Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist Published: November 13, 2013 doi: 10.3791/50734
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology
* These authors contributed equally

Summary

קהילת החיידקים הפעילה הקשורים לבטן של littoralis Spodoptera, נקבעה על ידי יציב-חיטוט-איזוטופ (SIP) מצמידים את pyrosequencing. השימוש במתודולוגיה זו, זיהוי של מיני חיידקים הפעילים מטבולית בתוך הקהילה נעשה ברזולוציה גבוהה ודיוק.

Abstract

אומץ של רוב החרקים הם מיושבים על ידי קהילות מורכבות של חיידקי nonpathogenic סימביוטיים. בתוך קהילות של חיידקים כאלה ניתן לזהות מיני commensal או חיידקי mutualistic. אלה האחרונים, נצפו לשרת פונקציות רבות לחרקים, כלומר מסייעים ברבייה חרקים 1, לחיזוק התגובה החיסונית 2, ייצור פרומון 3, כמו גם תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, בין יתר.

בשל החשיבות של עמותות אלה, מאמצים רבים נעשו כדי לאפיין את הקהילות עד לחברים הבודדים. עם זאת, רוב המאמצים אלה היו מבוססים גם על שיטות גידול או הסתמך על הדור של שברי גני 16S rRNA שהיו רצף לזיהוי סופי. למרבה הצער, גישות אלה זוהו רק מיני חיידקים הנמצאים במעי ולא סיפקו informatיון על הפעילות המטבולית של מיקרואורגניזמים.

כדי לאפיין את מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים, השתמשנו איזוטופ היציב חיטוט (SIP) in vivo העסקת 13 C-גלוקוז כמצע אוניברסלי. זוהי טכניקה נטולת תרבות מבטיחה המאפשרת ההצמדה של phylogenies חיידקים לפעילות המטבולית שלהם בפרט. זה אפשרי על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון DNA ו-RNA 5. שילוב של 13 C איזוטופים לתוך ה-DNA מגביר את הצפיפות של ה-DNA שכותרתו בהשוואה לללא תווית (12 C) אחד. בסופו של הדבר, ה-DNA שהכותרת-C 13 או RNA הוא מופרדת על ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע מאחד 6 דומים 12 C-ללא התווית. הניתוח מולקולרי הבא של isotopomers חומצות הגרעין המופרד מספק את הקשר בין פעילות וזהות המטבולית של המינים.

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול המשמש כדי לאפיין את החיידקים הפעילים מטבולית במעיים של חרקים generalist (מערכת המודל שלנו), littoralis Spodoptera (פרפרים, Noctuidae). הניתוח פילוגנטי של ה-DNA נעשה באמצעות pyrosequencing, אשר אפשר ברזולוציה גבוהה ודיוק בזיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק. כמצע עיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C שימש בניסויים. המצע היה נמאס לחרקים באמצעות תזונה מלאכותית.

Introduction

עמותות סימביוטיים חרקים בקטריאלי ידועים מספר רב של מיני חרקים 7. בעמותות סימביוטיים אלה, מיקרואורגניזמים ממלאים תפקידים חשובים בצמיחה וההתפתחות של חרקים. חיידקים הוכחו לתרום לרביית חרקים 1, פרומון ביוסינתזה 3, תזונה, כוללים הסינתזה של חומצות אמינו חיוניות 4, ועיכול של מזון שאינו נגיש למארח. למרות המגוון העצום של עמותות בטן בקטריאלי, הרבה פחות ידוע על התפקיד הפונקציונלי שהם משחקים לטובתו של החרק. רק במקרה של הטרמיטים, העיכול הסימביוטי של lignocellulose בוצע על ידי פרוקריוטים, פרוטוזואה, ופטריות, נחקר באופן נרחב 8,9. בניגוד לכך, מעט מאוד ידוע על הקשר הסימביוטי ההווה במעיים של חרקים generalist כלומר leafworm הכותנה, Spodoptera littoralis. יתר על כן, בשל השינוי התכוף שלהם של מארחים צמח, כלליהחרקים ist וקהילות הבטן הקשורות החיידקים שלהם באופן קבוע חשופים לאתגרים חדשים הקשורים להרגלי האכילה שלהם לצרוך צמחים עם שפע של פיטוכימיקלים. לצד זה, את סביבת המעי בlepidopterans, מייצגת כשלעצמה סביבה קשה לצמיחה של חיידקים בגלל החומציות במעיים הגבוהה 10. במיוחד במקרה של ס ' littoralis, זה נע בין 10.5 במעי הקדמי, CA. 9 בmidgut לPH כמעט 7 ב11 המעי האחורי. מצד השני, קהילת החיידקים הקשורים לבטנו של ס ' littoralis הוא פשוט. טאנג, Freitak, et al 12. דיווח מרבי של 36 phylotypes השייך לסך של 7 מיני חיידקים שונים כמו רק לחברי קהילת חיידקים הקשורים לחרק הזה. חוץ מזה, אין הליך גידול מסובך דרוש להתפתחות החרקים במעבדה. יתר על כן, זה ומחזור החיים הקצר של החרק להקל רב גרםמחקרי enerational, הופך מין זה למערכת מודל אידיאלית לחקר אינטראקציות בטן חיידק.

עם כניסתו של טכנולוגיות רצף המבוססות על ה-PCR, מספר מחקרים העוסקים בהביוטה בטן של כמה אורגניזמים (בני אדם כלומר, חרקים, או יצורים ימיים) גדל. יתר על כן, התוצאות הן עצמאיות מבידוד והטיפוח של חיידקי המעיים טיפחו כמו בעבר. כמעט 99% מחיידקים אינם ראויים לעיבוד חקלאיים והסימולציה של התנאים הסביבתיים ששררו במעיים קשה 12. באמצעות PCR, שברי גן 16S rRNA (סמן בשימוש נרחב פילוגנטי גנים בין חיידקים) יכולים להיות מוגבר באופן סלקטיבי מתבנית ה-DNA מעורבת של קהילות חיידקי מעיים, רצף, ומשובט. בעזרת מידע זה, המשתמש יכול לזהות את מיני חיידקים לאחר אחזור מידע רצף ממאגרי מידע ציבורי 13,14. עם זאת, רצף מתקרב לתאר חיידקיםקהילות יישארו מספיק בשל חוסר המידע על תרומת חילוף חומרים הפנימית של המינים הבודדים בתוך הקהילה.

היציב-איזוטופ חיטוט (SIP) הוא טכניקה נטולת תרבות מבטיחה. הוא משמש לעתים קרובות במיקרוביולוגיה סביבתית לנתח phylogenies חיידקים קשורים לפעילות חילוף חומרים מסוימת. זו מושגת על ידי מעקב אטומים ממצעים יציבים, איזוטופ שכותרתו לתוך סמנים ביולוגיים של חיידקים, כגון חומצות המופקים מפוספוליפידים שומן, DNA, RNA ו5. כאשר שוקלים חומצות גרעין, מתודולוגיה מבוססת על הפרדת 13 DNA שכותרת-C או RNA מ-DNA ללא תווית ידי ultracentrifugation צפיפות שיפוע 6. בשל קשר ישיר זה בין תווית ה-DNA ואת פעילות חילוף חומרים, ניתוח מולקולרי במורד הזרם של חומצות הגרעין מזהה את המינים ומספק מידע על פעילות המטבולית. יתר על כן, שילוב של ה-DNA-SIP וpyrosequencing כפי שיושם על ידיPilloni, פון נצר, et al. 15, מאפשר זיהוי פשוט ורגיש במיוחד של מיני חיידקים המצויים בחלק ה-DNA הכבד 13 כותרת C. עד עכשיו, בטכניקה זו יושמה כדי לתאר את קהילות חיידקים מעורבות בתהליכי biogeochemical בקרקע בתנאים אנאירוביים ואירוביים 16,17 18,19. חוץ מזה של השימוש במדעי הסביבה, הטכניקה יושמה במדעי רפואה כפי שדווחה על ידי רייכרט, et al. 5, שתיאר את הפעילות המטבולית של קבוצות פילוגנטי שונות של חיידקי מעיים האנושיים בתגובה לפחמימות nondigestible.

כאן אנו משתמשים 13 C-גלוקוז ל'תווית 'את ה-DNA של מיני חיידקים הפעילים מטבולית במעיים. גלוקוז הוא סוכר מנוצל על ידי רוב מיני חיידקים לאורך השביל הנרחב Entner-Doudoroff (ED), אם כי ידועים חריגים 20. זהמצדיק את השימוש ב13 C-גלוקוז כמו בדיקה חילוף חומרים אמינה המספקת קשר בין מטבוליטים של עניין ומקור פחמן לאורך מסלולים הוקמו. בהתאם לשאלה המדעית, מצעים אחרים, כלומר 13 C-מתאן, 13 CO 2, או צמחים שהועלו תחת אווירת 13 CO 2, ניתן להשתמש בם כדי לטפל בפעילות המטבולית.

בשלב זה, אנו מציגים הפרוטוקול מיושם באפיון מטבולים של קהילת חיידקי המעיים של חרקים generalist, כלומר ס littoralis (פרפרים, Noctuidae). יתר על כן, הטכניקה הייתה מצמידים את pyrosequencing, אשר בתורו מאפשר זיהוי של קהילת חיידקי מעי חרק עם רזולוציה גבוהה ודיוק. כמצע העיקרי, 13 גלוקוז שכותרת-C נוצל במהלך הניסויים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. חרקים גידול

  1. לרכוש או להשיג אחיזת ביצים של Spodoptera littoralis מהגידול שלך. לשמור אותם בצלחות פטרי סטרילית בטמפרטורת חדר (RT) עד בקיעה.
  2. הכן את התזונה המלאכותית לחרקי גידול כדלקמן:
    1. משרים 500 שעועית לבנה אדמה גרם ללילה במים 100 מיליליטר.
    2. הוספת חומצה אסקורבית 9.0 גרם ו75 אגר גרם ל1,000 מיליליטר מזוקק H 2 O ולאחר מכן להרתיח אותו.
    3. תן לתערובת להתקרר וכשהוא מתמצק (לתערובת מוצקה דונגי לבן) לאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  3. העבר את הזחלים שבקעו זה עתה לקופסא פלסטיק נקייה ולגדל אותם על הדיאטה המלאכותית ב23-25 ​​מעלות צלזיוס תחת משטר יום ארוך עם 16 שעות של תאורה ו8 שעות של חשכה. לשנות את המזון בכל יום עד לזחלים לעבור את כל שש instars הזחל.

2. 13 C-תיוג של ה-DNA בחיידקים מעיים פעילים מטבולית

  1. ממיסים 186.1 מ"ג באופן מלא 13 גלוקוז שכותרת-C עם מים מזוקקים וdeionized (DDH 2 O) ומערבבים אותו היטב עם של דיאטה מלאכותית לניסוי SIP 100 גרם. להבטיח ריכוז 13 C-גלוקוז סופי של 10 מ"מ בתזונה המלאכותית. זה מחקה את ריכוז הגלוקוז באתרו בבטנו של ס ' האכלת littoralis זחלים על צמחי כותנה פי שאו et al. (הוגשה).
  2. העברת 9-15 זחלים בריאים שני instar מתיבת הגידול לצלחות פלסטיק סטרילי פטרי (זחל אחד לכל צלחת פטרי) המכילים 13 C-גלוקוז הטרי זינקו תזונה מלאכותית. השתמש בתזונה מלאכותית המכילה את אותה הכמות של גלוקוז ילידים (12 C-גלוקוז), כפי שתואר, להאכלה לקבוצת הביקורת.
  3. לחדש את התזונה המלאכותית לעתים קרובות במהלך תקופת הדגירה (יום 1). השתמש בתנאי גידול כמו בשלב 1.3.
  4. לאסוף תשעה זחלים מכל טיפול לעיבוד מאוחר יותר (מיצוי DNA). כללשכפל היווה ידי שלושה אנשים; לעשות לפחות שלושה משכפל לכל טיפול.

3. החרקים Dissection

  1. לנקות ולחטא את הכלים לנתח בתחילת העבודה עם אתנול 70% (כלים = מספריים Vannas, מלקחיים ואזמל עם להבים חד פעמי בסדר).
  2. קח את החרקים עם מלקחיים רכים ולשטוף את העור באופן שטחי שלהם עם מים מזוקקים. מניחים אותם על קרח לפחות 30 דקות כדי להרדים אותם.
  3. אמנם עדיין מורדם מקום אותם ב 0 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 להרוג אותם. לחטא את החרקים המתים באופן שטחי על ידי טבילתם באתנול (70%) במשך כמה דקות.
  4. לבצע את נתיחת החרקים להיקף של כ 15 מיליליטר של 1x PBS שהופקד על צלחת פטרי סטרילית (1XPBS = 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 4.3 מ"מ Na 2 HPO 4, 1.47 מ"מ KH 2 PO 4, התאם את ה-pH 7.4 , החיטוי). להיות בטוח שיש גוף החרק כולו שקוע לחלוטין בsolutיון במהלך כל התקופה לנתח.
  5. בגין לנתיחה על ידי ביצוע חתך בעור לאורך הצד הימני ושמאלי של החרקים, להתחיל בראש ולסיים בטבעת. הסר את העור כולו, tubules Malpighian, ושומן בגוף. שינוי לחיץ טרי לפני החיתוך פתוח המעיים. סעיף כאשר נדרשו הבטן בקדמת במה, באמצע, והמעי אחורי. אחסן את הרקמה במקפיא (-80 ל-20 מעלות צלזיוס) עד מיצוי DNA

4. הפקת DNA והגברה

  1. הנח את רקמת החרקים בצינור צנטריפוגות סטרילי 1.5 מ"ל ולייבש את כל הדגימות ב45 מעלות צלזיוס במכשיר רכז ואקום. קראש רקמה מיובשת עם העלי פלסטיק סטרילית.
  2. חלץ את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכה מתאימה למיצוי DNA אדמה. העברת הרקמה היבשה לצינור התגובה של הערכה ובצע את ההוראות כפי שצוין על ידי היצרן.
  3. קבע את הריכוז של ה-DNA eluted הסופי באמצעות ספקטרופוטומטר.
  4. Verifיא חילוץ מוצלח של ה-DNA metagenomic החיידקים ממעי החרק על ידי הכנת assay PCR לאבחון באמצעות פריימרים Eubacterial כלליים 27F (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) ו1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). הגדר את תגובת PCR כדלקמן:
    1. הגדרת תערובת תגובת 50 μl מכילה 1x הצפת, 1.5 מ"מ MgCl 2, ארבעה 10 triphosphates deoxynucleoside מ"מ (dNTPs), 2.5 U של תקי DNA פולימראז, 0.5 מ"מ של כל צבע יסוד ו60 ng של DNA שחולץ כתבנית.
    2. הפעל את תגובות PCR באמצעות thermocycler כדלקמן: denaturation ראשוני ב94 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים: 94 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות, חישול ב55 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, וסיומת ב72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות . השתמש צעד הרחבה סופי 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    3. ודא ההגברה PCR המוצלחת ב1% agarose אלקטרופורזה רומיד ethidium (EB) ג'ל המוכתם (להמס 1 גרם של agarose בשל 1x טה חיץ 100 מיליליטר וכתם עם 1μl EB). μl הפקדה 5 של המוצר ה-PCR + 1μl של צבע טעינת 6x לכיסי ג'ל. (1x טה = 40 מ"מ טריס-Base, חומצה אצטית קרחונית 20 מ"מ, 1 mM EDTA, להתאים ל-pH 8).
    4. הרץ את הג'ל באמצעות חיץ 1xTAE ב300 V, 115 mA לCA. 20 דקות בחדר אלקטרופורזה. על ידי שימוש בתא תיעוד ג'ל (transilluminator UV מחוברת למצלמה ומחשב דיגיטליים) לבחון את הג'ל ולהשוות את גודלו של המוצר הסופי שלך עם הסמן הגנטי נטען גם, את הגודל הנכון של amplicons חייב להיות של כ 1.5 kb.
  5. אחסן את מוצרי ה-PCR בתנאי הקפאה עמוקים, מעדיף -80 מעלות צלזיוס, עד לשימוש.

5. הפרדה-CsCl DNA Gradient ultracentrifugation

  1. הכן את חומרים כימיים למילויים לultracentrifugation כדלקמן:
    1. הכן M צזיום כלוריד (CsCl) פתרון 7.163 ידי המסת הדרגה 603.0 גרם של CsCl DDH 2 O ולמלא עד נפח סופי של 500 מיליליטר.
    2. דה באופן מדויקtermine הצפיפות של פתרון CsCl מוכן על ידי שקילת aliquot 1.0 מיליליטר באיזון בן שלוש ספרות בשלושה עותקים. זה בדרך כלל נע בין 1.88 ו1.89 ג'/ מיליליטר ב RT.
    3. הכן את חיץ השיפוע (100 מ"מ טריס, 100 מ"מ KCl ו1 mM EDTA) על ידי שילוב של 50 מיליליטר של 1 M טריס-HCl (pH 8.0), 1 מיליליטר של 0.5 M EDTA (pH 8) ו3.75 גרם של KCl בגמר נפח 500 מיליליטר באמצעות DDH 2 O. לסנן (0.22 מיקרומטר) לעקר וחיטוי פתרון זה.
  2. הפרדת ה-DNA
    1. משקבענו הריכוז הבודד DNA של החרקים שטופלו, כפי שנמדד בנקודת 4.3, בריכה אלה החרקים המתאימים ללשכפל יחד ולנרמל את ריכוז ה-DNA שלהם, כדי להבטיח שכל אחד מהם, באותה מידה, תורם למדגם ונקווה. ריכוז סופי של 500-5,000 ng של DNA (למדוד שוב את הריכוז הסופי) הוא מתאים לתהליך ultracentrifugation 21.
    2. כדי להגדיר את השיפוע בינוני, לשלב את ה-DNA לכימות, חיץ שיפועד 4.8 מיליליטר של 7.163 פתרון M CsCl יחד כדי נפח מעורב של 6.0 מיליליטר בצינור בורג יתר 15 מיליליטר סטרילי (דור מתערובת הבינוני DNA שיפוע).
    3. הנח בזהירות את התערובת הבינוני DNA שיפוע מוכן לתוך צינור ultracentrifuge 5.1 מיליליטר (למלא עד בסיס צוואר הצינור) באמצעות מזרק ומחט. הימנע משאיבה או להרכיב כל בועות אוויר. כולל שיפוע ריק אחד לפחות (באמצעות DDH 2 O במקום דנ"א) בכל ריצת צנטריפוגות כשיפוע התייחסות.
    4. זוגות צינור איזון בתוך 10 מ"ג משקל לאחר כל מדיום שיפוע הנדרש מלא לתוך צינור ultracentrifuge בהתאמה. לאטום הצינור עם "טופר Tube" ולהבטיח כי החותם הוא דליפה בחינם על ידי צינור היפוך והפעלת לחץ מתון בעבודת יד.
    5. השתמש הרוטור אנכי קרוב עם שמונה בארות להחזקה 5.1 צינורות ultracentrifugation מיליליטר לultracentrifugation. לאטום היטב את בארות הרוטור ולטעון את הרוטור לתוך ultracentrifuge פי maההוראות של nufacturer. הגדר את תנאי ultracentrifugation: ספין על 50,000 סל"ד (בערך 177,000 XG), טמפרטורה על 20 מעלות צלזיוס, וultracentrifugation זמן ריצה במשך שעה 40 עם ואקום. בחר ההאצה המרבית ואת ההאטה ללא בלמים.
    6. סיימו פעם אחת, להסיר בזהירות את הצינורות מן הרוטור צנטריפוגות באמצעות מלקחיים. למקם אותם במעמד מבלי להפריע הדרגתיים נוצר בתוך הצינורות. לעבד את דגימות חלוקה הדרגתיות בהקדם האפשרי כדי למזער דיפוזיה.
  3. שליפה של ה-DNA מעירובי Isopycnic פרוד ידי היפוך חלוק
    1. השתמש במערכת משאבת HPLC מדויקת לבצע חלוקה הדרגתית, אשר באותה מידה שמפרידה הדרגתיים נוצרו משיטת עקירת הצינור העליונה ultracentrifuge. חבר את משאבת HPLC (100% זרימת שיפוע) לבקבוק מלא בעקירת L 1 DDH 2 O והדוק לצרף את צינור המשאבה הפתוח עם 23 G 1 במחט מזרק. הוספה ב מספיקromophenol צבע כחול לDDH 2 O כדי לתת לו צבע כחול כהה. זה מאפשר ההדמיה של הממשק בין מדיום השיפוע והעקירה של DDH 2 O.
    2. הגדר את המשאבה לקצב זרימה של 850 μl / min ולאזן את המערכת עד טיפה אחת של DDH בצבע הכחול 2 O נובע מתוך את מחט המזרק.
    3. לתקן בזהירות את צינור ultracentrifuge לעמדת מהדק ולנקב את החלק התחתון של הצינור עם מזרק 23 1 G במחט ארוכה. חבר את המשאבה לצינור ultracentrifuge על ידי החדרת המחט מחוברת לצינורות המשאבה לתוך החלק העליון של הצינור, ולאסוף טיפות מלמטה ישירות לתוך צינורות 1.5 microcentrifuge מיליליטר סטרילי. לאסוף שבריר כל 30 שניות, בסך של כ 425 μl לשבריר וכולל של 12 שברים לשיפוע. שים לב שהחלק האחרון (חלק 12) מכיל בדרך כלל העקירה DDH 2 O וצריך להיות מושלך.
    4. לאחר חלוקה,asure הצפיפות של כל השברים המופרדים באמצעות איזון אנליטיים כאמור בשלב 5.1.2.
    5. להאיץ את ה-DNA מכל חלק (בסביבות 425 μl) על ידי הוספה הראשונה גליקוגן 1 μl (20 מיקרוגרם / μl ב DDH 2 O, autoclaved) כנשא למשקעים של כמות הנמוכה של ה-DNA. מערבבים אותו היטב על ידי היפוך.
    6. הוסף שני כרכים (850 μl) של פוליאתילן גליקול פתרון (PEG) (לפזר 150 גרם של פוליאתילן גליקול 6000 ו46.8 גרם של NaCl בDDH 2 O בהיקף כולל של 500 מיליליטר. סינון, לעקר וחיטוי. פתרון PEG הוא 30 % PEG 6000 ו1.6 M NaCl), ומערבבים שוב על ידי היפוך עשר פעמים.
    7. השאר את הצינורות על RT במשך לפחות שעות (אם יש צורך, לילה) כדי לזרז את ה-DNA.
    8. צנטריפוגה משקעים ב13,000 XG במשך 30 דקות ב RT. גלולה גלויה צריכה טופס.
    9. מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ולשטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. צנטריפוגה תחת אותהתנאים ל10 דקות שוב.
    10. להשליך בזהירות את supernatant ואוויר יבש גלולה ב RT במשך 15 דקות.
    11. Redissolve גלולה DNA המיובש ב30 μl של DDH 2 O ומערבבים היטב בעדינות על ידי הקשה על הצינור. לכמת את ה-DNA בכל שבריר שיפוע כמו בשלב 4.3 חנות הדגימות תחת -20 או -80 מעלות צלזיוס, אם נדרש אחסון לטווח ארוך.

6. ה-DNA אפיון ידי pyrosequencing

  1. ודא כי ה-DNA המקורי ללא תווית (12 C) תופס טווח הצפיפות מ1.705 גר '/ מיליליטר ל1.720 גר' / מיליליטר, ואילו 13 DNA שכותרת C יש צפיפות של כ 1.720-1.735 גר '/ מיליליטר. שים לב שהילידים ו13 DNA שכותרת C שנלקח דגימות סביבתיות הן יכולים להקיף כמה שברי שיפוע. מצפה את ה-DNA האור להיות מזוהה עם שברים 9-11 וה-DNA הכבד להיות מזוהה עם שברים 4-6.
  2. שלב את השברים מפתח ליצור ac יחיד "הידור" נציג שברירcording להקצאת השיא הספציפית של ה-DNA-נפתר הצפיפות. לחלופין, באמצעים אחרים כדי לבחון את השברים המופרדים באמצעות ספקטרומטריית איזוטופי ההמונית יחס (IRMS) 22 או שיטת טביעת אצבעות, כגון denaturing ג'ל אלקטרופורזה שיפוע (DGGE) 23, יכולים לעזור לבחור שברים מתאימים לפני רצף.
  3. בצע pyrosequencing של rRNA 16S חיידקי גנים מוגבר-PCR מכבדים, בינוניים וקלים שברים הידור של כל שיפוע בודד. באמצעות שיטה זו, זיהוי של השושלת ושפע יחסי של מיני חיידקים פעילים מטבולית בSIP מודגרות דגימות אפשרית. בצע pyrosequencing כדלקמן:
    1. בצע pyrosequencing amplicon באמצעות מכשיר FLX רוש 454 עם ריאגנטים טיטניום.
    2. הכן amplicons המינימרקטים לריבוב באמצעות פריימר ההיתוך להגדיר Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) וGray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) 24,25 מורחב עם הדואר / B בהתאמה פריימר מתאם ומזהה מדגם ספציפי זמנית (MID).
    3. החל PCR צעד אחד עם 30 מחזורים, באמצעות פולימראז חם התחל תקי, על מנת ליצור את ספריית רצף.
    4. רצף amplicons מבוססת על פרוטוקול הספק, ולהאריך את קוראת מהכיוון קדימה (Gray28F) כפי שמתואר בhttp://www.researchandtesting.com/.

7. ניתוח נתונים pyrosequencing

  1. לנתח את רצף גלם כניסות שנוצר על ידי pyrosequencing 454 עם "תובנות כמותית לאקולוגיה של חיידקים", תוכנת QIIME צינור 26. לבצע עיבוד כדלקמן:
    1. בתחילה, להמיר את הקובץ שנוצר SFF-454 מכונת לקבצי Flowgram FASTA, Qual ועם תסריט process_sff.py.
    2. לאמת את קובץ המיפוי (המבוסס על check_id_map.py) ולהקצות מרובבים קוראת לסם הביולוגיples עם תסריט split_libraries.py. לקצץ באיכות נמוכה מסתיימת בגודל חלון הזזה של 50 ופרמטר הפסקת איכות ממוצעת של 25, לחסל גם רצפים מעורפלים קצרים (האורך <200 נ"ב) מבסיס הנתונים.
    3. Denoise 454 נתונים באמצעות denoise_wrapper.py.
    4. בשלב הבא, אשכול באיכות גבוהה קוראת ליחידות הטקסונומי תפעוליות (otus) תוך שימוש בשיטה מרובה OTU הקטיף (pick_otus.py עם 97% דמיון רצף לחתוך-offs).
    5. פיק רצף נציג מכל OTU באמצעות pick_rep_set.py.
    6. הקצאת טקסונומיה לקבוצת רצף נציג המבוססת על assign_taxonomy.py. השתמש מסווג פרויקט מאגר נתונים של ריבוזומלי (RDP) עם ביטחון עצמי מינימאלי למשימת שיא שנקבעה ל0.80.
    7. יישר את רצף הנציג להגדיר נגד רצפי ליבת prealigned Greengenes 16S באמצעות האלגוריתם PyNast (align_seqs.pyעם הסט המינימאלי רצף זהות אחוזים ל75).
    8. בנוסף, לרוקן מפלצות מניתוח נוסף על ידי הפעלת identify_chimeric_seqs.py.
    9. הסר את כל עמדות הפער (לא שימושיות להיקש פילוגנטי) עם תבנית lanemask (filter_alignment.py) לקראת בניית עץ פילוגנטי (make_phylogeny.py).
    10. לבסוף, ליצור טבלאות OTU עם make_otu_table.py, המתאר את ההתרחשות של phylotypes חיידקים בתוך מדגם זה. השתמש בטבלת OTU לבנות Heatmap להשוואת השפע ופעילות חיידקים.
    11. במידת הצורך, לחשב את אלפא ובטא גיוון בתוך ובין דגימות, בהתאמה. באותו אופן, עקומות ואקום (גרפים של גיוון לעומת עומק רצף) וחלקות עיקרי קואורדינטות ניתוח (PCoA) המייצגות את היחסים בין קהילות של חיידקים יכולים להיות גם מוכנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להשיג תיוג מספק של החיידקים הפעילים מטבולית הווה בבטן החרק, החרקים צריכים להיות חשופים למצע C עשיר ב13 לתקופה מותאמת בעבר מספיק כדי לאפשר את ההפרדה של חלק קטן יותר כבד שכותרתו בקלות מללא תווית בהירה אחד. במקרה שלנו, 13 C-גלוקוז נוספו בתזונה המלאכותית בריכוז סופי של 10 מ"מ ליום 1 (איור 1 א). אותה הכמות של גלוקוז הנורמלי (איור 1 ב) סופקה בתזונה המלאכותית של החרקים השליטה. כפי שהוזכר קודם, הפרדה שברי ה-DNA (כבדה יותר מקל) היא הבסיס לכל התהליך. לכן, הצעד הראשון שיש לבצע הוא המיצוי של דנ"א מהרקמות של עניין, במקרה זה, לקהילת החיידקים הקשורים בבטן החרק. כדי לאשר את איכותו חשוב להפעיל ג'ל אלקטרופורזה כדי לקבוע אם כל ה-DNA בכלל התקבל מanalyרקמת zed. באיור 1 ג, זה הנצפה להקה חזקה של הדנ"א הגנומי בחלק העליון של התמונה המאשרת את מיצוי DNA החיובי. בנוסף, יש צורך לבצע PCR לאבחון, תוך שימוש בצבעים יסוד אוניברסלי בקטריאלי, כדי לקבוע את נוכחותו של ה-DNA בקטריאלי (1D איור). תוצאה חיובית זה חשוב כדי להחליט אם להמשיך עוד יותר עם ההפרדה של ה-DNA metagenomic חילוץ.

לאחר ultracentrifugation, ברגע שהכמות של ה-DNA בכל חלק מופרד הוא אישר, וכן המדידה של הצפיפות נעשה, להתוות את הצפיפות הממוצעת בחלק ג'/ מיליליטר על פני מספר שבריר כדי לאשר את המבנה הנכון שיפוע בצינורות, אשר בדרך כלל מכסה טווח צפיפות מ1.690 (לשבריר 12 או 11) גרם / מיליליטר 1.760 גר '/ מיליליטר (לחלק 1). pyrosequencing כמותיים מבוצע ישירות על הדרגות SIP נציג לחשוף את שושלת מינים ושפע יחסי (איור 2 13 C-גלוקוז והשליטה ללא תווית, ששימשה לאפיון אוכלוסיות פעילים בקהילה. לאחר רצף, סך של 120,045 באיכות גבוהה קורא עם אורך ממוצע של 404 נוקלאוטידים נוצרו. פרופיל pyrosequencing הראה שפע מוגבר של מינים מסוימים הכוללים אנטרוקוקוס וPantoea במדגם שכותרתו (13 DNA שכותרתו C, איור 3) בהשוואה לזה בקבוצת הבקרה (Control 12 C-DNA, איור 3). לכן חיידקים אלה נחשבים פעילים מטבולית, וכשרון מחקר נוסף.

איור 1
ניסוי איור 1. 13 האכלת C-גלוקוז, מיצוי DNA והגברת PCR של 16S rRNA gen החיידקים דואר. גלוקוז ילידים () 13 C-גלוקוז תוקן תזונה מלאכותית הנצרכת על ידי Spodoptera littoralis זחלים. (ב) (12 C-גלוקוז) תוקן תזונה מלאכותית הנצרכת על ידי זחלים מאותה הקבוצה של חרקים המשמשים ב(), המשמשת כשליטה . (C) תמצית אופיינית metagenomic DNA מרקמת המעי של זחלים בקבוצת טיפול C-גלוקוז 13 ובקבוצת ביקורת 12 C-גלוקוז. שלושה משכפל ביולוגי (מסלול 1, 2 ו -3) כלולים בכל קבוצה. M עומד על סמן ה-DNA kb 1. ההגברה PCR (ד ') עם סט פריימר חיידקים אוניברסלי מייצר מוצרי גן 1.5 kb 16S rRNA הנכונים באמצעות DNA metagenomic חולץ כתבנית. מסלולי 1 הוא הבקרה החיובית PCR. ליין 2 ו -3 מייצגים את מדגם 13 C-גלוקוז טופל ושליטת 12 C-גלוקוז, בהתאמה. "Target =" _blank jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. קווי המתאר של ניסוי Pyro-SIP מעורב ultracentrifugation צפיפות CsCl שיפוע ואפיון שבריר עם pyrosequencing של ה-DNA המופרד. H = שפע גבוה יותר, L = שפע נמוך. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. גיוון חיידקים ושפע יחסי בשברים הכבדים של הזחלים האם של גלוקוז האכיל (12 DNA C-שליטה) ו13 הזחלים האכילו C-גלוקוז (ה-DNA שכותרת-C 13)./ "= היעד" _blank www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבטן של רוב החרקים נמלי קהילת חיידקים עשירה ומורכבת, בדרך כלל 10 7 -10 9 תאים פרוקריוטים להגיש שם, מספרם עולים בתאים של המארח ברוב המקרים. לכן, תחושת הבטן של החרק היא "נקודה חמה" לפעילות של חיידקים מגוונים, המייצגים היבטים שונים של מערכות יחסים של חיידקים, מפתוגנזה לחייב הדדיות 27. למרות שמחקרים רבים תארו מגוון מדהים של קהילות חיידקי מעי חרק, אפיון של פעילות חילוף חומרים של חיידקים במעיים הוא נדיר. גישות איזוטופ חיטוט יציבים מציעות כעת אפשרות להבחנה החברים הפעילים מרקע חיידקים מורכב עצמאי של טיפוח ואפילו in vivo. אנחנו מוחלים זה כלי רב ערך כדי ללמוד את החיידקים במעיים במערכת מודל חרק, תולעת עלה כותנה (Spodoptera littoralis). מאז גלוקוז הוא הסוכר הדומיננטי במעיים של leafworm כותנה, בהפגנה זו האכלנו larVAE עם דיאטה מלאכותית מהול במנה נוספת, אבל פיזיולוגית של 13 C-גלוקוז כדי לעקוב אחר החיידקים הפעילים מטבולית בפלורת המעיים. דגירה זהה הוקמה עם גלוקוז האם סיפקה שליטה קריטית להשוואה שלאחר מכן על מנת להבטיח שכל תיוג לכאורה של חומצות גרעין לא היה תוצר של השיטה עצמה, כגון תוכן C הגבוה G + ב-DNA תורם להפרדה. ליד בריכוז באתרו של גלוקוז בנוסף מופחת הטיה ניסיונית. שיקולים אחרים הקשורים להתקנה ניסיונית קפדני של מחקר DNA-SIP כבר דנו במקום אחר 28,29. חיידקי המעיים בדרך כלל הם מטבולית פעילים מאוד ויש לי זמן דור קצר בהשוואה למיקרואורגניזמים מרוב הסביבות יבשתיים וימיות. לפיכך שעה 24 רציפות ההאכלה גרמה כבר תיוג משמעותי. שים לב שכמות גדולה של הדנ"א הגנומי מארח גם coextracted מרקמות המעי, שאמור להיות תוךחשבון בעת ​​דיון בתוצאות.

אפיון שבריר שיפוע הטיפוסי מסתמך על שיטות טביעת אצבע ברזולוציה הנמוכה, כגון פולימורפיזם מסוף בר הגבלת אורך (T-RFLP), ובניית ספריית שיבוט זמן רב כדי לקשר את הנתונים. זה רק לאחרונה כי כניסתו של טכניקת רצף דור שני תפוקה גבוהה מאפשרת ניתוח של קהילות חיידקים מורכבות מהיר, יעילה וחסכונית, ומפורט. כאן אנו מיושמים טכנולוגיה חדשה זו לסקור באופן ישיר את ההרכב הגנטי של שברים שיפוע צפיפות ולזהות חיידקים פעילים מטבולית, אשר נתנו רגישות משופרת בהשוואה לשיטות המבוססת על ג'ל אלקטרופורזה, ואפשרו סיווג phylogenic שלאחר מכן. על ידי השוואת שברים כבדים שווי ערך משני שכותרתו C 13 ו12 דגימות C-שליטה, אנו מוצאים כי Pantoea ואנטרוקוקוס הפכו כותרת על איזוטופ חיטוט. ברגע שmetabחיידקי olically פעילים זוהו, ניתן לבצע ניתוח אחר כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH) באמצעות בדיקות ספציפיות וניתוח metagenomic של ה-DNA שכותרתו התאושש מחברי הקהילה פעילים כדי לספק תובנה מקיפה לתוך הסימביוזה האמיתית הקשורים למארח . בהתבסס על המערכת שהוקמה כאן, מקורות פחמן שכותרת-C 13 אחרים יכולים גם להיות מוזנים לתוך המארח לנתח את החיידקים מעורבים במסלול מטבולי הבטן הממוקד, למשל, תיוג תאית כדי לזהות חיידקים פעילים מעורבים בתהליך העיכול המארח. עם התפתחותה של גישות חדשות, כגון, את תפקידו של חיידקים במעיים חרקים יהפוך ברור יותר מאשר כיום.

באופן קולקטיבי, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה פשוטה, מהירה, ויעילה לקביעת פעילות המטבולית של החיידקים במעיים, אשר עוד יכול להיות מיושמים על מנת להעריך את התפקיד הספציפי של bacteסימביוזה עם ריאל בתזונת המארח, סילוק רעלים, והגנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgments

אנו מודים לאנג'ליקה ברג לסיוע מעבדה. עבודה זו נתמכה ומומנה על ידי אגודת מקס פלנק ובית הספר ליינה למיקרוביאלית תקשורת (JSMC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Mirror Finish Forceps Fine Science Tools 11251-23  
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00  
Speed Vacuum Concentrator 5301 Eppendorf Germany 5305 000.304  
Plastic pestle Carl Roth GmbH Co. Germany P986.1  
NanoVue spectrophotometer GE HealthCare, UK 28-9569-58  
Mastercycler pro/thermocycler Eppendorf Germany 6321 000.515  
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber Biometra Discontinued  
Ultracentrifuge (Optima L-90K) Beckman A20684  
Ultracentrifuge rotor (NVT 90) Beckman 362752  
HPLC pump Agilent 1100  
Quick-Seal, Polyallomer tube Beckman 342412  
Transilluminator UVstar 15  Biometra  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
  2. Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
  3. Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
  4. Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
  5. Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
  6. Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
  7. Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
  8. Brune, A. Encyclopedia of Insects. VH, R. esh, Cardé, R. T. , Elsevier. 1132 (2005).
  9. Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
  10. Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
  11. Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
  12. Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
  13. Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
  14. Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution - a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
  15. Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
  16. Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
  17. Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
  18. Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
  19. Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
  20. Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
  21. Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
  22. Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
  23. Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
  24. Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
  25. Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
  26. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
  27. Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
  28. Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
  29. Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing - linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).

Tags

מיקרוביולוגיה גיליון 81 חרקים רצף ניתוח גנטיקה חיידקים חיידקים פרפרים, יציב-איזוטופ-חיטוט (SIP) Pyro-רצף, מעיים חיידקים חיידקים
זיהוי של חיידקים פעילים מטבולית במעיים של Generalist<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; באמצעות איזוטופ יציב DNA גשוש שימוש<sup&gt; 13</sup&gt; C-גלוקוז
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shao, Y., Arias-Cordero, E. M.,… More

Shao, Y., Arias-Cordero, E. M., Boland, W. Identification of Metabolically Active Bacteria in the Gut of the Generalist Spodoptera littoralis via DNA Stable Isotope Probing Using 13C-Glucose. J. Vis. Exp. (81), e50734, doi:10.3791/50734 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter