Dette notatet beskriver anvendelsen av cryoanalytical elektronmikroskopi til kvantitativ måling av total kalsium innhold og distribusjon på subcellulære oppløsning i fysiologisk definerte biologiske prøver.
I denne artikkelen verktøyene, teknikker og instrumenter som er egnet for kvantitative målinger av intracellulært elementært innhold ved hjelp av den teknikk som kalles elektronsonde mikroanalyse (EPMA) er beskrevet. Intramitochondrial kalsium er et særlig fokus på grunn av den kritiske rollen som mitokondrie kalsium overbelastning spiller i nevrodegenerative sykdommer. Metoden er basert på analyse av røntgenstråler generert i et elektronmikroskop (EM) ved samvirke av en elektronstråle med prøven. For å opprettholde den opprinnelige fordeling av diffunderbare elementer i elektronmikroskopi prøver, krever EPMA "cryofixation" av vevet etterfulgt av fremstilling av ultratynne cryosections. Rask frysing av dyrkede celler eller organotypic skive kulturer utføres av plunge frysing i flytende etan eller slam frysing mot en kald metallblokk, henholdsvis. Cryosections nominelt 80 nm tykk er kuttet tørr med en diamant kniv på ca. -16076, C, montert på karbon / pioloform belagt kobber nett, og cryotransferred inn en Cryo-EM ved hjelp av en spesialisert cryospecimen holderen. Etter visuell undersøkelse og plassering kartlegging ved ≤ -160 ° C og lav elektron dose, frosne hydrert cryosections er frysetørket ved -100 ° C i ~ 30 minutter. Organelle nivå av tørkede cryosections blir registrert, også ved lav dose, ved hjelp av en treg-scan CCD-kamera og subcellulære regioner av interesse er valgt for analyse. X-stråler som sendes ut fra ROIs av et stasjonært, fokusert av høy intensitet elektronsonde blir samlet av en energi-dispersiv røntgen (EDX) spektrometer, behandlet med tilhørende elektronikk, og presentert som et røntgenspekteret, det vil si, et tomt på X-ray intensitet vs energi. Ytterligere programvaren muliggjør: 1) identifikasjon av elementkomponenter ved sine "karakteristisk" peak energier og fingeravtrykk, og 2) kvantitativ analyse ved ekstraksjon av topparealene / bakgrunn. Dette papiret konkluderer med to eksempler som illustrerer typiskeEPMA applikasjoner, en der mitokondrie kalsium analyse gitt viktig innsikt i mekanismene for eksitotoksiske skader og en annen som avslørte basis av iskemi motstand.
Kalsiumioner er uten tvil den viktigste og allsidig celle signalisering enhet i biologi, som spiller en viktig rolle i normale prosesser så forskjellige som synaptisk overføring og genuttrykk. På den annen side er kalsium like viktig i celledød. Spesielt er kalsium deregulering en nøkkelfaktor i nevronale skader i hjerneslag, Parkinsons, Alzheimers og andre nevrodegenerative sykdommer 3,5. Således er det av avgjørende betydning å forstå kvantitativt hvor kalsium er fordelt i celler, og hvor dette forandrer følgende fysiologiske eller pato-fysiologiske stimuli. Dette målet er komplisert ved det faktum at kalsium blir dynamisk fordelt mellom to fysiske tilstander – frie i oppløsning eller bundet til et substrat – og det cellulære kalsiumkonsentrasjonen endrer seg over flere størrelsesordener som følge av stimulering.
Mens det er flere avanserte metoder som er tilgjengelige for analyse av free intracellulært kalsium, er bestemmelse av total kalsiumkonsentrasjoner i definerte intracellulære rom realistisk begrenset til en metode, nemlig elektron probe mikroanalyse (EPMA). EPMA er en teknikk som par et røntgen spektrometer i et transmisjonselektronmikroskop (TEM). Den TEM elektronkanon fokuserer et stasjonært, submikron elektron-probe på en subcellulære området av interesse og elementspesifikke røntgenstråler som sendes ut som følge av elektron-bombardement blir samlet og analysert (se referanser 7, 4 for detaljerte tekniske vurderinger). Fordeler med EPMA inkluderer enkelt organelle-nivå oppløsning og submillimolar følsomhet. I praksis krever imidlertid EPMA spesialiserte cryotechniques og instrumentering for prøven fremstilling og analyse. Her er verktøy, teknikker og instrumenter som egner seg for målinger av intracellulært kalsium hjelp EPMA beskrevet. Intramitochondrial kalsium er spesielt interest på grunn av den kritiske rollen som mitokondrie kalsium overbelastning spiller i nevrodegenerative sykdommer.
Den elektronmikroskop-basert analysemetode som presenteres her muliggjør påvisning, identifisering og kvantifisering av flere elementer av biologisk interesse, som Na, K, P, og spesielt Ca. Disse analysene kan utføres ved subcellulære, dvs. intra-organelle, oppløsning på grunn av evnen til å lokalisere og identifisere strukturer av interesse for bilder med høy kvalitet av cryosections fremstilt fra raskt frosne prøver. Legg merke til at ingen farging er nødvendig å ta opp elektron bilder sammenlign i…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Ms Christine A. Winters for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Basic Neuroscience Program av ninds egenutført Research Program, NIH (Z01 NS002610).
REAGENTS/MATERIALS | |||
Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
EQUIPMENT | |||
Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|