ってください。超遠心分離条件を設定します（177,000 XG前後）5万でスピン、20℃の温度、超遠心分離、真空で40時間の時間を実行している。ブレーキなしの最大加速と減速を選択します。
- 一度終了し、慎重に鉗子を使用して遠心ローターからチューブを取り外します。チューブ内に形成された勾配を乱すことなく、ラックに配置します。任意の拡散を最小限に抑えるために、できるだけ早く勾配分画のサンプルを処理する。
- 分別によって等密度別居勾配からのDNAの検索
- 同じように超遠心チューブトップ置換法から形成された勾配を分離勾配分画を、実行するために、正確なHPLCポンプシステムを使用しています。 1Lの変位をddH 2 Oで満たされたボトルにHPLCポンプ（100％流量勾配）を接続し、しっかりと注射針23のG 1で開いたポンプチューブに取り付ける。十分なBを追加それを濃い青色を与えることのddH 2 Oに青色色素をromophenol。これは、勾配媒体とのddH 2 Oの変位との間の界面の可視化を容易にする
- 850μlの/分の流速、ポンプを設定し、青色のddH 2 Oの一滴まで、システムを平衡化することは、注射針の外に出る。
- 慎重にクランプスタンドに超遠心分離管を固定し、長い針での注射器23のG 1とチューブの底に穴を開け。チューブの上部にポンプチューブに取り付けられた針を挿入することにより、超遠心管にポンプを接続し、直接、滅菌1.5ml微量遠心管に下から滴を集める。約425分あたりのμLとグラデーション当たり12画分の合計額、分数ごとに30秒を収集します。最後の画分（画分12）は、通常の変位のddH 2 Oが含まれ、廃棄されるべきであることに注意してください。
- 分別後、MEステップ5.1.2で説明したように化学天秤を使用して、すべての分離された画分の密度をASURE。
- 第一のDNAの少量の沈殿のためのキャリアとして1μlのグリコーゲン（のddH 2 O中に20μg/μL、オートクレーブ処理）を添加することにより、（425μL程度）各分画からDNAを沈殿させる。反転によりよく混ぜる。
- ポリエチレングリコール（PEG）溶液（ポリエチレングリコール6000 150gを500 mLの全量のddH 2 O中のNaCl 46.8gの溶解する。濾過し、滅菌し、オートクレーブ2倍量（850μl）を添加する。PEG溶液が30である％PEG 6000および1.6 MのNaCl）と、10回転倒再び混ぜる。
- （必要であれば一晩）、DNAを沈殿させ、少なくとも2時間、室温で管を残す。
- 室温で30分間13,000×gで沈殿物を遠心分離する。目に見えるペレットを形成すべきである。
- 慎重にピペットで上清を除去し、70％エタノール500μlでペレットを洗浄。同じ下遠心分離機再び10分間の条件。
- 慎重に上清を廃棄し、室温で15分間、ペレットを空気乾燥させます。
- のddH 2 O30μlの中で乾燥させたDNAペレットを再溶解し、ゆっくりとチューブをタップしてよく混ぜる。長期間の保管が必要な場合は、ステップ4.3ストア-20℃または-80の下のサンプルのように、それぞれの勾配分でDNAを定量化する。
6。パイロによるDNAの特徴付け
- 13 C標識DNAが周囲に1.720〜1.735グラム/ mlの密度を持っているのに対し、非標識のネイティブ（12℃）のDNAは、1.705グラム/ミリリットルから1.720グラム/ mlまで密度範囲を占めていることを確認してください。ネイティブおよび環境試料から抽出された13 C標識DNAの両方は、いくつかの勾配画にまたがることに注意してください。光DNAが留分9月11日、フラクション4-6に関連付けられる重いDNAと関連していると期待しています。
- シングル「コンパイルされた「代表端数ACを作成するために、キーの分画を組み合わせ密度分解、DNAの特定のピークの割り当てにコーディング。あるいは、このような濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）23変性などの同位体比質量分析（IRMS）を用いて分離された画分を調べるための他の手段22又はフィンガープリント法は、配列決定の前に適切な画分を選択するのを助けることができる。
- 個々の勾配のコンパイルされた、重い、中、軽留分からPCR増幅した細菌の16S rRNA遺伝子のピロシーケンスを実行します。この方法を使用して、SIPインキュベートした試料における系統および代謝的に活性な細菌種の相対存在量を同定することは可能である。次のようにパイロシーケンシングを実行します。
- チタン試薬とロシュ454 FLX機器を用いてアンプリコンピロシーケンスを実行します。
- 24,25は目で拡張（5 - - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3）Gray28Fを設定フュージョンプライマーを用いて多重化するためのバーコードアンプリコンを準備し、Gray519r（GTNTTACNGCGGCKGCTG -3 5）EそれぞれのプライマーアダプターA / Bおよびサンプル固有の多重化識別子（MID）。
- シーケンシングライブラリーを生成するために、ホットスタートTaqポリメラーゼを用い、30サイクルの一段階PCRを適用する。
- サプライヤーとのプロトコルに基づいてアンプリコンの配列を決定し、で説明したように順方向（Gray28F）から読み込み延長http://www.researchandtesting.com/ 。
7。パイロシーケンシングデータ解析
- 生のシーケンスは「微生物生態学への定量的な洞察力」、QIIMEのソフトウェア·パイプライン26で454パイロシーケンシングによって生成された読み取り分析する。次のように処理を実行します。
- 最初は、process_sff.pyスクリプトFASTA、QUALとフローグラムのファイルに454-機械生成SFFファイルを変換します。
- （check_id_map.pyに基づいて）マッピングファイルを検証し、多重化されたが、生物学的なSAMへの読み込み割り当てるples split_libraries.pyスクリプトで。低品質の50のスライディングウィンドウサイズと25の平均品質のカットオフパラメータで終わるトリム、データセットから短い曖昧な配列（長さ<200 bp）をも排除する。
- denoise_wrapper.pyを使用して454のデータをノイズ除去。
- 次に、複数のOTUピッキング法（pick_otus.py 97％の配列類似カットオフした）を使用した高品質の操作的分類単位（OTUs）に読み込み、クラスター化。
- pick_rep_set.pyを使用して、各OTUからの代表的な配列を選択してください。
- assign_taxonomy.pyに基づいた代表的な配列セットに分類を割り当てます。0.80に設定されたレコードの割り当て最小自信を持ってリボソームデータベースプロジェクト（RDP）分類器を使用してください。
- アルゴリズムPyNast（align_seqs.pyを使用してプリアライメントGreengenesコア16S配列に対して設定された代表シーケンスを揃える75最小配列同一性パーセントを設定した）。
- さらに、identify_chimeric_seqs.pyを実行することで、さらなる分析からキメラを枯渇。
- 系統樹（make_phylogeny.py）を構築する前にlanemaskテンプレート（filter_alignment.py）と（系統発生推論には有用ではない）、全てのギャップ位置を削除します。
- 最終的に、それぞれの試料中の細菌の系統型の発生を記述し、make_otu_table.pyでOTUテーブルを生成。細菌豊かさと活性を比較するためのヒートマップを構築するために、OTU表を使用します。
- 必要に応じて、それぞれ、サンプル内および間でαおよびβの多様性を計算する。同様にして、希薄曲線（シーケンシング深さに対する多様性のグラフ）および微生物群集の関係を表すプリンシパル座標分析（PCoAの）プロットを調製することもできる。
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Representative Results
昆虫の腸に存在する代謝活性のある細菌の十分なラベリングを実現するために、昆虫は1ラベルのない軽いから簡単にラベルされた重い画分の分離を可能にするのに十分な、以前に最適化された期間、13 Cが豊富な基質にさらされている必要があります。この例では、13 C-グルコースは、1日目（ 図1A）のために10mMの最終濃度で人工飼料に添加した。正常なグルコース（ 図1B）の同量制御昆虫の人工飼料で供給した。前述したように、（より軽いから重い）DNA画分の分離は、プロセス全体の基礎である。したがって、実行される最初のステップは、目的の組織からDNAを抽出であり、この場合には、細菌群集は、昆虫の腸に関連付けられている。その品質を確認するためには、すべての任意のDNAが析から得られたかどうかを判断するために電気泳動ゲルを実行することが重要ですゼット組織。 図1Cには、正のDNA抽出を確認し、画像の上部にあるゲノムDNAの強いバンドが観察される。また、細菌のDNA（ 図1D）の存在を決定するために、細菌のユニバーサルプライマーを用いて、診断PCRを行う必要がある。この肯定的な結果は、さらに抽出されたメタゲノムDNAの分離を続行かどうかを判断することが重要です。
分離した各画分中のDNAの量が確認され、密度の測定が行われた後、超遠心分離した後、通常覆うチューブ内の適切な勾配の形成を確認するためにグラム/ mlの画分の数に対する平均密度画分をプロット（フラクション12または11の場合）1.690グラム/ミリリットルから1.760への密度範囲μg/ mlの （画分1の場合）。定量的ピロシーケンス（ 図2種の系統および相対存在量を明らかにするために、代表SIP勾配上で直接実行される、13 C-グルコース改正サンプルや地域社会に積極的な集団のプロファイリング務めラベルされていないコントロールの両方からの重質留分を配列決定した。配列決定の後、120045高品質の合計は404ヌクレオチドの長さの平均が生成されたと読みます。パイロシーケンシングプロファイルは、標識された試料中の腸球菌及びパンテア対照群（コントロールDNA 12 C、 図3）と比較し（13 C-標識されたDNA、 図3）を含む特定の種の存在量の増加を示した。したがって、これらの細菌は代謝的に活性であると考えられ、さらなる研究に値するされている。
図1：13 C-グルコース供給実験、DNA抽出および細菌の16S rRNAの世代のPCR増幅 E。 （A）13 C-グルコースがハスモンヨトウで消費される人工飼料は幼虫サキシマスオウノキ修正した。（B）ネイティブグルコース（12 C-グルコース）を対照となる（A）に使用される昆虫の同じバッチから幼虫が消費する人工飼料を、改正13 C-グルコース処置群における12 C-グルコース対照群の幼虫の腸組織から（C）の典型的なメタゲノムDNA抽出。 3つの生物学的複製物（レーン1,2および3）は、各グループに含まれる。 Mは1kbのDNAマーカーを意味する。ユニバーサル細菌のプライマーセットと（D）PCR増幅は、鋳型として抽出メタゲノムDNAを用いて、正しい1.5キロバイト16S rRNA遺伝子産物を生成する。レーン1は、PCR陽性対照である。レーン2および3は、それぞれ、13 C-グルコース処理試料および12 C-グルコースコントロールを表す。 JPG "ターゲットは=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。分離されたDNAのパイロシーケンシングで塩化セシウム密度勾配超遠心分離と小数の特性評価を含むパイロ-SIP実験の概要。Hが高く豊富、L =低豊かさを=。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。ネイティブグルコース供給幼虫（12 C-コントロールDNA）の重質留分および13 C-グルコース供給の幼虫（13 C標識DNA）の中の細菌の多様性と相対的存在。/ www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
ほとんどの昆虫の消化管は、豊かで複雑 な微生物群集を保有。通常、10 7 -10 9原核細胞は、ほとんどの場合、宿主自身の細胞をより多かっ、そこに留まる。このように、昆虫の腸は共生27を義務づけるための病因から、微生物関係のさまざまな側面を表現する、多様な微生物活動のための「ホットスポット」である。多くの研究が昆虫の腸の微生物コミュニティの驚くべき多様な説明してきたが、腸内細菌叢の代謝活性の特徴付けは稀である。安定同位体プロービングの方法は、今の栽培とは独立して、さらには生体内での複雑な細菌叢の背景からのアクティブなメンバーと区別するための可能性を提供する。私たちは、昆虫のモデル系、綿の葉のワーム（ スポドプテラリットラリス ）で腸内細菌叢を研究するためにこの貴重なツールを適用した。グルコースはコットンリーフワームの腸内の支配的な糖であるので、このデモでは、我々はLARを与え人工飼料でVAEは、腸内細菌叢に、代謝活性細菌を追跡するために、13 C-グルコースの余分な生理的用量でスパイク。ネイティブグルコースを確立し、同一のインキュベーションは、核酸の明らかな標識は、このような分離に寄与したDNAの高いG+ C含量として、方法自体の人工物ではなかったことを確実にするために、その後の比較のために重要な制御を提供した。グルコースのその場での濃度の近くには、さらに実験的なバイアスを減少させた。 DNA-SIP研究の厳密な実験に関連する他の考慮事項は、他の場所で議論されている28,29。腸内細菌は、通常、代謝活性が高く、ほとんどの陸生および水生環境からの微生物と比較して短い世代時間を持っている。このように継続的に供給し、24時間ではすでにかなりのラベルを引き起こした。ホストのゲノムDNAが多量にも考慮してされるべきである消化管組織から共抽出されたことに注意してください考察の結果を議論するとき。
典型的な勾配画分の特徴付けは、例えば、末端制限断片長多型（T-RFLP）のような低解像度の指紋法に依存しており、データをリンクするための時間のかかるクローンライブラリーの構築。これは、ハイスループット第二世代シーケンシング技術の出現は、複雑な微生物群集の急速な、費用対効果、及び詳細な分析を可能にすることがごく最近である。ここでは、直接密度勾配画分の遺伝子組成を調査し、ゲル電気泳動ベースの方法と比較して高感度を与えた代謝活性のある細菌を識別するために、この新技術を適用し、その後の系統分類を容易にした。 13 C標識及び12 C-コントロールサンプルの両方から同等の重質留分とを比較することによって、我々はパントエアとエンテロコッカスプロービング同位体上にラベル付けになったことがわかります。一度metabolically活性細菌が同定されており、このような特定のプローブおよび標識されたDNAのメタゲノム解析的なコミュニティのメンバーから回収を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）のような他の分析は、ホストに関連付けられた真の共生生物を包括的に洞察を提供するために実施することができる。ここで確立されたシステムに基づいて、他の13 C-標識炭素源はまた、宿主消化過程に関与する活性細菌を同定するためにセルロースを標識は、例えば、標的と腸の代謝経路に関与する細菌を分析するために宿主に供給することができる。そのような新しいアプローチの開発により、昆虫の腸内微生物叢の役割は、現在、より明らかになるであろう。
集合的に、ここで説明するプロトコルは、さらにBACTEの特定の役割を評価するために適用することができる腸内微生物叢の代謝活性を測定するための、簡単で迅速、かつ効果的な方法を表す。ホスト栄養、解毒、および防衛のためにリアル共生。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、実験室での支援をアンジェリカベルクに感謝します。この作品は、マックスプランク協会および微生物コミュニケーション（JSMC）のためのイエナ大学によってサポートされ、融資された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
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