总钙在神经元的电子探针X射线显微分析测量

Summary

本文介绍cryoanalytical电子显微镜对总钙含量和分布在生理上定义的生物标本亚细胞分辨率的定量测量中的应用。

Abstract

在这篇文章中使用被称为电子探针（EPMA）技术的工具，手段，以及适当的细胞内元素含量的定量测量工具的描述。线粒体内钙是因为线粒体钙超载起着神经退行性疾病中的关键作用特别关注。该方法是基于X射线的分析电子显微镜（EM）由与试样的电子束的相互作用而产生的。为了保持在电子显微镜标本的扩散性元素的天然分布，EPMA需要组织随后的超薄冷冻切片的制备“冷冻固定”。培养的细胞或器官切片文化的快速冷冻是通过急跌液态乙烷或满贯冷冻结冰对寒冷的金属块，分别。名义上冰冻切片80 nm厚的是在约切干用钻石刀。 -16076，C，安装在碳/聚乙烯醇缩醛涂层的铜网上，并cryotransferred成冷冻电镜使用的是专门的cryospecimen持有人。视觉测量和位置映射在≤-160℃和低的电子剂量后，冷冻水合的冷冻切片冷冻干燥在-100℃下进行约30分钟。干冰冻切片的细胞​​器级别的影像录制，也以低剂量，通过慢扫描CCD相机和选作分析的兴趣亚细胞区域的手段。由一个固定的，集中的，高强度的电子探针从感兴趣区域发射的X射线是由能量色散X射线（EDX）光谱仪，由相关联的电子处理，并提出了作为X-射线谱收集，也就是一个情节X射线​​强度与能量。其他软件方便：1）识别元素成分通过他们的“特色”峰能量和指纹，以及2）提取的峰面积/背景定量分析。本文总结了两个例子来说明典型EPMA的应用程序，其中一个线粒体钙分析提供了重要的见解兴奋性毒性损伤和其他的，揭示缺血阻力的基础机制。

Introduction

钙离子可以说是生物学中最重要和最多才多艺的细胞信号转导的实体，打在正常过程中的重要作用等不同的突触传递和基因表达。在另一方面，钙​​是在细胞死亡同样重要。特别是，钙放松管制是在行程的一个关键因素在神经元损伤，帕金森氏症，阿尔茨海默氏病和其它神经变性疾病^3,5。因此，这是极其重要的，定量了解如何钙的细胞内分布，以及该改变下列生理或病理生理的刺激。在溶液中游离或结合到基体 - - 这细胞的钙浓度超过几个数量级为刺激的结果改变这个目标是由事实，钙是动态两个物理状态之间分布复杂。

虽然有可供fr的分析几个先进的方法ee值细胞内钙，总钙浓度定义胞内区室中的确定是切实限于一种方法，即，电子探针显微分析（EPMA）。 EPMA是一种技术，伴侣的X-射线光谱仪的透射电子显微镜（TEM）。透射电子显微镜的电子枪聚焦一个静止的，亚微米电子探针的利益和作为发射电子轰击而产生的元素特有的X射线的亚细胞区域收集和分析（见参考文献^7,4的详细技术审查）。 EPMA的优点包括单细胞器级的分辨率和submillimolar灵敏度。然而在实践中，EPMA需要专门cryotechniques和仪器对样品的制备和分析。在这里，工具，技术和适用于使用电子探针细胞内钙离子的测量仪器进行了描述。线粒体内钙的特殊Interest是考虑的关键作用，在神经退行性疾病线粒体钙超载的戏剧。

Protocol

这里介绍的方法是使用专用仪器，工具和软件开发。因为实验室将不会使用相同的实验装置，该方法是广义的，其中可能的。

1。快速凝固

将要描述的分析方法是绝对依赖于低温的方法为：细胞或组织中的1）中的“冷冻固定”的方式，定量保留扩散性的组织成分和化学元素的分布，因为他们是在活细胞在冷冻的瞬间和2）极薄的制备冷冻切片适于成像和分析中的TEM。这些技术进行了简要这里描述的，但必须在其他实验室中重现这些程序的细节超出了本文的范围。有兴趣的读者可以参考最近的优秀文章^9,14。

注意：本节介绍了使用的理趣efied乙烷，它是高度易燃的和潜在的爆炸性，适当应采取预防措施。运营商还必须熟悉液氮（LN _2）安全防范措施，包括防护实验室外套，眼镜，手套cryoresistant。注意：这里并贯穿始终，所有的工具（镊子等 ）用于处理冷冻样品必须在预冷₂号法律公告前使用，以避免意外解冻。

盖玻片上培养的细胞

1. 通过在_液氮冷却的中央以及冷凝气态乙烷在-160℃下准备暴跌冷冻设备。填至刻度并覆盖好与枢转铝盖在不使用时。
2. 用滤纸楔子，在适当的实验条件下薄水薄膜涂抹塑料盖玻片培养细胞。从边缘涂抹，以避免接触组织;理想的残留膜，通过试验和错误决定，是尽可能薄，但不能因此次在作为蒸发并允许组织表面的干燥。
3. 通过用夹紧钳的边缘保持盖玻片，迅速浸入液态乙烷中，可以手动或使用重力驱动的柱塞。
4. 将冷冻的盖玻片在附近的保丽龙碗₂号法律公告，大到足以操纵盖玻片所需数量为长期储存容器。铝制旋盖罐不低于₂号法律公告抢占建议。

培养的脑片急速冷冻

5. 在解剖显微镜下，查看和东方的海马脑片，不受干扰，仍然附着在文化隔膜插入。放置基准标记上的切片用黑色Sharpie笔型笔和照片的边缘附近的膜。
6. 仍然在显微镜下，切出约。 5×5毫米的正方形膜与围绕在广场各个切片。避免接触片或弯曲卷材Ë。
7. 装载的膜支撑片，通过一个¼直径琼脂垫缓冲，在自定义设计的铝制圆盘制成，以适应cryoultramicrotome（如下所述）。迅速通过气动用定制的“大满贯冻结”的设备来推动它针对_液氮冷却的蓝宝石块冷冻切片。
8. 移动到存储所描述的培养细胞。

2。 Cryosectioning

警告：成功地生产的超薄切片，干切带，而直接的和逻辑，需要培训，耐心和相当的实践。

1. 烘烤配备了cryoattachment，冷却至-135℃的cryoultramicrotome
2. 切冷冻盖玻片到约。使用锋利，预冷手术刀3×3平方毫米。嵌入件与培养朝上的粘性液体“cryoglue”（1:6混合物的乙醇和2 -丙醇^11），在标准的3mm直径的铝销设计，以适应切片标本夹头。避免泄漏cryoglue到培养表面。通过降低cryobox温度≤-160℃，凝固cryoglue
   • 冷冻的大脑切片，安全地通过螺钉领的方式直接连接光盘定制的标本夹头。
3. 修剪冷冻样品选定的地区- 例如细胞丰富的盖玻片片切片或确定区域的区域-一个大约。使用金​​刚石修整工具250×250微米的块面和〜100μm的深度。
4. 干式切削丝带薄片在约使用35°菱形cryoknife -160℃，基本上与referencs ^4,9描述。切削速度和刀具后角是凭经验确定，一个好的出发点是0.4-0.6毫米/秒，9°。公称厚度的水合部分， 即提前试片，我通常S 80纳米，虽然部分实际上是1.5-2.0倍厚，主要是由于压缩。对于满意的切片，防静电设备是必不可少的。放置的装置0.5-1厘米的刀口电离​​尖端和调整输出功率，直到部分满意丝带生产。
5. 用胶水（环氧树脂）睫毛木涂药棒准备睫毛探头。使用这样的探头，拿起并从刀背部分转移到辉光放电，碳包覆投过100目折叠铜网上聚乙烯醇缩醛支持电影和休息，在后面的工作架的半折叠铟箔的信封刀。倍，在电网和包络线的上半部分中，按与冷压工具。
6. 转移网格包裹在铝方便的格箱和存储可以在步骤1.4中所述。

3。试样Cryotransfer到电子显微镜

核心仪器电子探针在这个实验室是在120千伏操作，并配备用于低温显微镜，即，被设计用干净的真空中，试样面积anticontaminator，一个2K的x 2K高灵敏度数字相机和cryotransfer试样夹持器的分析电子显微镜。事先检查显微镜定位及经营状况的低收入和高倍率模式，并确认满意柱上真空，理想^≤10-7乇。必要调补。

1. 确认cryoholder的杜瓦组件的真空绝热是令人满意的。泵是必要的。
2. 冷却cryoholder到最低温度，至少-160℃，同时在显微镜载物台在高真空下，拆下固定器连接到它的控制箱的电缆。取出支架，以尽量减少LN ₂蔓延到运营商和显微镜表面前测角45°顺时针倾斜。
3. 通过冷却的积分INSULATE准备台式cryoworkstationD罩杯为≤160°C。
4. 转移（quickly!）从显微镜冷却cryoholder到低温工作站。收回持有人的霜冻盾。
5. _液氮储存和地方上的cryoworkstation的工作表网格夹层下检索。保持环为持有人的样本以及还放在桌子上。
6. 打开信封铟和移动封闭折叠网格的cryoholder的标本很好。确保电网与使用提供并关闭霜盾扳手工具扣环。
7. 从cryoworkstation快速去除cryoholder并插入显微镜的气闸并通过泵送次序尽快。在插入时，应该有柱真空的干扰降到最低。
8. 返回测角为0°倾斜。重新连接和恢复活力的控制盒，并确认样品温度≤150℃。
9. 笔芯的杜瓦试样夹具，并允许真空和温度才能完全恢复。

4。第可视化调查

1. 收回持有人的霜盾揭露标本，把电子束上。
2. 视觉评定试样在低倍镜下，通常250X和低照明。作为如图1中所示，区段应该是薄且光滑，未折叠或重叠，平整以及连接到支撑片，一般不是由尘棒遮蔽。
3. 可选的拍摄选择的章节。 （注：最小化束曝光，因为冷冻水合部分是很容易受束引起的损伤。）使用自动化数字测角台存储选定部分的坐标。

5。冷冻干燥的节

1. 冷冻干燥的部分通过增加保持器温度升高到约-100℃，〜30分钟。
2. Recool持有至-160°C或以下。

6。细胞和细胞器的成像

冷冻干燥的部分结构的图像在约得到。 -160°C的低剂量，使用一个2K x 2K慢扫描CCD相机通过适当的软件控制的数字化记录的零损耗的图像。

1. 激活的EM HI-MAG模式。
2. 在〜2000倍，并选择图像（如TIFF格式，参见图2）选择的细胞，并在高品质的部分，其位置被预先记录和存储的兴趣的亚细胞区域。 （注：将干燥后的部分，现在大大减少脆弱，不易受到电子束的损坏。
3. 为了选择感兴趣区域（投资回报）​​的X射线分析评估图像。此步骤可任选地脱线进行的，在这种情况下的EM可以打开关闭并温热至室温试样。

7。收购的X射线谱

X射线谱可以使用任何可记录的几个商业或定制设计的X射线分析系统的最低限度地选自由能量色散型X射线（EDX）检测器，相关联的脉冲处理器的电子设备和兼容的采集和显示软件。 （本实验中所使用的系统表1所述。）

1. 通过将EDX检测器进柱（如果有必要），抽出物镜孔径，并插入和定心任何杂散辐射孔配置对EM的透视采集。调整cryoholder到在其中避免了试样的霜污染的最低温度，但至少低于-100℃。
2. 倾斜支架20°朝向探测器。
3. 在宽视场成像条件，并假设人是故意要分析一个individua的矩阵升线粒体，选择一个线粒体进行分析，将其移动到该领域的中心和重点。
4. 去点模式（在某些显微镜使用第二聚光焦点只是收敛光束），并增加了电子束电流到约 3 NA（作为衡量一个法拉第杯或类似）到100 nm的光点。
5. 发射光谱采集软件，并开始100秒的收购，它可以被看作活时间的显示监视器上。保存记录的谱（ 图2）。行业标准EMSA格式是首选。
6. 关闭电磁和多光谱文件（县）转移到（离线）分析工作站。

8。 X射线光谱分析

定性分析

的EDX谱（ 图2，小图）在本质上是X射线强度与能量的xy图。光谱包含了有关T的元素组成的定性和定量信息他分析体积，在该峰的“特征”能识别以使峰而产生，而强度反映了该元素的量的元素。的特征峰骑在一个缓慢变化的背景下，“连续”的顶部。 （ 图2中的说明进一步讨论的EDX光谱的显着的细节）。峰值歧管的整个周期表中的能量是通过元素的公知的电子结构，因而所有的EDX软件链接到一个可以自动识别的元件数据库中定义分析物。在生理情况下，普遍关心的是适合于EDX分析的元素包括_Na（Kα在1.04千电子伏），P（2.01千电子伏），K（3.31千电子伏），和Ca（3.69千电子伏）。

1. 采取可用的软件库和峰匹配例程的优势，确定在光谱主要元素。在生物样品期望找到用于钠，镁，磷，硫，氯，K和Ca的峰。 （注意：最后两个元素重叠！）

定量分析

EDX光谱的定量分析由提取的识别峰的积分面积，该值转换为浓度。用于生物分析中，建立的方式是霍尔峰/连续法^4,7,10，其中利用这样的事实，该连续体（上面和图2中所定义）的强度正比于所分析的量的干质量的优势。因此，峰面积/连续面积的比例，相对于相同的比例在已知的组合物的标准光谱指定目标细胞区室中的浓度。注意，此方法提供的浓度以每重量摩尔，通常表示为毫摩尔/千克干重为单位。这个单元是不寻常的，用于解释可能需要额外的转换，例如毫摩尔/ L（湿重）或毫摩尔/毫克蛋白，如所述的埃尔sewhere ^4,10。

2. 提取Z = 10〜20之间的元素生物（0.5-4.0千电子伏）的峰面积（和误差估计）， 即钠，镁，磷，硫，氯，钾，钙和使用的拟合程序内置到分析一身的软件（ 见表1，特别是脚注4）。本实验采用单或多最小二乘拟合。注意，该嵌合需要小心注意解决（参见图2）K和Ca的峰之间的重叠。
3. 整合,1.45-1 .61千电子伏之间的连续性。替代性无干扰的区域都可以使用。
4. 通过比较标准计算峰/连续比率，然后浓度。整个分析中传播错误。
5. 使用标准的统计软件和公式来估算的平均值，反映的生物变异。

Representative Results

脑细胞通常保持兴奋性毒性损伤的发生局部缺血条件下的病理性神经递质释放的结果。电子探针是如何发现神经元线粒体螯合钙的大量能力的基础损伤的机制是至关重要的。 图3中的电子显微照片示出了线粒体中培养的海马神经元的冻干冷冻切片30分钟后，在暴露于兴奋性刺激（100μMNMDA）快速冷冻的外观。大多数线粒体似乎是结构性损坏，因为它们是高度肿胀，含有少量，暗夹杂物（红色箭头）。电子探针，它有足够的分辨率之内，但不包括（“黑客帝国”）线粒体夹杂物（ 图3，红色和蓝色光谱，分别）进行元素分析，结果显示，该包裹体主要由钙，磷。极高浓度的钙这些夹杂物帐篷- 〜1,300毫摩尔/千克干重，而<1毫摩尔/千克是典型的休息线粒体-解释了他们非凡的钙缓冲能力，以及为什么这铺天盖地的缓冲机制会导致钙超载触发细胞死亡^11。

海马，大脑学习和记忆的关键区域，受伤的缺血后的主要场所。有趣的是，和治疗上重要的是，命名为CA3的功能不同的区域远远更不容易受到缺血性损伤比是相邻的，突触连接CA1区。电子探针分析-方法与原位的结构和功能（ 图4，显微镜）维持海马脑片特定区域的冰冻切片结合-是用来证明有毒的刺激诱 ​​发脆弱的CA1区神经元大得多钙升高较耐相邻CA3区神经元（ 图4中 ，条线图）。因此，CA1区线粒体 dria表现出广泛的损伤和功能障碍，这表明Ca ^{2 +}的过载诱导的线粒体功能障碍是在CA1区神经元¹³的选择性脆弱的一个决定因素。

图1。的冷冻水合冰冻切片两根带支撑在聚乙烯醇缩醛膜低倍率的电子显微镜照片。做好准备的特性说明，包括平面，以及连接，微创支离破碎的部分。应避免方格与支持膜撕裂，作为电影的电子束下进一步眼泪。两个正方形完全适合于分析用星号表示。比例尺= 100微米。

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图2。细胞器元素组成由电子探针，低剂量的定量分析 ，交感神经元从快速冷冻控制神经节准备了冷冻干燥冷冻切片数字化扫描透射电子显微镜照片显示了实现的细节在这样的标本。注意尖锐质膜，内质网和线粒体丰富的保存完好的堆栈插图 -从线粒体基质的典型区域记录，由红点所示EDX谱。对应于主要K壳层透视峰元素被识别;中钾和钙的情况下，从其他的电子跃迁产生的2 K壳层线都解决了，表示以_Kα和_Kβ按照标准分光符号。光谱说明了在活的神经元主要元素的典型分布。注意，慢变化的连续辐射， 例如 1.5-1.8之间或2.8-3.1千电子伏，这反映了这一细胞区室的质量密度。钙在健康细胞的定量分析是通过相对高含量的钾（ 约 500毫摩尔/千克干重，大约相当于150毫摩尔），这就会引起对钾_Kβ和钙_Kα则峰的重叠的存在复杂在EDX谱。有标准的算法来解卷积这种重叠。比例尺为1微米。

图3。兴奋性刺激诱 ​​导变量和局部钙累积在线粒体个体。冻干冷冻切片的数码透射电子显微照片从制备不固定，迅速冷冻海马细胞培养谷氨酸受体（100μMNMDA 30分钟）的NMDA受体亚型的兴奋刺激后显示包含无数小，自然电子致密，点状夹杂物（红色箭头）线粒体。相应的X射线谱证明有毒的刺激导致离子平衡的丧失，就证明了增加的Na峰和较小介电常数值峰值列入无线粒体基质（蓝色箭头和频谱）。在红色光谱中的钙大峰反映强烈的线粒体钙积累本地化为特征的夹杂物，其中还含有大量的磷和氧。在夹杂物和基体的平均钙浓度为1,300〜和〜60毫摩尔/千克干重，分别为。标尺为500纳米。

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图4。线粒体钙超载负责海马CA1区神经元的选择性缺血性漏洞 左侧面板 -细胞体在海马脑片培养，缺血模仿条件（100μMNMDA）下快速冷冻的CA3和CA1区冰冻切片的电子显微镜照片。 右侧面板 -电子探针分析了线粒体钙含量表明，化学缺血诱导更大的钙升高弱势CA1区神经元的线粒体比相邻，缺血性CA3区神经元（*，P <0.05相对于NMDA受体暴露CA1）。 NMDA诱导的钙超载被废除的NMDA受体拮抗剂MK-801。标尺为2微米。

Discussion

这里介绍的电子显微镜为基础的分析方法允许用于检测，鉴定和生物学意义的一些元素，包括钠，钾，磷，特别是钙的定量。这些分析，可以进行在细胞内， 即内细胞器，由于定位和识别在从快速冷冻标本制备冷冻切片的高品质的图像感兴趣结构的能力的分辨率。注意，没有染色需在结构质量对常规固定，塑料包埋制剂记录可比电子图像，即使在组织元素的位置，定量保留。

虽然结构测量，图像被记录在应用低剂量电子，更高剂量须在征求计数率足以获得良好的统计X射线辐射。因此，在显微镜对EMPA有用必须能够形成高电流聚焦探头; 2-5 nA的为25-50纳米，适合喜欢包罗万象的ER囊泡或突触小泡的细胞器，是可以接受的。这至少需要一个高亮度的六硼化镧电子枪。在这些仪器的条件下，钙在1-10毫摩尔/千克干重的典型组织中的浓度可定量分析的±0.1毫摩尔/千克〜100秒的现场时间将标准错误。反褶积，其中钙分析的灵敏度将大大改善，如果不是因为与未成年钾线的主要钙的X射线谱线的不幸重叠，增加了显著的不确定性对钙信号的积分（参见图1图例详情）。需要注意的是所描述的边界条件大大放宽，当本地的钙浓度异常高，生理，尤其是病理性的，线粒体钙的积累（ 图2-3）中的发生。

尽管许多successfUL应用中，很显然，EPMA不是一个特别有效的方法，所以有许多激励来提高数据吞吐量。三个有希望的途径是这里提到的：1）电子能量损失谱，而不是EDX（EELS）; 2）2D元素映射，而不是点探针，和国家的最先进的3）新，仪器仪表。而不是收集发出的X射线，鳗鱼依赖于记录已经失去特性，元素特定的能源量电子/原子碰撞后入射电子。据统计，能源效益标签计划是天生〜4倍比能谱好，和鳗鱼的硬件和软件，现在几乎成熟的生物学家。 （见参考文献^6，2的评论在生物能源效益标签计划的应用程序。）

改进的灵敏度提供了能源效益标签计划-也被新的高通量硅漂移探测器EDX，见下文-允许每个分析短的停留时间， 例如毫秒，而大于h的秒undreds，因此产生选定区域的数字地图在合理的时间的能力。作为一个例子，一个128×128的钙地图可被记录在〜1小时^1。注意，这种方法被称为“光谱成像^”6,2，提供了一个完整的EELS光谱在每个像素，这样的几个要素信息嵌入在所记录的“数据魔方”（X 比 ：Y 与 E）。

最后，还有由于本系统已经在仪器的技术性能和实质性的进展，如在协议部分所述，是发展了20年前。先进设备，最先进的技术，这将是平常的在电子探针实验室今天是设置将包括：1）高亮度场发射枪，可以泵的电流几纳安（nA的）到亚纳米级大小的斑点; 2 ）大面积硅漂移检测器，用于最大化透视收集效率和吞吐量^8，以及3）现代软件许诺光谱采集，分析和定量卓越的灵活性和性能。这种软件包是市售大多数制造商，或者，DTSA软件，DTSA二，的更新和改进的版本是免费提供从NIST的成本（ 见表1，脚注4）。刚刚描述的特征是在任何可用的自动化和/或机器人上的基电子显微镜的顶部。

所描述的EMPA协议已经证明了自己的进攻感兴趣的几个问题神经科学家，帮助，例如，揭示细胞神经退行性病变的机制非常有用。考虑到刚建议的改进，EMPA应该继续成为一个坚实的贡献者，未来的研究。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips	Thermo Fischer Scientific	72280
Culture inserts	BD Falcon	353090	For 6-well plates
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood applicators	EM Sciences	72300
Folding EM grids	Ted Pella	4GC100/100	100 mesh
Indium foil	Alfa Aesar	13982	0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device	Leica Microsystems	KF-80
Slam freezing device	LifeCell	CF-100
Ultramicrotome	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment for microtome	Leica Microsystems	FC6
Diamond cryotrimming tool	Diatome	Cryotrim 45
Diamond cryoknife	Diatome	Cryo 35
Antistatic device	Diatome	Hauf Static Line
Cryo electron microscope	Carl Zeiss Microscopy	EM912 Omega
EM cryo specimen holder	Gatan	CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Image acquisition software	Olympus SIS	iTEM suite
ED x-ray detector	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
Pulse Processor	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane card	4pi Systems	Spectral Engine II
Desktop computer	Apple	Any OS9-compatible model
X-ray analysis software	NIST	DTSA, DTSA II
Spreadsheet software	Microsoft	Excel
The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)