Summary
La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión.
Abstract
Tripas de la mayoría de los insectos son habitadas por comunidades complejas de bacterias no patógenas simbióticas. Dentro de estas comunidades microbianas es posible identificar especies comensales o bacterias mutualistas. Estos últimos, se han observado para servir a múltiples funciones para el insecto, es decir, ayudar en la reproducción de insectos 1, reforzar la respuesta inmune 2, la producción de feromonas 3, así como la nutrición, incluyendo la síntesis de los aminoácidos esenciales 4, entre otros.
Debido a la importancia de estas asociaciones, se han hecho muchos esfuerzos para caracterizar las comunidades hacia abajo a los miembros individuales. Sin embargo, la mayoría de estos esfuerzos se basaban en métodos de cultivo o se basó en la generación de fragmentos del gen 16S rRNA que se secuenciaron para la identificación final. Desafortunadamente, estos enfoques sólo identificaron las especies bacterianas presentes en el intestino y no proporcionaron Informatde iones sobre la actividad metabólica de los microorganismos.
Para caracterizar las especies bacterianas metabólicamente activas en el intestino de un insecto, hemos utilizado isótopos estables (SIP) in vivo empleando 13 C-glucosa como un sustrato universal. Esta es una técnica de cultivo libre prometedora que permite la vinculación de las filogenias microbianos para su actividad metabólica particular. Esto es posible mediante el seguimiento, la etiqueta de isótopos de átomos estables a partir de sustratos en biomarcadores microbianos, tales como ADN y ARN 5. La incorporación de isótopos 13 C en el ADN aumenta la densidad de la etiqueta de ADN en comparación con el no marcado (12 C) uno. En el extremo, el ADN marcado con C 13 o de ARN se separaron por ultracentrifugación en gradiente de densidad de la C-12 no marcado uno similar 6. Posterior análisis molecular de los isotopómeros de ácido nucleico separadas proporciona la conexión entre la actividad metabólica y la identidad de las especies.
A continuación, presentamos el protocolo utilizado para caracterizar las bacterias metabólicamente activas en el intestino de un insecto generalista (nuestro modelo de sistema), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). El análisis filogenético del ADN se realizó utilizando la pirosecuenciación, lo que permitió alta resolución y precisión en la identificación de intestino de insecto de la comunidad bacteriana. Como sustrato principal, se utilizó 13 de la glucosa marcado con C en los experimentos. El sustrato se alimenta a los insectos utilizando una dieta artificial.
Introduction
Asociaciones simbióticas Insecto-bacterianas son conocidos por un gran número de especies de insectos 7. En estas asociaciones simbióticas, microorganismos desempeñan papeles importantes en el crecimiento y desarrollo de insectos. Los microbios se han demostrado contribuir a la reproducción de los insectos 1, la biosíntesis de feromona 3, la nutrición, incluyendo la síntesis de los aminoácidos esenciales 4, y la digestión de los alimentos inaccesibles para el anfitrión. A pesar de la gran variedad de asociaciones-intestinal bacteriana, se sabe mucho menos sobre el papel funcional que desempeñan en favor del insecto. Sólo en el caso de las termitas, la digestión simbiótica de lignocelulosa llevada a cabo por los procariotas, protozoos y hongos, ha sido ampliamente estudiado 8,9. En contraste con esto, se sabe poco acerca de la asociación simbiótica presente en el intestino de los insectos generalistas, es decir, la rosquilla negra, Spodoptera littoralis. Por otra parte, debido a su cambio frecuente de los ejércitos de las plantas, en generalist insectos y sus viscerales comunidades bacterianas asociadas están expuestos permanentemente a los nuevos desafíos relacionados con sus hábitos de alimentación que consumen las plantas con una gran cantidad de fitoquímicos. Además de esto, el medio ambiente intestinal en los lepidópteros, representa de por sí un ambiente hostil para el crecimiento de bacterias debido a la alta pH intestinal 10. Particularmente en el caso de S. littoralis, oscila entre 10,5 en el intestino anterior, ca. 9 en el intestino medio a pH casi 7 en el intestino posterior 11. Por otro lado, la comunidad bacteriana asociada con el intestino de S. littoralis es simple. Tang, Freitak, et al 12. Informaron de un máximo de 36 filotipos pertenecientes a un total de 7 especies de bacterias diferentes como los únicos miembros de la comunidad bacteriana asociada a este insecto. Además de esto, no se requiere ningún procedimiento de cría complicado para el crecimiento de los insectos en el laboratorio. Además, este y el corto ciclo de vida del insecto facilitar múltiples gestudios enerational, convirtiendo esta especie en un sistema modelo ideal para el estudio de las interacciones gut-microbio.
Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación basados en la PCR, el número de estudios que se ocupan de la biota intestinal de varios organismos (es decir, los seres humanos, insectos, u organismos marinos) se ha incrementado. Por otra parte, los resultados son independientes de aislamiento y cultivo de las bacterias del intestino albergado como en el pasado. Casi el 99% de las bacterias no son cultivables y la simulación de las condiciones ambientales reinantes en el intestino es difícil 12. Mediante el uso de PCR, 16S rRNA fragmentos de genes (un marcador de gen filogenético ampliamente utilizado entre las bacterias) podrían ser amplificadas selectivamente a partir de una plantilla de ADN mixta de comunidades bacterianas intestinales, secuenciados, y se clonaron. Con esta información, el usuario es capaz de identificar las especies bacterianas después de recuperar la información de la secuencia de bases de datos públicas 13,14. Sin embargo, la secuenciación se acerca a describir bacterianacomunidades siguen siendo insuficientes debido a la falta de información sobre la contribución metabólica intrínseca de las especies individuales dentro de la comunidad.
De isótopos estables de sondeo (SIP) es una técnica de cultivo libre prometedor. A menudo se utiliza en microbiología ambiental para analizar filogenias microbianos vinculados a las actividades metabólicas particulares. Esto se logra mediante el seguimiento, la etiqueta de isótopos de átomos estables a partir de sustratos en biomarcadores microbianos, tales como ácidos grasos de fosfolípidos derivados de, ADN, ARN y 5. Al considerar los ácidos nucleicos, la metodología se basa en la separación de 13 ADN marcado con C o ARN a partir del ADN no marcado por ultracentrifugación en gradiente de densidad 6. Debido a esta conexión directa entre la etiqueta de ADN y la actividad metabólica, un análisis molecular de aguas abajo de los ácidos nucleicos identifica la especie y proporciona información sobre las actividades metabólicas. Por otra parte, la combinación de ADN-SIP y pirosecuenciación tal como se aplica porPilloni, von Netzer, et al. 15, permite una identificación sencilla y sensible particular de las especies de bacterias presentes en la fracción de ADN pesado 13 C-etiquetados. Hasta ahora, esta técnica se ha aplicado para describir las comunidades bacterianas involucradas en los procesos biogeoquímicos en el suelo bajo aeróbicas y anaeróbicas 16,17 18,19 condiciones. Además del uso en las ciencias ambientales, la técnica se ha aplicado en las ciencias médicas según lo informado por Reichardt, et al. 5, que describe las actividades metabólicas de los diferentes grupos filogenéticos de la microbiota intestinal humana en respuesta a un carbohidrato no digerible.
Aquí utilizamos 13 C-glucosa para "etiqueta" el ADN de las especies de bacterias metabólicamente activas en el intestino. La glucosa es un azúcar utilizado por la mayoría de las especies bacterianas a lo largo de la vía de Entner-Doudoroff generalizada (ED), aunque se conocen excepciones 20. Estejustifica el uso de 13 C-glucosa como sonda metabólica confiable que proporciona un vínculo entre los metabolitos de interés y la fuente de carbono a lo largo de las vías establecidas. Dependiendo de la pregunta científica, otros sustratos, es decir, 13 C-metano, 13 CO 2, o plantas cultivadas en una atmósfera de 13 CO 2, se puede utilizar para hacer frente a las actividades metabólicas.
En este punto, se presenta el protocolo utilizado en la caracterización metabólica de la comunidad bacteriana del intestino de un insecto generalista, es decir, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Por otra parte, la técnica se acopló a la pirosecuenciación, que a su vez permite la identificación de la comunidad bacteriana de intestino de insecto con alta resolución y precisión. A medida que el sustrato principal, 13 de glucosa marcada con C se utilizó durante los experimentos.
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Protocol
1. Insectos Crianza
- Comprar u obtener huevos garras de Spodoptera littoralis de su propia crianza. Mantener en placas de Petri estériles a temperatura ambiente (RT) hasta la eclosión.
- Preparar la dieta artificial para la cría de los insectos de la siguiente manera:
- Remojar los frijoles blancos 500 g de tierra durante la noche en 100 ml de agua.
- Añadir 9,0 g de ácido ascórbico y 75 g de agar a 1000 ml de agua destilada H 2 O y luego hervirla.
- Deje que la mezcla se enfríe y cuando se solidifica (a una mezcla de sólido ceroso blanco) almacenarlo a 4 ° C hasta su uso.
- Transfiera las larvas recién eclosionadas de una caja de plástico limpia y criarlos en la dieta artificial a 23-25 ° C bajo un régimen largo día con 16 horas de iluminación y 8 horas de oscuridad. Cambie la comida todos los días hasta que las larvas pasan por los seis estadios larvales.
2. 13 C-etiquetado de ADN en las bacterias intestinales metabólicamente activo
- Disolver 186,1 mg de 13 totalmente la glucosa marcada con C con agua destilada y agua desionizada (ddH2O) y se mezcla bien con 100 g de dieta artificial para el experimento de SIP. Asegurar una concentración de 13 C-glucosa final de 10 mM en la dieta artificial. Esto imita la de la concentración de glucosa in situ en el intestino de S. littoralis larvas se alimentan de las plantas de algodón de acuerdo con Shao et al. (Enviar).
- Transferencia 9-15 segundo estadio las larvas sanas desde el cuadro de cría para placas de Petri de plástico estéril (una larva por placa Petri) que contienen frescos 13 C-glucosa pinchos dieta artificial. Utilice dieta artificial que contiene la misma cantidad de glucosa nativa (12 C-glucosa), tal como se describe, para la alimentación del grupo de control.
- Renovar la dieta artificial con frecuencia durante el período de incubación (1 día). Utilizar condiciones de cría como en el paso 1.3.
- Recoger nueve larvas de cada tratamiento para su posterior procesamiento (extracción de ADN). Cadareplicar está constituido por tres individuos; hacer por lo menos tres repeticiones por tratamiento.
3. Insectos Disección
- Limpiar y desinfectar las herramientas de disección en el inicio de la obra con etanol al 70% (Herramientas = tijeras Vannas, fórceps y el bisturí con cuchillas desechables finas).
- Tome los insectos con una pinza suave y lavar la piel superficialmente con agua destilada. Colóquelos en hielo durante al menos 30 min para anestesiar ellos.
- Aunque todavía anestesiado lugar ellos a 0 ° C durante 1 hora para matarlos. Desinfectar los insectos muertos superficialmente por inmersión en etanol (70%) durante un par de minutos.
- Realizar la disección de insectos en un volumen de aproximadamente 15 ml de PBS 1x depositado sobre una placa de Petri estéril (NaCl 1XPBS = 137 mM, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, 1,47 mM KH 2 PO 4, ajustar el pH a 7,4 , en autoclave). Asegúrese de tener todo el cuerpo del insecto completamente inmerso en el solutde iones durante todo el período de disección.
- Comience la disección haciendo una incisión en la piel a lo largo de los lados derecho e izquierdo del insecto, comenzará en la cabeza y terminar en el ano. Retire toda la piel, tubos de Malpighi, y la grasa corporal. Cambie al tampón fresco antes de cortar y abrir el intestino. Sección del intestino en primer plano, medio, y el intestino posterior cuando sea necesario. Almacenar el tejido en el congelador (-80 a -20 º C) hasta la extracción de ADN
4. Extracción de ADN y amplificación
- Coloque el tejido de insectos en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml y secar todas las muestras a 45 ° C en un dispositivo concentrador de vacío. Triturar el tejido se seca con una mano de mortero de plástico estéril.
- Extraer el ADN genómico utilizando un kit adecuado para la extracción de ADN del suelo. Transferir el tejido seco para el tubo de reacción del kit y siga las instrucciones como se indica por el fabricante.
- Determinar la concentración del ADN eluido final utilizando un espectrofotómetro.
- Verifya con éxito la extracción del ADN metagenómica microbiana del intestino del insecto mediante la preparación de un ensayo de PCR de diagnóstico utilizando los cebadores generales eubacterial 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) y 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Establecer la reacción de PCR como sigue:
- Establecer una mezcla de reacción que contiene 50 l 1x tampón, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM cuatro desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs), 2,5 U de Taq ADN polimerasa, 0,5 mM de cada cebador y 60 ng del ADN extraído como plantilla.
- Ejecutar las reacciones de PCR utilizando un termociclador de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido por 35 ciclos de: 94 º C durante 45 seg, hibridación a 55 ° C durante 30 seg, y extensión a 72 ° C durante 1 min . Utilice un paso de extensión final a 72 ° C durante 10 min.
- Verificar la amplificación por PCR con éxito en un gel de agarosa 1% electroforesis en bromuro de etidio (EB) gel teñido (disolver 1 g de agarosa en 100 ml de tampón TAE 1x y mancha con 1μl EB). Depósito 5 l de thproducto e PCR + 1μl de 6x colorante de carga a los bolsillos de gel. (TAE 1x = 40 mM de Tris-base, 20 mM de ácido acético glacial, EDTA 1 mM, ajustado a pH 8).
- Ejecute el gel usando tampón 1xTAE a 300 V, 115 mA de ca. 20 min en una cámara de electroforesis. Mediante el uso de una cámara de documentación de geles (transiluminador UV conectado a una cámara digital y la computadora) observar el gel y comparar el tamaño de su producto final con el marcador genético también cargado, el tamaño correcto de los amplicones debe ser de aproximadamente 1,5 kb.
- Almacene los productos de PCR en condiciones de congelación profunda, preferentemente -80 º C, hasta su uso.
5. Separación-CsCl ADN degradado Ultracentrifugación
- Preparar los reactivos para los gradientes para la ultracentrifugación de la siguiente manera:
- Preparar un M de cloruro de cesio (CsCl) solución de 7,163 disolviendo gradualmente 603,0 g de CsCl en ddH2O y rellenar hasta un volumen final de 500 ml.
- Exactamente desdeterminar la densidad de la solución de CsCl preparada pesando una parte alícuota de 1,0 ml en un equilibrio de tres dígitos por triplicado. Esto por lo general oscila entre 1,88 y 1,89 g / ml a temperatura ambiente.
- Preparar el tampón de gradiente (Tris 100 mM, KCl 100 mM y EDTA 1 mM) mediante la combinación de 50 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml de EDTA 0,5 M (pH 8) y 3,75 g de KCl en una final volumen de 500 ml utilizando ddH 2 O. Filtrar (0,22 m) esterilizar en autoclave y esta solución.
- Separación de ADN
- Una vez determinada la concentración de ADN individual de los insectos tratados, medida como en el punto 4.3, en común esos insectos correspondientes a una repetición juntos y normalizar la concentración de ADN para asegurar que cada uno de ellos, igualmente contribuye a la muestra conjunta. Una concentración final de 500-5000 ng de ADN (medir de nuevo la concentración final) es adecuado para el proceso de ultracentrifugación 21.
- Para configurar el desnivel medio, combine el ADN cuantificado, un buffer de gradienteD 4,8 ml de solución 7,163 M de CsCl junto a un volumen de la mezcla de 6,0 ml en un tubo de 15 ml con tapón de rosca estéril (generación de una mezcla de ADN-medio de gradiente).
- Coloque cuidadosamente el gradiente de mezcla de ADN medio preparado en un tubo de ultracentrífuga 5,1 ml (llene hasta la base del cuello del tubo) con una jeringa y aguja. Evitar el bombeo o la formación de burbujas de aire. Incluya por lo menos un gradiente de blanco (con ddH2O en lugar de ADN) en cada serie centrífuga como un gradiente de referencia.
- Pares de tubos de balance a menos de 10 mg de peso después de cada medio de gradiente requerido se introducen en el tubo de ultracentrífuga respectiva. Selle el tubo con una "Topper Tube" y asegúrese de que la junta esté libre de fugas invirtiendo el tubo y aplicar una presión moderada con la mano.
- Utilice un rotor vertical cerca con ocho pozos para la celebración de los tubos 5,1 ml de ultracentrifugación para la ultracentrifugación. Selle cuidadosamente los pozos de rotor y cargar el rotor en la ultracentrífuga según la malas instrucciones del ciones del fabricante. Establecer las condiciones de ultracentrifugación: giran a 50.000 rpm (aproximadamente 177.000 xg), la temperatura a 20 ° C, y ultracentrifugación tiempo de funcionamiento de 40 horas con vacío. Seleccione la máxima aceleración y la desaceleración sin freno.
- Una vez que haya terminado, retire con cuidado los tubos de rotor centrífugo con unas pinzas. Colocarlos en un estante sin molestar a los gradientes formados dentro de los tubos. Procesar las muestras de fraccionamiento de gradiente tan pronto como sea posible para minimizar cualquier difusión.
- La recuperación de ADN de gradientes isopícnica separados por fraccionamiento
- Utilice un sistema de bomba de HPLC precisa para llevar a cabo el fraccionamiento de gradiente, que separa igualmente los gradientes formados a partir del método de desplazamiento de la tapa del tubo de ultracentrífuga. Conecte la bomba de HPLC (100% del gradiente de flujo) a la botella llena con 1 litro de desplazamiento ddH2O y herméticamente adjuntar a la tubería de la bomba abierto con un 23 G 1 en aguja de la jeringa. Agregar suficiente bromophenol colorante azul al ddH2O para darle un color azul oscuro. Esto facilita la visualización de la interfaz entre el medio de gradiente y el desplazamiento de ddH 2 O.
- Establecer la bomba a una velocidad de flujo de 850 l / min y equilibrar el sistema hasta una sola gota de la de color azul ddH2O emerge fuera de la aguja de la jeringa.
- Fijar con cuidado el tubo de ultracentrífuga para un soporte de pinzas y perforar la parte inferior del tubo con una jeringa de 23 G 1 en aguja larga. Conectar la bomba al tubo de ultracentrífuga mediante la inserción de la aguja unida a la tubería de la bomba en la parte superior del tubo, y recoger las gotas de la parte inferior directamente en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml estériles. Se recoge una fracción cada 30 segundos, por un importe de aproximadamente 425 l por fracción y un total de 12 fracciones por gradiente. Tenga en cuenta que la última fracción (fracción 12) por lo general contiene el desplazamiento ddH2O y debe desecharse.
- Después del fraccionamiento, MEasure la densidad de todas las fracciones separadas utilizando una balanza analítica como se menciona en el paso 5.1.2.
- Precipitar el ADN de cada fracción (alrededor de 425 l) mediante la adición de primero 1 l de glucógeno (20 mg / l en ddH2O, esterilizado en autoclave) como un portador para la precipitación de baja cantidad de ADN. Mezclar bien por inversión.
- Añadir dos volúmenes (850 mu l) de solución de polietilenglicol (PEG) (disolver 150 g de polietilenglicol 6000 y 46,8 g de NaCl en ddH2O a un volumen total de 500 ml. Filtro, esterilizar y autoclave. La solución de PEG es 30 % de PEG 6000 y NaCl 1,6 M), y se mezcla de nuevo por inversión de diez veces.
- Dejar los tubos a temperatura ambiente durante al menos dos horas (si es necesario, durante la noche) para precipitar el ADN.
- Centrifugar los precipitados a 13.000 xg durante 30 min a TA. Un pellet visible debe formar.
- Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y se lava el sedimento con 500 l de etanol al 70%. Centrifugar bajo el mismocondiciones para 10 min de nuevo.
- Desechar con cuidado el sobrenadante y aire secar el sedimento a temperatura ambiente durante 15 min.
- Volver a disolver el precipitado de ADN se seca en 30 l de ddH2O y mezclar bien golpeando suavemente el tubo. Cuantificar el ADN en cada fracción del gradiente como en el paso 4.3 Tienda de las muestras bajo -20 o -80 º C si se requiere el almacenamiento a largo plazo.
6. ADN Caracterización por Pyrosequencing
- Asegúrese de que el ADN nativo no marcado (12 C) ocupa el intervalo de densidad de 1,705 g / ml a 1,720 g / ml, mientras que 13 de ADN marcada con C tiene una densidad de alrededor de 1,720 a 1,735 g / ml. Tenga en cuenta que tanto el nativo y el 13 de ADN marcado con C extraído de muestras ambientales pueden abarcar varias fracciones del gradiente. Esperamos que el ADN de luz para estar asociado con las fracciones 9-11 y el ADN pesado para ser asociado con las fracciones 4-6.
- Se combinan las fracciones clave para crear un solo "compilado" representante fracción acacuerdo con la asignación máxima específica de la densidad de ADN-resuelto. Alternativamente, otros medios para examinar las fracciones separadas mediante el uso de la espectrometría de masas de relación isotópica (IRMS) 22 o un método de toma de huellas digitales, tales como electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE) 23, pueden ayudar a elegir fracciones apropiadas antes de la secuenciación.
- Realice pirosecuenciación de los 16S rRNA PCR-amplificación de los genes de las fracciones pesadas, intermedias y claras compilados de cada gradiente individual. Usando este método, la identificación del linaje y la abundancia relativa de especies de bacterias metabólicamente activas en el SIP muestras incubadas es posible. Realizar pirosecuenciación de la siguiente manera:
- Realice pirosecuenciación amplificación utilizando un instrumento Roche 454 FLX con reactivos de titanio.
- Preparar amplicones de barras para la multiplexación usando el cebador de fusión establecido Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) y Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 ampliado con the imprimación respectivo adaptador A / B y los identificadores múltiplex específicos de la muestra (MID).
- Aplicar una PCR de un solo paso con 30 ciclos, usando un Hot Start Taq polimerasa, para generar la biblioteca de secuenciación.
- Secuenciar los amplicones basados en el protocolo del proveedor, y se extienden las lecturas de la dirección de avance (Gray28F) como se describe en http://www.researchandtesting.com/ .
7. Pyrosequencing Análisis de Datos
- Analizar la secuencia en bruto lee genera por la pirosecuenciación 454 con los "puntos de vista cuantitativos en ecología microbiana", oleoducto software QIIME 26. Lleve a cabo el procesamiento de la siguiente manera:
- Inicialmente, convierta el archivo sff generado-454-máquina para FASTA, QUAL y archivos Flowgram con el guión process_sff.py.
- Validar el archivo de asignación (basado en check_id_map.py) y asignar multiplexado lee a sam biológicapios con el guión split_libraries.py. Recorte la baja calidad termina con un tamaño de ventana deslizante de 50 y un valor medio del parámetro de calidad de corte de 25, eliminan también secuencias ambiguas cortas (la longitud <200 pb) a partir del conjunto de datos.
- DeNoise los datos 454 usando el denoise_wrapper.py.
- A continuación, el clúster de alta calidad se lee en unidades taxonómicas operacionales (Otus) usando el método múltiple OTU picking (pick_otus.py con un 97% de similitud de secuencias cut-offs).
- Elige una secuencia representante de cada OTU usando pick_rep_set.py.
- Asigne la taxonomía para el representante conjunto de secuencias basado en assign_taxonomy.py. Utilice el clasificador Ribosomal Database Project (RDP) con una seguridad mínima para la asignación de registro se establece en 0,80.
- Alinear el representante secuencia se compara con los prealigned Greengenes núcleo 16S secuencias utilizando el algoritmo PyNast (align_seqs.pycon el mínimo de identidad de secuencia por ciento conjunto a 75).
- Además, agotan las quimeras de los nuevos análisis ejecutando identify_chimeric_seqs.py.
- Retire todas las posiciones brecha (no útiles para la inferencia filogenética) con la plantilla lanemask (filter_alignment.py) antes de la construcción de un árbol filogenético (make_phylogeny.py).
- Finalmente, generar tablas OTU con make_otu_table.py, que describe la aparición de filotipos bacterianas dentro de cada muestra. Utilice la tabla OTU para construir el mapa de calor para la comparación de la abundancia y la actividad bacteriana.
- Si es necesario, calcular el alfa y beta diversidad dentro y entre las muestras, respectivamente. De la misma manera, las curvas de rarefacción (gráficos de la diversidad frente a la profundidad de secuenciación) y Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) parcelas que representan las relaciones entre las comunidades microbianas pueden prepararse también.
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Representative Results
Para conseguir el marcaje suficiente de las bacterias metabólicamente activas presentes en el intestino del insecto, el insecto debe ser expuesto al sustrato 13 C-rica durante un período previamente optimizado suficiente para permitir la separación de la fracción más pesada marcado fácilmente de la no marcado uno más ligero. En nuestro caso, 13 C-glucosa fue complementado en la dieta artificial a una concentración final de 10 mM durante 1 día (figura 1A). La misma cantidad de glucosa normal (Figura 1B) fue suministrada en la dieta artificial de los insectos de control. Como se mencionó antes, la separación de las fracciones de ADN (más pesado de más ligero) es la base de todo el proceso. Por lo tanto, el primer paso a realizar es la extracción de ADN a partir del tejido de interés, en este caso, la comunidad bacteriana asociada con el intestino del insecto. Para confirmar su calidad es importante para correr un gel de electroforesis para determinar si alguno de ADN en absoluto se obtuvo del análisisel tejido de la zeta. En la Figura 1C, que es observable una fuerte banda de ADN genómico en la parte superior de la imagen de confirmación de la extracción de ADN positivo. Además, es necesario realizar un diagnóstico de PCR, utilizando cebadores universales bacterianas, para determinar la presencia de ADN bacteriano (Figura 1D). Este resultado positivo es importante para decidir si continuar aún más con la separación de la ADN metagenómico extraído.
Después de ultracentrifugación, una vez que se confirmó la cantidad de ADN en cada fracción separada, y la medición de la densidad se realiza, trazar la fracción de densidad media en g / ml durante número de fracción para confirmar la formación del gradiente adecuado en tubos, que cubre normalmente una intervalo de densidad de 1,690 (para la fracción 12 o 11) a g / ml 1,760 g / ml (Para la fracción 1). Pirosecuenciación cuantitativo se realiza directamente en los gradientes SIP representativos para revelar linaje de especies y abundancia relativa (Figura 2 13 C-glucosa y el control sin etiqueta, que sirvió para perfilar las poblaciones activas en la comunidad. Después de la secuenciación, un total de 120.045 de alta calidad lee con una longitud media de 404 nucleótidos se generaron. El perfil de pirosecuenciación mostró un aumento en la abundancia de ciertas especies incluyendo Enterococcus y Pantoea en la muestra marcada (13 ADN marcado con C, Figura 3) en comparación con la del grupo de control (12 ADN de control C, Figura 3). Por lo tanto las bacterias se considera que son metabólicamente activa, y el mérito estudio adicional.
Experimento Figura 1. 13 de alimentación C-glucosa, extracción de ADN y la amplificación por PCR del gen ARNr 16S bacteriana e. (A) 13 C-glucosa modificada dieta artificial consumida por larvas de Spodoptera littoralis. (B) de glucosa Nativo (12 C-glucosa) modificado dieta artificial consumido por las larvas del mismo lote de insectos utilizados en (A), que sirve como el control . (C) Típica extracto de ADN metagenómico desde el tejido intestinal de larvas en el grupo de tratamiento 13 C-glucosa y en el grupo de control 12 C-glucosa. Tres réplicas biológicas (carriles 1, 2 y 3) se incluyen en cada grupo. M significa 1 kb de marcadores de ADN. (D) amplificación por PCR con un conjunto de cebadores bacteriana universal, genera las correctas productos génicos de 1,5 kb 16S rRNA utilizando el ADN metagenómico extraído como la plantilla. Las calles 1 es el control positivo de PCR. Carril 2 y 3 representan la muestra tratada C-glucosa 13 y el 12 de control C-glucosa, respectivamente. "target =" _blank jpg "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Esquema de un experimento de Pyro-SIP implica ultracentrifugación en gradiente de densidad de CsCl y la fracción de la caracterización con pirosecuenciación del ADN separado. H = mayor abundancia, L = menor abundancia. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. La diversidad bacteriana y la abundancia relativa en las fracciones pesadas de la glucosa alimentado larvas nativa (12 ADN-C de control) y 13 C-glucosa larvas alimentadas (ADN marcado con C 13)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
El intestino de la mayoría de los insectos alberga una comunidad microbiana rica y compleja, normalmente 10 7 -10 9 células procariotas se alojan allí, superando en número a las propias células del huésped en la mayoría de los casos. Por lo tanto, el intestino del insecto es un "punto caliente" para diversas actividades microbianas, que representa múltiples aspectos de las relaciones de microbios, de patogénesis obligar mutualismo 27. Aunque muchos estudios han descrito una variedad asombrosa de las comunidades microbianas del intestino del insecto, la caracterización de la actividad metabólica de la microbiota intestinal es rara. Enfoques de isótopos estables de sondeo ofrecen ahora una posibilidad para distinguir a los miembros activos de un fondo microbiota compleja independiente de cultivo e incluso in vivo. Aplicamos esta valiosa herramienta para el estudio de la microbiota intestinal en un modelo de sistema de insecto, gusano de la hoja del algodón (Spodoptera littoralis). Dado que la glucosa es el azúcar dominante en el intestino de gusano de la hoja de algodón, en esta demostración que alimentó el LARVAE con una dieta artificial se disparó con una dosis extra pero fisiológica de 13 C-glucosa para rastrear las bacterias metabólicamente activas en la flora intestinal. Una incubación idéntica establecido con glucosa nativa proporciona un control crítico para la comparación posterior para asegurar que cualquier aparente etiquetado de ácido nucleico no era un artefacto del método en sí, tales como alto contenido de G + C en el ADN que contribuye a la separación. El cerca de la concentración in situ de la glucosa reducidos adicionalmente sesgo experimental. Otras consideraciones relacionadas con un montaje experimental riguroso del estudio de ADN-SIP se ha discutido en otra parte 28,29. Las bacterias del intestino normalmente son metabólicamente muy activo y tiene tiempo de generación corto en comparación con los microorganismos de la mayoría de los ambientes terrestres y acuáticos. Así, un HR 24 alimentar continuamente ya causó un etiquetado significativo. Tenga en cuenta que una gran cantidad de ADN genómico anfitrión también fue extraídos simultáneamente de los tejidos intestinales, lo que debería de tomar encuenta a la hora de discutir los resultados.
La típica caracterización fracción de gradiente se basa en los métodos de toma de huellas digitales de baja resolución, como el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP), y la construcción de la biblioteca clon requiere mucho tiempo para vincular los datos. Es sólo recientemente que el advenimiento de la técnica de secuenciación de segunda generación de alto rendimiento permite un análisis rápido y rentable, y detallado de las comunidades microbianas complejas. Aquí se aplica esta nueva tecnología para examinar directamente la composición genética de las fracciones de gradiente de densidad e identificar bacterias metabólicamente activas, lo que dio una mayor sensibilidad en comparación con los métodos basados en la electroforesis en gel, y facilitamos clasificación filogenética posterior. Mediante la comparación de fracciones pesadas equivalentes tanto de marcado con C, el 13 y 12 muestras de control C, nos encontramos con que Pantoea y Enterococcus se convirtieron etiquetados sobre isótopo de sondeo. Una vez que el Metabbacterias olically activos han sido identificados, otros análisis, tales como la hibridación in situ fluorescente (FISH) usando sondas específicas y análisis metagenomic de la etiqueta de ADN se recuperaron de los miembros activos de la comunidad puede llevar a cabo para proporcionar una visión completa de los verdaderos simbiontes asociadas con el anfitrión . Basado en el sistema establecido aquí, otras fuentes de carbono marcado C-13 también se podría alimentar en el huésped para diseccionar las bacterias implicadas en la vía metabólica específica intestino, por ejemplo, el etiquetado de la celulosa para identificar bacterias activas que participan en el proceso de digestión de acogida. Con el desarrollo de estos nuevos enfoques, el papel de la microbiota intestinal de insectos se hará más evidente que en la actualidad.
Colectivamente, el protocolo descrito aquí representa un método sencillo, rápido, y eficaz para determinar las actividades metabólicas de la microbiota intestinal, que además podría ser aplicado para evaluar el papel específico de bacsimbiontes rial en la nutrición de acogida, desintoxicación, y la defensa.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Angelika Berg para la asistencia de laboratorio. Este trabajo fue apoyado y financiado por la Sociedad Max Planck y la Escuela de Jena para Microbiana Comunicación (JSMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
References
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