Kovalent Bindning av BMP-2 på ytorna med en själv monterade monolager Approach
Summary
Vi beskriver ett förfarande för att åstadkomma en effektiv immobilisering av BMP-2 på ytor. Vår strategi bygger på bildandet av en själv monterat cellslager för att uppnå den kovalenta bindningen av BMP-2 via dess fria aminrester. Denna metod är ett användbart verktyg för att studera signalering på cellmembranet.
Abstract
Benmorfogenetiskt protein 2 (BMP-2) är en tillväxtfaktor som är inbäddad i den extracellulära matrisen av benvävnad. BMP-2 fungerar som utlösare av mesenkymala celldifferentiering i osteoblaster, och därmed främja läkning och de novo benbildning. Den kliniska användningen av rekombinant humant BMP-2 (rhBMP-2) i samband med byggnadsställningar har höjt senaste tidens kontroverser, baserad på läget för presentation och det belopp som skall levereras. Protokollet presenteras här ger ett enkelt och effektivt sätt att leverera BMP-2 för in vitro-studier på celler. Vi beskriver hur man bildar ett själv monterade monolager bestående av en heterobifunktionell linker, och visar den efterföljande bindande steg för att få kovalent immobilisering av rhBMP-2. Med denna metod är det möjligt att uppnå en ihållande presentation av BMP-2 under bibehållande av den biologiska aktiviteten av proteinet. I själva verket ytan immobilisering av BMP-2 möjliggör målinriktade undersökningar genom att förhindra ospecifika annonserorption, samtidigt som mängden av tillväxtfaktor och, framför allt, vilket hindrar okontrollerat utsläpp från ytan. Både på kort och lång sikt signalering händelser som utlöses av BMP-2 sker när cellerna utsätts för ytor som uppvisar kovalent immobiliserade rhBMP-2, vilket gör denna metod lämplig för in vitro-studier på cell svar på BMP-2-stimulering.
Introduction
Benmorfogenetiskt protein 2 (BMP-2) är en medlem av den transformerande tillväxtfaktor (TGF-β)-familjen och verkar som inducerar de novo benbildning samt regulator av flera vävnader under embryonal utveckling och vuxen homeostas 1-3. Varje monomer av den biologiskt aktiva homodimera BMP-2-proteinet innehåller en "cysteinknuten" motiv, som är starkt konserverad i alla BMP 4. Sex av de sju cysteinrester bilda intramolekylära disulfidbindningar som stabiliserar varje monomer, medan den sjunde cystein är involverad i dimerisering, som bildar en intermolekylär bindning mellan de två monomererna 5,6. Denna starkt konserverade cysteinknuten definierar den tredimensionella strukturen av BMP-2-protein och bestämmer dess unika egenskaper, såsom motståndskraft mot värme, denatureringsmedel och sura pH 7-9. BMP-2 binder till serin / treonin-kinas-transmembranreceptorer och därigenom inducera signaltransduktion <sup> 10-12. Beroende på läget av receptor oligomerisering är olika signalvägar aktiveras: a Smad oberoende signalering kaskad leder till alkaliskt fosfatas induktion via p38-signalering, medan en Smad beroende vägen aktiveras av receptorfosforylering resultat i Smad komplexa kärntranslokation och aktivering av transkription av specifika målgener, såsom hämmare av differentiering (Id) 12-14.
I ben, BMP-2 inducerar differentiering av mesenkymala stamceller till osteoblaster, och därmed främja läkning och nybildning av ben. För närvarande rekombinant uttryckta BMP-2 appliceras kliniskt för att förbättra läkningen av brutna platser. En vanlig strategi i benvävnadsteknik är användningen av injicerbara tillväxtfaktorer, som är mindre invasiv jämfört med lokala administreringssystem. Emellertid har in vivo-studier och kliniska tillämpningar visat att korta biologiska halveringstiden, ospecifik localisering och snabb lokal clearance av BMP-2 kan leda till flera lokala, ektopiska och systematiska problem 15. Därför är nödvändigt för dess lokala och ihållande leverans vid målplatsen för att få en effektiv presentation, den fastnar eller immobilisering av BMP-2 inom eller på material. Fortsatt leverans kan uppnås med icke-kovalenta behålla metoder, såsom fysisk entrapment, adsorption eller jon komplex 16. Emellertid är det känt att ospecifik adsorption av proteiner till ytor kan resulterar i denaturering av molekylerna 17. För den kovalenta bindningen av tillväxtfaktorer har olika typer av bärare har utvecklats under det senaste decenniet. Användningen av bifunktionella länkmolekyler som riktar amino-eller karboxylgrupper av proteinet till exempel, är en typ av tillvägagångssätt som inte nödvändigtvis kräver proteinmodifiering för att uppnå sitt immobilisering. I själva verket erbjuder medan proteinmodifiering fördelen av att styra proteinorientering,införandet av artificiella domäner peptidmärkningar och platsspecifika kedjorna kan förändra den biologiska aktiviteten av tillväxtfaktorerna 17. Således, för att kringgå denaturering på grund av växelverkan med det stödjande materialet, ytor kan funktionaliseras i förväg, till exempel, med ett självmonterat monoskikt (SAM) i en sammanlänkande molekyl, följt av koppling av den önskade faktorn 18. Vi har använt en SAM-baserad metod för att kovalent immobilisera BMP-2 på en yta genom att rikta dess fria aminrester och har visat att det immobiliserade proteinet behåller både sin korta-och långsiktiga biologiska aktiviteten 19. Protokollet ger ett enkelt och effektivt sätt att leverera BMP-2 till celler för in vitro studier av de mekanismer som sker vid cellmembranet och reglerar intracellulär signalering ansvarig för osteogena signalering.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi förberedelserna av ytor funktion med bioaktiva rhBMP-2. Denna metod innefattar två steg: 1) den initiala bildningen av ett självsamlande monoskikt (SAM) av en bifunktionen linker på guldytan, 2) kovalent immobilisering av rhBMP-2-protein. I tidigare arbete, validerade vi en effektiv bindning av den bifunktionella linkern och tillväxtfaktorn, och visade att yt-immobiliserade rhBMP-2 bibehåller sin biologiska aktivitet 19. Bioaktiviteten av tillväxtfaktorer som presenteras …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Prof. JP Spatz (Institutionen för biofysikalisk kemi, Heidelbergs universitet och institutionen för nya material och Biosystems, Max Planck-institutet för intelligenta system, Stuttgart) för hans vänliga stöd. Det ekonomiska stödet från Max-Planck-Gesellschaft och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 till EAC-A.) Är också i hög grad erkänt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |
References
- Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9 (2002).
- Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
- Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
- Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
- Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
- Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
- Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
- Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26 (1998).
- Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
- Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
- Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
- Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
- Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
- Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
- Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
- Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
- Uludag, H., D’Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
- Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
- Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors – the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
- Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
- Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
- Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
- Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
- Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
- Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
- Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
- Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
- Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
- Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
- Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
- Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).
