Summary
過去数年間、新世代内視鏡は、ネズミ大腸炎および結腸直腸腫瘍を評価するための重要な診断研究助剤として浮上している。私たちはここに、マウスにおける炎症と大腸腫瘍の内視鏡的な評価だけでなく、大腸炎および大腸腫瘍の内視鏡的重症度を記録するために小数の識別子を使用して新たなスコアリングシステムのための詳細なプロトコルを提示する。
Abstract
研究目的のための現代的な内視鏡検査の使用が大幅に胃腸病態の我々の理解を促進してきた。特に、実験的内視鏡検査は、慢性炎症性腸疾患の機構および結腸直腸癌の進行を評価するもののような単一の実験動物で繰り返し評価を必要とする研究のための非常に有用であった。ただし、研究間で使用されている方法は、非常に多様である。少なくとも3の内視鏡スコアリングシステムは、マウス大腸炎のために出版され、結腸直腸腫瘍の評価のためのプロトコルが付随大腸の炎症の存在に対処するために失敗した公開されている。この研究は同時に、炎症や腫瘍の両方の評価を統合し、再現性の内視鏡スコアリングシステムを開発し、検証します。肛門周囲の知見に基づいて、大腸の炎症の程度や重症度の1)評価(、WALの透明性:この新規なスコアリングシステムは、3つの主要コンポーネントがありますL、粘膜出血、および局所性病変)、2)腫瘍病変(グリッドマップとバーグラフ)と、観察された病変の割り当てられたカテゴリでは、小数点単位に基づいて病理学的研究の関連性による臨床例の3)数値的なソートを定量的に記録し、内視鏡の合併症(小数点識別子)。ここに提示された映像や原稿は、近位の内視鏡大腸炎(D-PECSから遠位を区別するためのシステムオプションを指定して、研究者は十分に検証され、再現性の高い内視鏡の方法論を用いて、独自の実験用マウスを獲得できるようにするために、動物実験委員会が承認したプロトコルに従って、調製した)。
Introduction
マウス内視鏡検査は、十年以上1-3有用な研究ツールとして行われている。いくつかはまた、軟性S状結腸鏡検査を使用していたが、現在までに、マウス内視鏡検査を採用するほとんどの研究は、硬性内視鏡を使用している。マウスの内視鏡検査は、すぐに結果を提供し、腸の正常、炎症の重症度、並びに体重減少、下痢、および組織のような間接的な尺度、(病変が斑状である場合、最適以下である)と比較して、腫瘍進行の程度をより客観的推定、一方大腸の全体的な健康についての洞察を提供しています。安楽死させなければとコロンは、分析1のために収穫されるために、動物を必要とする伝統的な組織学的検査とは対照的に、最も顕著なのは、内視鏡検査は、時間をかけて実験動物モデルを繰り返し評価を可能にする。これらの利点にもかかわらず、マウスの内視鏡技術の使用は普及しておらず、implementatiための標準化されたプロトコルの欠如によって制限される上および病理学的所見のスコア化。適切に実装され、マウスの内視鏡検査は、さらに我々の理解や炎症性腸疾患、大腸炎、および結腸直腸腫瘍を含む複数の慢性胃腸疾患状態の動物モデルの特徴付けを容易にするための大きな可能性を秘めています。
ネズミの内視鏡技術の有用性は、標準化された審査手続の存在と腸の異常のための一貫性のある、非冗長、かつ信頼性のスコアリングシステムを必要とし、その再現性と客観性、にかかって。大腸4-6の内視鏡的評価のためだけでなく、マウスでの大腸腫瘍は4,7,8のための少なくとも3わかりやすいスコアリングシステムが発表されている。しかし、これらの報告されたアプローチやスコアリングシステムは、研究間で容易に比較することはできません。多くの場合、病変の分類のために使用される基準の明確な定義は存在せず、基準が与えられたとき、それらは広く変化。また、大腸腫瘍、単一の測定ツールに同時に発生し、結果にインタラクティブな効果を持つことができる最も一般的な結腸病変の2、両方の評価を統合しないと報告スコアリングシステムは存在しない。最後に、大腸炎のために存在する内視鏡的スコアリングシステムは、多くの場合、限られた差別を伴う炎症のカテゴリーがある( すなわち 。短整数スケール、多くの場合、1〜4の上の狭いスコアリングオプション)が正しく、疾患の進行のシナリオを表しており、パラメトリック統計解析の使用を可能にする。
本論文では、マウスの大腸炎および結腸腫瘍の重症度を評価し、肛門周囲、直腸、および遠位結腸の解剖学的評価にこの技術を採用するための標準化されたプロトコルを記述するための軟性内視鏡の使用を記載している。私たちは、外傷や画像アーティファクトを最小限に抑えるために、内視鏡検査の際に効果的なトラブルシューティングを説明し、我々は再現性のスコアリングシステムを説明検証公表された臨床パラメータに基づいて。スコアリングシステムは、(特定の診断値との調査結果を強調するために12の炎症、腫瘍のマッピングの可能性等級とプロットオプション、および新規の小数単位系(すなわち、小数の識別子)との差別の高いレベルを使用して、腸の炎症や腫瘍の両方の評価を統合すなわち腫瘍発生、内視鏡検査などの際の合併症)。小数識別子の使用は、さらに下流の分析に関連するデータセットの迅速な追跡を可能にする。最後に、我々は大腸炎および大腸炎関連癌(デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性大腸炎、 クロストリジウム·ディフィシル感染症、及びアゾキシメタン/ DSS誘発結腸癌)の複数のマウスモデルにおいてスコアリングシステムの信頼性と妥当性テストを実行します。
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Protocol
1。内視鏡システムの設定
- 製造者の指示に従って、マウスを麻酔前に内視鏡システムをセットアップします。このプロトコルの人間のために設計されたビデオ·尿管鏡( 図1)を使用します。挿入管の外径が9.9 Frの(5.3 mm)で、その遠位端が8.5 Frの(2.8ミリメートル)であり、計装チャネルの内径は6 Frと(1.2 mm)である。
- 内視鏡の使用は病気の伝染にリンクされていないが[9]、胞子を形成する微生物を扱う場合、70%エタノール10または適切な技術を持つ内視鏡やレンズを消毒。静菌無菌潤滑剤と非スクラッチは、内視鏡の先端部を飽和させるために組織を拭いて準備します。
- 計装チャンネルの上部に空気の全3ミリリットルの注射器(または適切なCO 2の混合ガス)を取り付けます。
- 電源を入れ、通常の白色光のホワイトバランスを設定して、適用可能なだけでなく、狭帯域光観察(NBI)モード。それは特徴的な異常な血管新生11を持っている潰瘍性及び腫瘍性病変を含む粘膜の微細な血管構造を、強調しているように2001年以降、NBIは画像診断上の利点を提供してきました。 NBI-フィルタモードでは、ヘモグロビンを有する構造を強調して390から445 nmおよび530から550ナノメートルに捕捉された光の波長を制限します。
- あなたの調査結果を記録するために、評価スコアリングフォーム( 図2)を印刷。 (セクション6.1を参照)試験前予想される正常およびNBI画像( 図3A)と定義し、各基準の等級に慣れる。
- 必要に応じて、色素内のためにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)での着色剤ベースのソリューションを用意してください。色素内視鏡検査では、検査は、粘膜の変化を強調するために造影剤として染料を用いて行われる。メチレンブルー(0.1%)と、インジゴカルミン(0.1%)ソリューション( 図3B)を使用します。ノートそのメチレンブルー基を酸化するアミノ酸残基の、間接的な架橋、および試料分析を妨げる可能性DNA分解12を生成することができる酸化還元剤である。
2。マウスの全身麻酔
- 麻酔薬および投与経路を選択してください。免疫系と薬や研究目的の潜在的な干渉に関する動物資源施設や施設内動物管理使用委員会(IACUC)から獣医師に相談してください。一部の薬は、げっ歯類13を含む、動物においてサイトカインプロファイルの発現に影響を及ぼし得る。適切なコントロールと一緒に、生存内視鏡検査用の端末手順やイソフルランのための注射ブロモエタノールを使用してください。
- 誘導のために、0.2〜0.5リットル/分の速度で100%酸素でイソフルランの4〜5%の管理、メンテナンスのために百分の0.5から2を使用しています。このプロトコルは、すべての動物には適していません。貴施設の獣医師に相談してください適切な指示と訓練のため。動物福祉のための最高水準を達成するために、関連する動物実験委員会の勧告に従うこと。マウスが完全に麻酔をかけている場合ことを確認してください。
- 「ストラップ」実験室用接着テープを用いて背側又は腹側位置に支持面テーブルに麻酔したマウス。あなたの内視鏡画面上の解剖学的向きに注意してください。その下肢と尾を固定します。テープのバンドはまた、人工呼吸器から離れて移動するのを防止するが、胸郭呼吸の動きを規制回避するために胸部上に配置することができる。
3。詳細な内視鏡検査
- 肛門からスコープを進め、その後、直腸に内視鏡を挿入する前に肛門周囲病変を探してください。
- コート無菌外科潤滑剤を内視鏡。 CCD(電荷結合素子)センサーの表面被覆しないようにしてください。
- 内視鏡を挿入し、録画を開始します。撮影した動画は、Mに便利です検査後、必要に応じて内視鏡検査のeticulous評価。粘膜/腸への刺激を最小限にするために、時間の最小限の長さで内視鏡検査を行うようにしてください。
- ゆっくりと腸の壁を離れて設定するために注射器を用いて空気を適用します。マウスのサイズによっては、空気1〜2mlのを使用しています。過剰な送気を避けるため、それは、麻酔したマウスの呼吸困難や死を引き起こす可能性があります。
- あなたは空気やスコープの穏やかな回転に道を開く、前方視鏡を進める。あなたが腸管腔が表示されない場合は、内視鏡を進めないでください。ミシン目または結腸/直腸裂傷(<8月10日週齢)特に若いマウスでは、この段階で発生する可能性があります。必要に応じて写真を撮る。
- スコープが進むと(定義された天然に存在する粘膜出血は外傷性内視鏡検査に関連付けられていない)出血自発があるかどうか、評価します。内視鏡は直腸および結腸に入るときに自然出血を観察することができる。
- として結腸壁の透明性をSESS。透明度は、結腸および周囲の他の内臓( 図4)の壁内に血管を視覚化する能力として定義される。範囲の穏やかな運動は、(フォワード、バック、時計回り、反時計回りに)血管が他の内臓の文脈で見ることができるかどうかを決定するのに役立ちます。腸間膜脂肪組織にも見ることができる。骨盤腔の内部直腸は腹腔内の結腸壁よりも小さい透明表示された場合は注意してください。
- 局所性病変(浮腫エリア、びらん、潰瘍、腫瘍塊)の種類と数を決定するために検査します。これは、結腸の炎症スコアと開発されてきた小数識別子を使用してスコアリング状に記録される。
- コロンは、近位結腸に尾側に屈曲する領域が到達すると、徐々に内視鏡を撤回した後、破砕性粘膜による起こる出血接点(の存在を探す内視鏡)は、進行性または除去される。これは意図的に、大腸表面をこすりする必要はありません。健康的な大腸粘膜は、適切な内視鏡検査後に出血していません。
4。生検
- 生検が必要な場合、計測専用の内視鏡管路を介して生検鉗子を挿入する。腸管穿孔を防ぐために、内視鏡画面上の鉗子の進歩を監視します。
- 約60〜80℃のカップにカップの角度に鉗子の生検カップを開き、関心のある領域にそれらを指示。過度に開かれた鉗子や圧力は健康的な透明腸壁の生検によって誘発される穿孔、その結果腸組織の余分な層を把握することがあります。穿孔が発生した場合は、動物実験委員会の勧告に従って麻酔中の動物を安楽死させる。穿孔は内毒素血症や腹膜炎につながる。
- 生検カップを閉じ、閉じた鉗子を維持しながら、それらを引き出します。
- レモ組織や鉗子に優しいソリューションで組織を洗い流すことによって鉗子から標本を見る。 RNAは、後にし、PBS、共通のワーキングソリューションです。必要に応じて、サンプルを取り除くために、針を使用しています。鉗子カップを侵食やエッジをカットすることは避けてください。
5。麻酔からの回復
- それが回復するまで検査が終了すると、マウスに暖かい環境を提供する。電灯、または37℃の温パッドセットのいずれかを使用過熱を防ぐため、周辺血管拡張は、動物の回復を損なう。完全に回復するまで、密接にマウスを監視します。
6。進識別子を持つ大腸の健康の総合内視鏡スコアリングシステム
- のために:(パラメータの定義、およびプロトコル進加重スコアリングシステムを使用したマウス大腸の炎症および腫瘍の内視鏡アセスメント )スコアリングフォーム( 図2)、以下のパラメータ定義を使用偏りのない評価と詳細な記録保存のためのガイドラインとしての例や、オプションの「遠位近位内視鏡大腸炎スコアリングシステム」(D-PECS)。
- スコアリングシステムフォーム( 図2)に記載されている大腸の炎症の4つのパラメータがスコア。細心の注意を払って肛門周囲、腸の透明性、出血、腸(存在する場合)のタイプ、および局所性病変(びらん、潰瘍性、および/または腫瘍)の存在と量を評価する。
- 研究目的のために腫瘍を評価する場合、数量、位置、および大きさを調べ、結腸マップおよびスコアリング状の棒グラフを使用して記載している。得られたスコアや病変の数(該当する)の数値の和が背景大腸の炎症、病変の最も優勢種類、病変の数を決定します。
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Representative Results
この研究で提示されたプロトコル、画像はオリンパスURF-V軟性内視鏡14及びNBI 11,15を用いて調製した。ビデオ画像は、MPEG-2形式とJPG、TIF、PNG、または標準のUSBフラッシュポータブルメモリへの転送可能、最大1280×1024ピクセルと、DICOM形式の画像で保存された。 NBIは、ヘモグロビン含有組織の視覚的なコントラストを向上させます。通常の光と、NBIイメージングは、大腸粘膜の正常な解剖学および潰瘍や腫瘍発生( 図3Aおよび6A)の間に正常と異常な血管新生の違いを説明するための主要な機能である。色素内視鏡検査時に造影剤としてメチレンブルーの画像は結腸陰窩( 図3Bにクローズアップ参照)の空中通常のハニカム外観を明らかにし、クローズアップ画像のその利点を示しています。
これまでに、500人以上のマウス内視鏡検査のfolloを行ってきた翼を繰り返し検査を表す約10%で、このプロトコル、。一般的には、手続きが完了するまでに10〜15分を必要とし、麻酔、内視鏡検査、および麻酔からの回復を投与間で均等に分割します。検査は、肛門から遠位結腸の脾湾曲をカバーしています。我々はまた、成功して直前に組織学( 図6B)のための組織を収穫する組織の死後解剖の後、いくつかのケースでは近位結腸、盲腸および回腸の死後内視鏡検査を行った。あるケースでは、我々はまた、観察し、重症の十二指腸狭窄や腸管癒着による衝撃で影響を受けたマウスではと疑わ胃拡張を確認した。異常画像が穏やかに炎症を起こした遠位結腸の中で最も頭側の側面から経壁観察された。剖検では膨張した胃が結腸に並置されたことが示された。
当社は、有効かつ信頼性の高い小数加重Sを開発した発表された研究の研究間のマウスの内視鏡検査の標準化されたアプリケーションを改善するために、システムをコアリング。三つスコアリングシステムは、以前に使用して私たちの進加重システム4-6の発展の基礎を務めてきた。これらのシステムは様々な基準や病変の重症度のレベルの分類を可能にするが、それらは、内視鏡画像から評価することが困難であり、そのうちのいくつかの適切な基準定義を欠いている。いくつかの場合において、スコアリングシステムに含まれる曖昧なパラメータは、マウスにおける内視鏡検査の疑問が関連性を有する。 11公開されたパラメータ4-6及びそれらの利点は、内視鏡、制限、および生理学的関連性の要約を表1に示す。
提案されたマウスの大腸内視鏡検査スコアリングシステムは、研究目的のために使用されるため、統計的推論を行うためにその有用性が不可欠であった。スコアリングシステムが持っていたことを確実にするために、高い構成概念妥当性は、まず、関連するパラメータを識別するための概念的枠組みを開発し、より少ない基準(n = 3)は、これらのパラメータをグループ化し、炎症および治癒の実際の存在下( 図7)とその共直線性との相関を評価した。次に、我々は、重大度レベルの順序を表すために別個の整数を使用して肛門周囲の知見を加え、小数点識別子を用いて腫瘍誘発および開発の概念を統合した。加えて、我々は以前にマウスの腸内視鏡検査で報告/考えられていない別のパラメータとして「狭窄」を追加しました。結果として得られる出力スコアが高い有効性を生じるパラメトリック統計分析に適している。最後に、我々は詳細な病気の監視のためのマッピングと数値プロット機能を追加しました。
当社の評価システムの収束妥当性を評価するために、36マウス大腸内視鏡検査のための3公表されたパラメータから得られたスコアは、スコアと比較したobtai盲目的3以前のスコアリングシステム4-6を用いて、同じ人が定義さ。すべての比較は私たちの統合されたスコアリングシステムのための高収束妥当性(; 図8ピアソンP <0.0001)を示す、良い正の相関を示した。分析は、それがスコア0と1の間の深刻な大腸炎および改善されたデータの分散(P = 0.0351例で一般的に存在していたとして得点2との間で0.0086 = Pは、大腸の健康を評価するための臨床基準の一部として肛門周囲の調査結果を含めることを支持し、 3、 図8B)。 (肛門周囲の知見を添加した後)、統合スコアリングシステムは、他の利用可能なシステムと比較したところ、3他のシステム2は、4つの可能な整数のいずれかのカテゴリ、主要に起因症例のクラスタリングに主要な推論制限があることが明らかになったメソッドの誤分類バイアスの表示( 図8C)16。小数識別子と、我々の新規なスコアリングシステムは、clusを最も低い確率を有する整数のカテゴリのデータポイントをtering。
図1。楽器。軟性内視鏡、ビデオ制御システムは、光源、ビデオレコーダー、および本研究で用いた吸入麻酔器。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。マウスでの大腸炎および結腸直腸腫瘍の評価のため、小数点採点システムフォーム 。システムは、4つの非共直線パラメータのコア炎症成分、T用のグラフィックを持っているumor情報、および顕著な病変または合併症を小数点ユニット。 (10進加重スコアリングシステムを使用したマウス大腸の炎症および腫瘍の内視鏡的評価)は、以下のセクションで詳細な基準と例を参照してください。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。通常の内視鏡ライトモード、NBIモード、および血管の色素内。樹枝状との正常な粘膜のペア画像は、直腸に、通常あまり一般的です。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図4。マウスでの腸壁の内視鏡的透明性の原理を説明するために、腸のループの断面図。壁画腸血管の内視鏡視覚化および腸間膜脂肪、および隣接する健康な内臓からの腸間膜血管や脂肪のもの、の壁を貫通して可能です健全なコロン。遠位結腸の腹腔セクションの腸壁の炎症と肥厚が他の腸のセグメントが健康であっても、他の内臓から学内や貫構造の可視化を防ぐことができます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図5。トラブルシューティング。腸内容、ぼやけた画像と蠕動運動によって引き起こされる低視認性を解決に役立てることができます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図6。ペア画像病気の大腸粘膜および他の近位の腸のセグメント(定期的な光対狭帯域光観察、NBI)。NBIは、潰瘍性及び腫瘍性病変を識別するのに役立ちます。いくつかの潰瘍は、NBIと茶色がかって表示されますが、線維素性材料で覆われて他の人には、厚く、白く見える。そうでないとき、AOM / DSS腫瘍は、特に初期の段階で、NBIとのより良い特徴づけている内腔に突出。アスタリスク(*)は、コロンが空気で膨張されているすべての他の画像では観察され、PBSで満たし、大腸内視鏡アーティファクト(粘膜ひだ)をハイライト表示します。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図7。腸の炎症の重症度を視覚的大腸の炎症の様々な公表基準を識別し、グレードする機能間の理論的な相関と共直線(表1参照)。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図8。私たちのスコアリングシステムと以前に発表されスコアリングシステムとの性能を比較する。データ36、マウス、ビデオ内視鏡検査の対になった盲目の分析からの肛門病変を除く炎症パラメータ、(3パラメータ)へのシステムAの、A)の比較(5パラメータ)。B)スコアリングシステムにおける肛門周囲の調査結果を含めることの重要性、。以前に報告されたシステムと比較して肛門周囲の調査結果を含めた後のスコアリングシステムの肛門周囲検査では一貫して、マウスにおける中等度/重度の大腸炎例で追加の統計的に有意な情報を提供されるC)パフォーマンス(36マウスのビデオ内視鏡検査)を各メソッドを使用してスコア化した。システムBおよびCはmisclassificatにつながる彼らの4つのカテゴリのいずれかに起因する症例のクラスタリングに主要な制限があることに注意してくださいイオンバイアス(非等価のカテゴリーのシステムB、Cのクラスタの場合)。今意味のある数値スコアの追跡を可能にしながら、小数点識別子を追加することによって、我々はまた、整数のカテゴリにクラスタリングの可能性を低下させた。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
表1。マウスでは、腸の炎症を評価するための内視鏡の基準として発表された臨床パラメータを指定します。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
内視鏡Assessmeマウス大腸の炎症および腫瘍のNTが進加重スコアリングシステムの使用:パラメータの定義とプロトコル
;腫瘍性病変の位置、大きさ、数の2)、記録、および3つのパラメータと12の可能な数値の等級と大腸の炎症の程度や重症度の1)の評価、大腸の健康のために私たちの統合された内視鏡スコアリングシステムは、3つの主要コンポーネントがあります研究者のための特別な意味の調査結果を強調表示するプライマリまたは優勢な病変や内視鏡の合併症の割り当てタイプの)小数点ユニットは、本明細書で「小数識別子」と呼ばれる。腫瘍の位置とサイズは、仮想結腸地図上に記録され、管腔内に突出部(障害物)の各割合における腫瘍の数は、グラフ上に記録される。これらの二つのグラフは、3次元で統合することができる腫瘍の情報を提供する。病変のカテゴリの小数点単位は0.0から0.9の範囲です。もしテンキー特定のカテゴリの病変のBERは、関連する第二及び第三の小数点以下は病変の数を示すために使用することができる。 3病変が認められた場合、例えば、0.003を追加すると、研究者は三病変があったことを知ることができるようになり、12病変が存在する場合、0.012使用されるであろう。繰り返される内視鏡検査が予想される場合には、この追跡システムは、特別な利点である。炎症基準および重症度グレードの詳細な定義を以下に示す。
内視鏡的基準の定義 - A. 4臨床パラメータと大腸infammationの評価
1。肛門周囲の所見:内視鏡検査後の出血との混同を避けるために、スコープを開始する前に、この点を評価する。肛門周囲の健康は、大腸、皮膚、および一般的に動物の態度の健康状態のプロキシであり、内視鏡検査の一部として含まれているいくつかの病変ができず、S理由hould肉眼で精査することはできませ。必要に応じて、生物安全措置を行使する。マウスによる健康的なグルーミング習慣が血液/放電を削除することがありますが、肛門周囲の領域から皮膚病変は削除されませんので注意してください。得点:
- 通常の。いいえ血、下痢、亀裂、瘻孔または放電が観測されていません。
- 糞便や下痢の塊が観察した。
- 流血の放電、軟便(下痢)、膿、または観察マイナー潰瘍の血栓/塊。
- 肉芽組織や周囲の皮膚の大部分を含んでおり、動物が肛門周囲領域での刺激や炎症をマークしたことを示す観察病変;直腸脱。
2。コロンの透明性:コロン視鏡などの結腸壁を介して、血管や学外の器官を視覚化する能力として定義さを静かに移動される。直腸が自然に起因する筋肉の層にはあまり透明であることに注意してくださいDそれが少なく、コントラストが存在する骨盤腔にあるので。これは、マウス結腸の全体的な炎症状態や健康状態を反映しているように、生理学的に最も包括的なパラメータの一つである。それは、感染または上皮に対する毒性作用の初期段階における粘膜びらん/潰瘍を有する非炎症結腸を有することが可能であることに留意されたい。 ( 図6のアスタリスクを参照してください)長期間使用している場合は、マウスにおける粘膜の白化や収縮に変化を引き起こし、水のような低張液などの生理的な等張液は、内視鏡検査の際に洗浄に使用されるべきであることに注意してください。
- 通常の。コロンと周囲の内臓の大小の血管がはっきりと見える。 (前後に、時計/反時計回り)、わずかに内視鏡を移動します。白色腸間膜脂肪又は他の内臓の暗い内容も観察することができる。
- 小血管が部分的に見えませんが、大きな船が見える。
- 小さなvesseLSは、目に見えないし、大型船は明らかではない。粘膜は肥厚表示されません。
- 腸壁および/または粘膜の浮腫/一般化の見かけの肥厚。血管は表示されません。少数の膨張/静脈瘤血管は、ある場合には目に見えるかもしれません。
3。粘膜出血:差別化 自然出血からの出血接触。健康なマウスでは日常の標準内視鏡処置は、出血を誘発しないようにしてください。炎症がある場合には、増加した血管分布及び粘膜組織脆弱性は、粘膜びらんおよび出血につながる可能性がある。意図的に、このパラメータを評価するために結腸をこすりする必要はない。
- 通常の、無出血。
- 共通接点出血。この外傷性出血は、接触出血と定義され、それだけで、内視鏡を撤回した後に判断されるべきである。
- 該当事項はありません。意図的に漢方を決定する審査官を強制的に割り当てられていない出血のE。
- 内視鏡が大腸に入るとして観測される非外傷性と天然由来の出血のように定義自然出血、。時々、送気は厳しい大腸炎中に自然出血を誘発する。
4。局所性病変:大腸疾患の斑状、予測不可能な性質に対応するために、この統合されたスコアリングシステムは、炎症の重症度により、局所性病変(主に潰瘍自然の中で)の存在をグレーディングすることができます。結腸は、マウスにおける短い直管状セグメントであるので、病変の位置を記述する必要はないと判断された。代わりに、病変の数を記録し、小数点以下の識別子のシステムを用いて、合計スコアに加えられる。病変の場所に重点が必要な場合は、我々は「遠位の近位内視鏡大腸炎スコアリングシステム」(D-PECS)と呼ばれるオプションがありF.さらなる合理化されたアプリケーションは、可能なセクションに説明私たちは、小数点採点システムから派生した。腫瘍はめったにマウスにおける結腸直腸領域における炎症のいくつかのフォームを誘導することなく存在しないため、我々は、一意的に(下記参照)腸の健康の文脈における腫瘍の研究を可能にするために小数識別子部の腫瘍を含めた。
- 通常の、無局所性病変。
- 正常粘膜で覆われた小型フラット上昇の明確に定義された領域が観察された。軽度の大腸炎に見られるように、これは、局所浮腫の領域または細胞浸潤/増殖の潜在的な領域に対処することである。
- 赤くなったか、びらん性領域が観測され。
- 潰瘍や狭窄。潰瘍が原因浮腫や線維性創傷修復に赤みや奇形(異常な血管新生の証拠と不規則なエッジ)によって識別されます。 NBI内視鏡検査では潰瘍の検出や観察を区別するのに便利です。狭窄は、契約またはexとして膨張しない異常に狭い円形または不規則な形状の静的分野として認識されているpected。多くの場合、狭窄は、異常な粘膜陰窩、または回腸内絨毛の領域を含む。軟性内視鏡(外径= 3.3ミリメートル)の場合、大腸のより近位の領域にスコープを進めるように注意できないことは、一貫して、異常な狭窄と関連していた死後に検証した。
位置、大きさと数を記録するためのB.腫瘍チャート
1。仮想結腸マップ:このマップは、ルーメン(0°)の上部を切断し、それを展開することによって作られて遠位結腸と直腸の仮想透視画像である。チャートの上部と下部をそれぞれコロン(撓曲)の近位、および肛門が割り当てられます。中心線(180°)の内腔(動物の腹側面)の下部を示し、半円の左右半分は内腔の左右の壁を示している。マップは、同様に、腫瘍の位置および水平方向のサイズを記述するために使用することができる潰瘍など。
2。腫瘍占拠度毎の腫瘍番号:結腸マップのみ2次元情報を提供しますが、突起は、腸狭窄または閉塞を引き起こす可能性があるため、腫瘍が腸管内腔に成長する程度は、腫瘍の重要な機能です。この情報をキャプチャするために、我々は、結腸腫瘍の程度を評価するための3次元透視を可能にする、各パーセントの範囲の腫瘍の数を文書内腔に突出パーセントのための記録のグラフを追加した。
数値スコアが意味のあるものにするためにC.進識別子とファーストトラック関連の例
我々のスコアリングシステムは、関連する病変または合併症の存在を記録するための新規な小数識別システムを使用する。これらの識別子は、説明目的のためであり、内視鏡近隣の数値スコアと迅速な症例の解釈を容易にすることを意図している。しかしながら、それらはまた、病変の重優勢型を数値的に、パラメトリック統計に従うデータセットの生成を可能にするのに役立つ。開発されたスコアリングフォームを使用する場合は、必要に応じて病変をマークし、炎症スコアに加算されるように1桁のIDを選択します。
- 特別な調査結果はありません。
- 肛門周囲瘻、または過度の肛門周囲の炎症、直腸脱。
- マイナー壁の関与主としてびらん性病変。
- 主に潰瘍性病変が、いくつかは、フィブリンで覆われて、小さいため、潰瘍の合体に出血、または不規則な形状を持つ大規模な(潰瘍の数は、1腫瘍に対して0.301、2腫瘍、11の腫瘍などのために0.311のための0.302として記録することができる。)。
- 腸狭窄(オプション狭窄が大腸炎における重度の炎症性合併症であるため、総炎症スコアに2点を追加)。
- 明確に定義されたプラーク(腸管壁内の太い/非透過組織、EG&#160;フラットローハイト腫瘍)。病変について記載したようにプラークの数( すなわち、0.401、0.402、0.411···等 )を記録することができる。彼らは、腸管腔の周外観を変更し、約5〜10%まで突出するように見えるかもしれません平らな非拡張可能な表面として表示されることがあります。
- 質量または腫瘍性病変を突き出し。病変について記載したように質量の数( すなわち、0.601、0.602、0.611···等 )を記録することができる。彼らは明らかに膨らんされていますが、フラットな表示されることがありますが、腸管腔の膨張し周囲の> 15%の突出。
- 内視鏡検査中に涙/穿孔を誘導した。
- 内視鏡検査中に動物の死。
- その他:_____________( 例えば 、重度の近位内視鏡的大腸炎は、下記の遠位近位内視鏡大腸炎スコアリングシステムを参照してください)。
D.例および用途
本論文で提示ネズミ視鏡検査スコアリングシステムはSpecifically大腸の炎症および結腸直腸腫瘍に関するデータの収集と分析を統合するために設計されています。腫瘍に関しては、データが曲線下面積値、中央値、最頻値、又は主成分分析を含む複数の統計的アプローチを用いて分析することができる。個々のレベルでは、スコアリングシステムは、研究者が時間をかけて一つのマウスでは、結腸の正常性を監視するのに役立ちます。炎症サブスコアを合計し、病変、適切な場合の種類と数のための適切な小数点以下の識別子を付加した後、合計スコアは、研究者が数値的に大腸の炎症の程度は、病変の最も優勢種類、病変の数を定量化することができます。内視鏡検査中に穿孔した通常の肛門周囲領域と、大腸粘膜と健全なマウスは0.7の合計スコアを持つことになり、例えば、12.609のスコアが、このマウスは、重度の大腸の炎症および9突出腫瘍塊を持っていることを示しています。 10進数のIDシステムであろう研究者がカタログ化し、容易にスコア化したマウスの大規模なデータリポジトリを検索することができます。例えば、研究者は「0.6」で終わるすべての項目を特定し、腫瘍を突出しているすべてのケースを取得するための検索条件を設定することができます。以上の例が、補足図S1-S3に示されている。
E.遠位、近位の内視鏡大腸炎スコアリングシステム(D-PECS)
これは、重度/豊富な近位大腸炎例を差別する私たちは、小数点識別子スコアリングシステムのオプションの変更である。マウスでの大腸炎及び大腸腫瘍の内視鏡的兆候は、大腸の末端セグメントで一貫して開発することが表示されますので、私たちはお勧めします。
- 大腸の遠位三分の二に特別な注意を払って、記載された基準以下にコロンを獲得し、それが明らかに健康であれば、近位のセグメントを無視する。これは混乱を回避し、差動でに内視鏡検査の識別力を増加させ広範な大腸炎の様々な程度でtiate動物。
- その他、「重度の近位内視鏡的大腸炎のようにラベル付けすることができた - 炎症や腫瘍の変更は、近位3分の1に認められた場合には、合計スコア(1.0)に1点を追加し、'0 0.9として10進数のIDを割り当てることをお勧めします。マップグリッドや棒グラフでの調査結果をプロットします。
- 大腸の近位3分の1に内視鏡的異常を有する動物を監視します。病気が異常に厳しいであってもよいし、近位結腸に向けて左結腸曲を超えて延長することができるように、特別な注意の死後に支払う。
- この勧告に従った場合には、評価フォームの '観測セクション」で、このアプローチを記録し、実験全体でこの傾向に従う。評価は0から13.9の範囲当社の「遠位、近位の内視鏡大腸炎スコアリングシステム」またはD-ペーチュ、以下を実施した最終的な文書に引用してください。この変更はないSを持っていないことに注意してください大規模な/深刻な近位大腸炎なしで動物に使用される場合は、当社のスコアリングシステムにtatistical効果。
補足図。
図s1に。結腸直腸腫瘍を有するマウスの内視鏡的評価の一例 。動物は、AOMとDSS従来の内視鏡検査で処理した。A)代表画像を正常及びNBIモードにおいて、それぞれ内視鏡所見を充填した。B)スコアリング形。 2関連の調査結果がありますが、研究者が臨床的重症度と研究目標に基づいて、小数点識別子0.6を割り当てることを選択したことに注意してください。パラメトリック統計的分析種々の「腫瘍/潰瘍の地図 'およびチャート'、腫瘍突起の記録」に記録されたデータを用いて行うことができる。 iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図S2。結腸狭窄と内視鏡の合併症。腸管腔の狭窄やnonperforating、粘膜、涙が狭窄のすぐ遠位の内視鏡検査中に誘導されたことに注意してくださいと、マウスの例 。炎症を起こした大腸の狭窄や衰弱は、粘膜、涙になることがあります。動物は、全身麻酔下にあった。スコアリングシステムは、私たちは処置合併症を監視し、軽減することができましたことに注意してください。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図S3。 DSS処置マウスでは炎症や内視鏡のスコアの経時変化の一例を数字が自明であることができることに注意して大腸の炎症は(1から5及び8)に進行し、そのことを示して8日目(小数点以下0.2で開発されびらん11日目で)や潰瘍(小数0.3は)。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
マウスでの内視鏡技術の改良やトラブルシューティングに関するいくつかの考慮事項があります。柔軟な内視鏡検査の使用中に習得する必要がある手順の重要な側面は、アンギュレーションとトルクコントロールの調整で腹部膨満とマウスの呼吸障害を防止するために必要空気量の調整、およびビューコントロールのマイナー技術的な側面を含んで。トルク制御は、腸穿孔の危険性を最小限に抑えることが重要である。適切に処理すると、マウスの柔軟な内視鏡検査は、直接可視化と研究の関心の腸領域の生検標本を可能にする非常に安全、迅速な手順になります。
( 図5)糞便によるビューの障害物を解決するためには、糞が通常であっても、空腹時や下剤の使用後に観察されていることを理解することが重要です。存在する場合には、糞を簡単に穏やかな空気インして近位側に移動することができますufflation。症例の約11%において、それはまた、PBS浣腸1mlのを使用する必要がある。腹部膨満または妊娠しているを持っているようだ動物を調べるときに浣腸を実施する前に、十分に注意してください。蠕動運動のためには、送気が蠕動は停止されませんので、蠕動波が通過するまで数秒待つことが重要です。
現在までに、マウスの腸疾患を評価するために使用されるほとんどの内視鏡評価システムは、大腸炎または癌のいずれかに特異的である。この二つの条件は、しばしば同時に起こると互いにことにより、癌の研究者による胃腸研究中に得られた情報の有用性を高める、炎症および腫瘍形成の両方が大幅にクロス規律通信を容易に考慮に入れて標準化されたスコアリングシステムと相互作用することができることを考えると、その逆も同様である。腫瘍はめったに大腸領域における炎症性変化のいくつかのフォームを誘発することなく存在していないので、私Nマウス、我々は独自に腸の健康との関連で腫瘍の研究を可能にするために私たちのスコアリングシステムの小数識別子部分の腫瘍が含まれている。スコアリングシステムの妥当性と信頼性を向上させ、長期的な実験または臨床試験におけるその使用を容易にするために、我々はまた、系統的に必要なデータ要素を記憶するスコアリングシステム( 図2)と共に使用するために標準化されたレポートフォームを開発各分類基準の正確な定義に基づいてマウスの腸炎症スコアを計算する。
限られた有効性の複数のマウス内視鏡検査のスコアリングシステムの以前の利用可能性は、研究間の結果の解釈を妨げる。使用する方法を公開し決定する際の検査技師が経験の混乱を最小限にするために、我々は2次元画像から推測することができる基準を用いた内視鏡的評価を行ってお勧めします( 例:基準にTHAを避ける枢機卿の兆候なので))、無菌を含むいくつかのマウスは軟便を有することができることに注意してください、と( すなわち 、生理学的および時間的に同じ炎症文脈によって駆動される非線形を共同されていないこと、糞の- Tテクスチャや一貫性を参照してください。 ; 2)出血、粘膜および血管の完全性の指標として、第一の壁の厚さの反映として、Becker ら4によって記載1)腸の透過性:炎症、我々は以下の基準を炎症事象を年代順によるシーケンシャルお勧めている; 3)肛門周囲の調査結果、過剰な炎症に結腸整合性と皮膚刺激または素因の指標、およびグレード4)局所性病変、主に潰瘍性のマウスである炎症性病変()の重症度。これまでに、我々は3%DSS誘発マウス大腸炎の代表的なモデルで腫瘍性病変を見ていない。このホワイトペーパーで説明ネズミの内視鏡スコアリングシステムは、我々の知る限り、初めて提供大腸炎症の状況において、腫瘍病変の存在および誘導を評価するための定量的な機構。
彼らは腸の炎症、 例えば SAMP / YIT / Fcの特定の動物モデルに共通して存在であるように見えるので、初めて、我々はまた、ネズミの内視鏡検査時にパラメータとして狭窄を含めることの重要性を強調している。狭窄は、初心者のための内視鏡的に把握することが困難な増加線維症に腸の弾力性の喪失と粘膜の慢性炎症の(半)円周部分を表す。我々は、鈍化腸管通過する可能性が高い(内視鏡的に検査することができる)、遠位セグメントと比較して、狭窄の近位のセグメントでより炎症があることを、内視鏡的に定義された狭窄の影響を受けたマウスでは気づいている。研究目的のためには、より良い炎症を特徴づけるために、実験の最後に組織学的に動物をフォローアップすることをお勧めします候補狭窄領域に隣接matory応答。
適切な訓練や専門家のフィードバックなしに、任意のスコアリングシステムは、任意の時点で可変性を有することができる。他の科学者や技術者のI)適切な訓練と、ii)動物が中に誤診や不注意が負傷されていないことを確認するには、次のようにそれはマウスで行われ、内視鏡トレーニング手順が確実にするために、医療専門家の訓練を受けた獣医によって監視されるべきであることを強調することは重要である手順。可能な限り最良のプラクティスと動物福祉を確保するには、この手順を実装するために進む前に、専門家の助言のためのあなたの動物研究施設を担当する獣医師に相談してください。それは、日常的に訓練された内視鏡医のパフォーマンスを監視することをお勧めします。我々はガイドラインとして、動物が評価される順序をランダム化し、盲検法で全ての動物を評価明細書に提示した画像を使用してください。定期的にパラメータ定義とプロトコルの基準を参照し、K)内視鏡検査およびスコアリング第6節の間、手でそれらをEEP。
要約すると、医学および獣医学胃腸科のチームとして、我々は大腸腫瘍のマウスモデルの内視鏡的評価のための標準化されたプロトコルおよび半定量的スコアリングシステムを提示する。これらの研究ツールは、日常ネズミの内視鏡検査を実施する研究者ができるようになります、と経験のすべてのレベルでの研究員が研究室間や分野間の腸の炎症や腫瘍形成の再現性と同等の措置を生成することができます。我々は、高有効性と意味のある数値スコアを生成するシステムを開発し、個々の研究室の内部の使用のためにカスタマイズすることができます特定の発見、迅速に追跡するための機能を提供してきた。我々はまた、セクションEを参照してください(コロン内疾患に対する地域の感受性差を考慮かかる差別的スコアリングの代替を説明̵6、遠位、近位の内視鏡大腸炎スコアリングシステム、頭文字D-PECS)。データ報告書と図面は、いくつかの科学者は、経験の浅い( 図1、図3、図5、図6)を支援するために、壁のポスターとして使用することができる。解剖学的な違いは微妙な内視鏡的な違い17を占めているように、ネズミの内視鏡検査の実装を成功させるには、肛門、直腸、結腸癌、および周囲の内臓中の粘膜皮膚接合の正常な解剖学に精通にかかって。
現時点でさえ、最小の最も柔軟性、そして最高級の内視鏡技術は、高速、近い将来に、マウスで利用可能になるかもしれカプセルおよび単繊維内視鏡検査の分野での技術の進歩を移動し、 生体内で近位結腸に到達することはできませんが。標準化されたプロトコルと、本論文で提示視鏡スコアリングシステムは、生きた動物におけるマウス腸内環境の状態を可視化し、評価するための貴重なツールを表しています。これらのツールは、設備などでしょうテート·論文間や分野間での結果の比較可能性、および新たに出現ネズミの内視鏡技術への適用性を持つことになります。
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Disclosures
財務、開示された利益相反がない。
Acknowledgments
彼らの実験動物の内視鏡的評価の間に彼らのコラボレーションのためのサラKossak、ミッチェルGuanzon、宋YeunヤンとLi郭嘉、に感謝します。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane, USP | Webster Veterinary | ||
Surgical lubricant | Savage laboratories | surgilube, 0281-0205-45 | |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Scientific | SH30256 | |
RNAlater | Ambion | AM7021 | |
Methylene Blue 1% Aqueous Solution | Fisher Science Education | S96393 | |
Flexible digital ureteroscope | Olympus America | URF-V | |
Video system center | Olympus America | VISERA Pro OTV-S7 Pro | |
Xenon light source | Olympus America | VISERA Pro CLV-S40 Pro | |
Video recorder | MediCapture, Inc. | MediCap USB200 | |
Flexible biopsy cup forceps | Olympus America | FBC-3115 | |
Anesthesia machine | Euthanex Corporation | EZ-7000 Classic System |
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