La colonscopia flessibile in topi per valutare la gravità della colite e colon-retto Tumori Utilizzo di un sistema Validated endoscopica Scoring

Summary

Negli ultimi anni, endoscopi di nuova generazione sono emersi come importanti ausili di ricerca diagnostici per la valutazione colite murina e tumori colorettali. Presentiamo qui un protocollo dettagliato per la valutazione endoscopica di infiammazione e tumori colorettali nei topi, nonché un sistema di punteggio romanzo che utilizza gli identificatori decimali per documentare la gravità endoscopica di colite e tumori colorettali.

Abstract

L'uso della moderna endoscopia per scopi di ricerca ha notevolmente facilitato la nostra comprensione di patologie gastrointestinali. In particolare, l'endoscopia sperimentale è stato molto utile per gli studi che richiedono valutazioni ripetute in un singolo animale da laboratorio, come quelli valutazione dei meccanismi di malattia intestinale infiammatoria cronica e la progressione del tumore colorettale. Tuttavia, i metodi utilizzati negli studi sono molto variabili. Almeno tre sistemi di punteggio endoscopici sono stati pubblicati per la colite murina e pubblicato protocolli per la valutazione dei tumori colorettali non tengono conto della presenza di concomitante infiammazione del colon. Questo studio sviluppa e convalida un sistema riproducibile punteggio endoscopico che integra valutazione sia infiammazione e tumori simultaneamente. Questo nuovo sistema di punteggio ha tre componenti principali: 1) la valutazione della portata e della gravità di infiammazione del colon-retto (basata sui risultati perianali, la trasparenza del wall, sanguinamento delle mucose e lesioni focali), 2) la registrazione quantitativa delle lesioni tumorali (sugli rete e grafico a barre), e 3) ordinamento numerico di casi clinici per la loro rilevanza patologica e la ricerca basata su unità decimali con categorie assegnate delle lesioni osservate e complicanze endoscopiche (identificatori decimali). Il video e manoscritto qui presentati sono stati preparati, seguendo protocolli IACUC approvati, per permettere agli investigatori di segnare i propri topi sperimentali utilizzando una metodologia endoscopica ben validato e altamente riproducibile, con l'opzione di sistema per differenziare distale di colite endoscopico prossimale (D-PECS ).

Introduction

Endoscopia murino è stato eseguito come strumento di ricerca utile per oltre un decennio ^1-3. Ad oggi, la maggior parte degli studi che impiegano endoscopia murini hanno utilizzato endoscopi rigidi, anche se alcuni hanno anche utilizzato sigmoidoscopia flessibile. Endoscopia murini offre risultati immediati e una valutazione più oggettiva del grado di normalità intestinale, la gravità dell'infiammazione, e la progressione del tumore rispetto alle misure indirette, come la perdita di peso corporeo, diarrea, e istologia (che è ottimale quando le lesioni sono di leopardo), mentre offrendo approfondimenti sulla salute generale del colon. Più in particolare, l'endoscopia permette di valutare ripetuto di modelli animali di laboratorio nel tempo, al contrario di esame istologico tradizionale che richiede l'animale essere eutanasia e due punti per essere raccolti per analisi ^1. Nonostante questi vantaggi, l'uso della tecnologia endoscopica murino non e 'stato diffuso ed è limitata dalla mancanza di protocolli standardizzati per implementatisu e il punteggio di reperti patologici. Correttamente attuato, endoscopia murino rappresenta una grande promessa per facilitare ulteriormente la nostra comprensione e caratterizzazione di modelli animali di molteplici stati di malattia croniche gastrointestinali, comprese le malattie infiammatorie croniche intestinali, colite, e tumori del colon-retto.

L'utilità della tecnologia endoscopica murino dipende dalla sua riproducibilità e oggettività, che richiede l'esistenza di procedure standardizzate di esame e di un sistema di punteggio consistente, non ridondante, affidabile per patologie intestinali. Almeno tre sistemi di punteggio descrittivi per la valutazione endoscopica di colite ^4-6, e anche per i tumori del colon ^4,7,8 in topi sono stati pubblicati. Tuttavia, questi approcci segnalati e sistemi di punteggio non sono facilmente comparabili tra gli studi. In molti casi, non esiste una definizione chiara dei criteri utilizzati per la classificazione delle lesioni, e quando i criteri sono indicati, essi variano ampiamente. Inoltre,non esistono sistemi di punteggio riferito che integrano la valutazione sia di colite e tumori, due delle patologie del colon più comuni che possono verificarsi contemporaneamente e avere effetti interattivi sul risultato, in un unico strumento di misurazione. Infine, i sistemi di scoring endoscopici che esistono per la colite hanno spesso categorie infiammatorie con la discriminazione limitati (ad esempio. Opzioni strette di punteggio su scale interi brevi, spesso 1-4) per rappresentare correttamente la malattia scenari progressione e consentire l'uso di analisi statistica parametrica.

In questo documento, si descrive l'utilizzo di un endoscopio flessibile per valutare la gravità della colite murina e tumori del colon e descrivere un protocollo standardizzato per impiegare questa tecnologia nella valutazione anatomica della regione perianale, del retto e colon distale. Illustriamo la risoluzione dei problemi efficace durante l'endoscopia per ridurre al minimo trauma e di immagine manufatti, e si descrive un sistema di punteggio riproducibilebasato su parametri clinici pubblicati validate. Il sistema di punteggio integra valutazione sia infiammazione intestinale e tumori con un elevato livello di discriminazione con 12 possibili gradi di infiammazione, mappatura tumore e opzioni di rilevamento, e un sistema di unità decimale romanzo (cioè identificatori decimali) per evidenziare risultati con valore diagnostico specifico ( vale a dire lo sviluppo del tumore, complicazioni durante l'endoscopia, ecc.) L'uso di identificatori decimali consente un rapido monitoraggio dei set di dati rilevanti per ulteriori analisi a valle. Infine, eseguiamo affidabilità e test validità del sistema di punteggio in diversi modelli murini di colite e colite cancro-associata (destrano solfato sodico (DSS)-indotta colite, infezione da Clostridium difficile, e azoxymethane / DSS-indotta cancro del colon).

Protocol

1. Impostazione del sistema Endoscopia

1. Impostare il sistema di endoscopia prima di anestetizzare i topi, seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare un ureteroscopio video progettato per gli esseri umani di questo protocollo (Figura 1). Il diametro esterno del tubo di inserimento è 9,9 Fr (3,3 mm), la sua estremità distale è 8,5 Fr (2,8 mm), e il diametro interno del canale strumentazione è 6 Fr (1,2 mm).
2. Sebbene l'uso di endoscopi non sono stati collegati a trasmissione di malattie [9], sterilizzare l'endoscopio e lente con etanolo al 70% o ¹⁰ con tecniche appropriate quando si lavora con microrganismi sporigeni. Preparare batteriostatico lubrificante sterile e non graffiare pulire i tessuti per saturare la punta dell'endoscopio.
3. Attaccare una siringa da 3 ml pieno di aria (o una miscela di gas CO ₂ adatto) all'inizio del canale strumentazione.
4. Accendere l'alimentazione e impostare il bilanciamento del bianco in normale luce bianca,Modalità nonché stretta fascia di imaging (NBI), ove applicabile. Dal 2001, NBI ha fornito prestazioni di diagnostica per immagini, come sottolinea sottili strutture dei vasi sanguigni sulle membrane mucose, tra cui lesioni ulcerative e tumorali, che hanno caratteristiche vascolarizzazione anormale ^11. Modalità NBI-filtro limita la lunghezza d'onda della luce catturata a 390-445 nm e 530-550 nm, che mette in luce le strutture con l'emoglobina.
5. Stampare il modulo di valutazione di punteggio (Figura 2) per registrare i vostri risultati. Acquisire familiarità con le immagini attesi normali e NBI (Figura 3a) e la definizione e qualità di ogni criterio prima dell'esame (vedi Sezione 6.1).
6. Preparare una soluzione basata colorante-on tampone fosfato salino (PBS) per chromoendoscopy, se desiderato. In chromoendoscopy, l'esame viene eseguito utilizzando un colorante come mezzo di contrasto per evidenziare i cambiamenti della mucosa. Usare blu di metilene (0,1-1%) e soluzioni di indaco carminio (0,1%) (Figura 3B). Appuntoblu di metilene che è un agente di ossidazione-riduzione che può produrre radicali ossidanti, reticolazione indiretta di residui amminoacidici, e la degradazione del DNA ^12, che potrebbero interferire con l'analisi del campione.

2. Anestesia generale del mouse

1. Scegliere il percorso agente e la somministrazione di anestetici. Consultare un veterinario di una struttura risorsa animale o Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (IACUC) per quanto riguarda possibili interferenze dei farmaci con il sistema immunitario e gli obiettivi della ricerca. Alcuni farmaci possono influenzare il profilo delle citochine espressione in animali, tra cui roditori ^13. Utilizzare tribromoethanol iniettabile per le procedure di terminali o isoflurano per endoscopie sopravvivenza, insieme a controlli appropriati.
2. Per l'induzione, somministrare 4-5% di isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di 0,2-0,5 L / min; utilizzare 0,5-2% per la manutenzione. Questo protocollo non è appropriato per tutti gli animali. Consultare il veterinario strutturaper le istruzioni corrette e la formazione. Rispettare le raccomandazioni pertinenti IACUC per raggiungere i più alti standard di benessere degli animali. Assicurarsi che il mouse, se completamente anestetizzato.
3. 'Strap' il topo anestetizzato ad un tavolo superficie di appoggio in una dorsale o posizione ventrale con del nastro adesivo di laboratorio. Attenzione l'orientamento anatomico sul vostro schermo endoscopio. Fissare le estremità inferiori e coda. Una banda di nastro può anche essere posizionato sul petto per impedire il movimento lontano dal respiratore, ma evitare di limitare i movimenti respiratori toracici.

3. Dettagliata endoscopica esame

1. Ricerca lesioni perianali prima di inserire l'endoscopio nel retto, poi avanzare la portata attraverso l'ano.
2. Cappotto l'endoscopio con lubrificante sterile chirurgica. Assicuratevi di non rivestire la superficie del CCD (dispositivo ad accoppiamento di carica) del sensore.
3. Inserire l'endoscopio e avviare la registrazione. I video registrati sono utili per mla valutazione eticulous dell'endoscopia se necessario dopo l'esame. Provare a eseguire l'endoscopia nel minor possibile durata del ridurre al minimo l'irritazione intestinale / mucosa.
4. Applicare aria usando una siringa per impostare lentamente a parte le pareti intestinali. A seconda delle dimensioni del mouse, usare 1-2 ml di aria. Evitare l'eccessiva insufflazione di aria, può causare difficoltà respiratorie e la morte del topo anestetizzato.
5. Far avanzare l'endoscopio avanti come si cancella il modo con aria o la rotazione dolce del campo di applicazione. Non far avanzare l'endoscopio se non si vede lume intestinale. Perforazioni o lacerazioni rettali / colon possono verificarsi in questa fase, soprattutto in topi giovani (<8-10 settimane di età). Scattare foto come necessario.
6. Poiché la portata avanza, valutare se vi è sanguinamento spontaneo (definito come in natura mucosa emorragia non associata a endoscopia traumatico). Sanguinamento spontaneo può osservare come l'endoscopio entra nel retto e del colon.
7. ComeSess la trasparenza della parete del colon. La trasparenza è definita come la capacità di visualizzare i vasi sanguigni intramurali nel colon e quella degli altri visceri circostanti (Figura 4). Dolce movimento del campo di applicazione (back-forward, in senso orario, antiorario) contribuirà a determinare se i vasi sanguigni può essere visto nel contesto di altri visceri. Tessuto adiposo mesenterico può anche essere visto. Nota se il retto all'interno della cavità pelvica appare meno trasparente rispetto alla parete del colon nella cavità addominale.
8. Controllare per determinare il tipo e il numero di lesioni focali (aree edematose, erosioni, ulcere, masse tumorali). Questo verrà registrato nella forma di punteggio con il punteggio di infiammazione del colon e gli identificatori decimali che sono stati sviluppati.
9. Una volta che la zona in cui il colon flette caudalmente nel colon prossimale viene raggiunto, ritirare l'endoscopio lentamente e cercare la presenza di contatto sanguinamento (che si verifica a causa di friabilità della mucosa dopo l'endoscopio è avanzato o rimosso). Non è necessario raschiare la superficie colon intenzionalmente. Healthy mucosa del colon-retto non sanguina dopo un esame endoscopico corretta.

4. Biopsia

1. Quando sono necessarie biopsie, inserire le pinze biopsia attraverso il canale dell'endoscopio dedicato per la strumentazione. Monitorare l'avanzamento della pinza sullo schermo endoscopio per evitare perforazione intestinale.
2. Aprire le tazze biopsia della pinza a circa 60-80 ° angolo tazza al bicchiere, e dirigerli verso la zona di interesse. Forcipe o pressione eccessivamente aperti possono comprendere strati supplementari di tessuto intestinale, che si traduce in una perforazione biopsia indotta delle pareti intestinali trasparenti sani. Se si verifica la perforazione, eutanasia dell'animale durante l'anestesia con le raccomandazioni IACUC. Perforazioni comportano dell'endotossemia e peritonite.
3. Chiudere le coppe biopsia, e tirarli fuori mantenendo le pinze chiuse.
4. Remove il campione dal forcipe dal lavaggio del tessuto con una soluzione che è delicato per il tessuto e le pinze. RNA tardi e PBS sono soluzioni di lavoro comuni, se necessario, utilizzare l'ago per rimuovere il campione. Evitare erodendo le tazze forcep o taglienti.

5. Recupero da anestesia

1. Al termine dell'esame, fornire un ambiente caldo al mouse finché non recupera. Utilizzare una luce elettrica, o un pad calda a 37 ° C. Evitare il surriscaldamento; vasodilatazione periferica compromette il recupero degli animali. Monitorare il mouse vicino fino al completo recupero.

6. Integrato endoscopica Scoring System of Colorectal Salute con decimali identificatori

1. Utilizza il modulo di punteggio (Figura 2) e le definizioni dei parametri sottostanti (valutazione endoscopica del colon-retto murini infiammazione e tumori utilizzo di un sistema di punteggio decimale ponderato: parametri definizioni, e il protocollo) peresempi e opzionale 'sistema di punteggio distale-prossimale endoscopica Colite' (D-PECS) come linee guida per la valutazione nonbiased e dettagliata tenuta dei registri.
2. Segnare i quattro parametri di infiammazione colorettale descritti nel modulo sistema di punteggio (Figura 2). Meticolosamente valutare la regione perianale, trasparenza intestinale, tipo di sanguinamento intestinale (se presente), e la presenza e la quantità di lesioni focali (erosiva, ulcerativa, e / o tumorale).
3. Nel valutare i tumori per scopi di ricerca, di esaminare la quantità, la posizione e le dimensioni, e descriverli utilizzando la mappa del colon e grafico a barre sul modulo di punteggio. La somma numerica dei punteggi ottenuti ed il numero di lesioni (se del caso) determinerà sfondo infiammazione del colon, il tipo più predominante di lesione, e il numero di lesioni.

Representative Results

Il protocollo e le immagini presentate in questo studio sono stati preparati con una Olympus URF-V endoscopio flessibile ¹⁴ e NBI ^11,15. Le immagini video sono state salvate in formato MPEG-2 e le immagini in formato JPG, TIF, PNG, o in formato DICOM con un massimo di 1.280 x 1.024 pixel, valori di memorie portatili USB flash standard. NBI aumenta il contrasto visivo dei tessuti-emoglobina contiene. Luce normale e di imaging NBI sono caratteristiche fondamentali per illustrare l'anatomia normale della mucosa del colon-retto e le differenze tra vascolarizzazione normale e anormale durante ulcerazione e lo sviluppo del tumore (Figure 3A e 6A). Immagini con blu di metilene come mezzo di contrasto durante chromoendoscopy dimostrano i suoi benefici per le immagini close-up, rivelando l'antenna normale aspetto a nido d'ape delle cripte del colon (vedere da vicino in Figura 3B).

Fino ad oggi, abbiamo condotto oltre 500 endoscopie murini Following questo protocollo, con circa il 10% che rappresenta un esame ripetuto. In generale, la procedura richiede 10-15 minuti per completare, diviso equamente tra la somministrazione di anestesia, endoscopia, e il recupero dall'anestesia. L'esame copre dall'ano alla flessura splenica del colon distale. Abbiamo anche condotto con successo esami endoscopici post-mortem del colon prossimale, cieco e ileo in alcuni casi, a seguito dissezione post mortem dei tessuti immediatamente precedenti tessuti raccolta per istologia (Figura 6B). In un caso, abbiamo anche osservato e confermato sospetta dilatazione gastrica in un topo affetto da grave stenosi duodenale e occlusione a causa di aderenze intestinali. L'immagine anomali transmurally dal aspetto più craniale di un colon distale leggermente infiammato; esame autoptico mostrava stomaco dilatato è stato giustapposto al colon.

Abbiamo sviluppato una s decimali ponderato validi e affidabiliSistema di carotaggio a migliorare l'applicazione standardizzata di endoscopia murino attraverso studi di ricerca pubblicati. Tre sistemi di punteggio sono stati precedentemente impiegati e servito come base per lo sviluppo del nostro sistema decimale ponderato ^4-6. Sebbene questi sistemi consentono di classificazione dei vari criteri e livelli di gravità della lesione, mancano definizioni criteri propri, alcuni dei quali sono di difficile valutazione da immagini endoscopiche. In alcuni casi, i parametri ambigui inclusi nei sistemi di scoring hanno rilevanza discutibile esame endoscopico nei topi. Una sintesi di undici parametri pubblicati ^4-6 ed i loro vantaggi endoscopiche, limitazioni e rilevanza fisiologica sono presentati nella tabella 1.

Poiché il sistema di punteggio endoscopia del colon murino proposto sarà utilizzato per scopi di ricerca, la sua utilità per l'esecuzione di inferenza statistica era essenziale. Per assicurare che il sistema di punteggio avevaalta validità di costrutto, in primo luogo abbiamo sviluppato un quadro concettuale per identificare i parametri rilevanti, raggruppato questi parametri per meno criteri (n = 3), e valutato la loro colinearità e correlazione con l'effettiva presenza di infiammazione e di guarigione (Figura 7). Successivamente, abbiamo aggiunto i risultati perianali con interi discreti per rappresentare i livelli ordinali di gravità, e integrato il concetto di induzione del tumore e sviluppo utilizzando identificatori decimali. Inoltre, abbiamo aggiunto 'critiche' come un altro parametro non precedentemente considerate / riportato in murino endoscopia intestinale. I punteggi di output risultanti producono alta validità e sono adatti per l'analisi statistica parametrica. Infine, abbiamo aggiunto la mappatura e la capacità di plottaggio numerici per il monitoraggio dettagliato della malattia.

Per valutare la validità convergente del nostro sistema di valutazione, i punteggi ottenuti dai tre parametri pubblicati per 36 colonscopie del mouse sono stati confrontati con i punteggi ottenunito dalla stessa persona cieca utilizzando tre sistemi di valutazione precedenti ^4-6. Ogni confronto ha mostrato una buona correlazione positiva, indicando ad alta validità convergente per il nostro sistema integrato di punteggio (Pearson p <0.0001; Figura 8). L'analisi sostiene l'inclusione dei risultati perianali come parte dei criteri clinici per valutare la salute del colon-retto, come era comunemente presenti nei casi di colite severa e una maggiore dispersione dei dati (P ​​= 0,0351 tra punteggio 0 e 1, P = 0,0086 tra il gol del 2 e 3, Figura 8B). Quando il sistema di punteggio integrato (dopo l'aggiunta risultati perianali) è stato confrontato con altri sistemi disponibili, era evidente che 2 degli altri 3 sistemi hanno una limitazione importante inferenziale causa di raggruppamento dei casi ad una delle quattro possibili categorie interi, un importante l'indicazione del metodo di misclassificazione (Figura 8C) ^16. Con gli identificatori decimali, il nostro nuovo sistema di punteggio ha la più bassa probabilità di cluse cancella i punti dati in categorie interi.

Figura 1. Strumenti. Endoscopio flessibile, sistema di controllo video, fonte di luce, registratore video e di macchine per anestesia per inalazione utilizzato in questo studio. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 2. Forma di sistema di punteggio decimale per la valutazione di colite e colon-retto tumori nei topi. Il sistema ha una componente infiammatoria nucleo di quattro parametri non co-lineari, grafica per tUmor informazioni, e le unità decimali per lesioni importanti o complicazioni. Vedi criteri dettagliati ed esempi nella sezione sottostante (valutazione endoscopica del colon-retto murini infiammazione e tumori Utilizzando un decimale ponderato Scoring System). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3. Immagini accoppiate di mucosa normale in modalità normale luce endoscopica, la modalità NBI, e con chromoendoscopy. Arborization dei vasi sanguigni è normalmente meno comune nel retto. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 4. Rappresentazione in sezione trasversale di anse intestinali per illustrare il principio di trasparenza endoscopica della parete intestinale nel topo. Visualizzazione endoscopica di vasi intestinali murali e grasso mesenterico, e che di vasi mesenterici e grassi da visceri sano adiacente, è possibile attraverso la parete di un colon sano. L'infiammazione e ispessimento della parete intestinale nelle sezioni peritoneale del colon distale impedisce la visualizzazione delle strutture intramurale e transmurali di altri visceri, anche se altri segmenti intestinali sono sani. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 5. Risoluzione dei problemi. Risoluzione scarsa visibilità causata dal contenuto intestinale, immagini sfocate e movimenti peristaltici. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 6. Immagini associati (luce regolare vs banda stretta di imaging, NBI), del malato mucosa del colon-retto e altri segmenti intestinali prossimali. NBI aiuta a identificare ulcerosa e lesioni tumorali. Alcune ulcere appaiono marrone con NBI, altri, rivestite di materiale fibrinoso appaiono spesso e bianco. I tumori AOM / DSS sono meglio caratterizzati con NBI, soprattutto durante le fasi iniziali quando non sonosporgente nel lume. Gli asterischi (*) evidenziano artefatto endoscopica (ondulazione della mucosa) in colon pieno di PBS, non osservate in tutte le altre immagini in cui colon è disteso con l'aria. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 7. Correlazione teorica e co-linearità tra la gravità della infiammazione intestinale e la capacità di diversi criteri pubblicati visivamente discernere e grado di infiammazione del colon (vedi Tabella 1). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 8. Confronto di prestazioni tra il nostro sistema di valutazione e sistemi di punteggio precedentemente pubblicati. Dati dalle analisi cieche appaiati del 36 endoscopie video di mouse. A) Confronto tra sistema A (5 parametri) per i parametri infiammatori, tranne le lesioni perianali (3 parametri). B) importanza di includere i risultati perianali nel sistema di punteggio;. esame perianale costantemente fornito ulteriori informazioni statisticamente significativo nei casi di moderata grave colite / nei topi C) Prestazioni del sistema di punteggio dopo compresi gli accertamenti perianali rispetto ai sistemi precedentemente riportati (36-video-mouse endoscopie sono stati segnati con ogni metodo). Si noti che i sistemi B e C hanno una grande limitazione di raggruppamento dei casi in una delle loro quattro categorie principali di misclassificatpolarizzazione ionica (sistemi B e casi di cluster C in categorie non equivalenti). Con l'aggiunta di identificatori decimali, abbiamo anche abbassato la possibilità di raggruppamento in categorie interi, pur consentendo il monitoraggio dei punteggi numerici ora significativi. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Tabella 1. Parametri clinici pubblicati come criteri endoscopici per valutare infiammazione intestinale nei topi. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Endoscopica VALUTAZIONEnt murini di infiammazione del colon-retto e tumori Utilizzando un decimale ponderato Scoring System: Parametro Definizioni e protocollo

Il nostro sistema di punteggio endoscopico integrato per la salute del colon-retto ha tre componenti principali: 1) la valutazione della portata e della gravità di infiammazione del colon-retto, con quattro parametri e le 12 possibili gradi numerici; 2) registrazione della posizione, dimensione e numero di lesioni tumorali e 3 ) quote decimali con i tipi assegnati di lesioni primarie o predominanti e complicazioni endoscopiche per evidenziare i risultati di particolare importanza per il ricercatore, di seguito denominati "identificatori decimali". La posizione e le dimensioni dei tumori sono registrati su una mappa colon virtuale, e il numero di tumori in ciascuna percentuale di sporgenza (ostruzione) nel lume viene registrato su un grafico. Questi due grafici forniscono informazioni tumore che può essere integrato in tre dimensioni. Le unità decimali per categorie lesione vanno 0,0-0,9. Se il numro di lesioni per una particolare categoria è pertinenti, secondo e terzo decimale possono essere usate per indicare il numero di lesioni. Ad esempio, se si osservano tre lesioni, aggiungendo 0.003 permetterebbe al ricercatore di sapere che ci sono stati tre lesioni, se ci sono 12 lesioni, quindi 0.012 sarebbero stati utilizzati. Questo sistema di monitoraggio è di beneficio speciale se sono previsti esami endoscopici ripetute. Definizioni dettagliate dei criteri di infiammazione e gradi di gravità sono riportati di seguito.

A. Valutare infammation del colon-retto con quattro parametri clinici - definizione di criteri endoscopiche

1. Risultati perianali: un voto a questo aspetto prima di iniziare scoping per evitare confusione con sanguinamento post-endoscopia. Salute della regione perianale è un proxy per lo stato di salute del colon, pelle, e l'atteggiamento dell'animale, in generale, ed è incluso come parte dell'esame endoscopico perché alcune lesioni non può e should non essere esaminati attentamente ad occhio nudo. Esercizio misure di biosicurezza a seconda dei casi. Si noti che le abitudini sane per governare i topi possono rimuovere sangue / scarichi, ma non rimuovere le lesioni cutanee della regione perianale. Punteggio:

0. Normale. Senza sangue, diarrea, ragadi, fistole o scariche osservati.
1. Ciuffi di materia fecale o diarrea osservati.
2. Coaguli / ciuffi di scarico sanguinante, feci sciolte (diarrea), pus, o ulcerazioni minori osservati.
3. Tessuto di granulazione o lesioni osservate che coinvolgono la maggior parte della pelle circostante e indicano che l'animale è contrassegnato irritazione o infiammazione nella regione perianale; prolasso rettale.

2. Trasparenza del colon: definita come la capacità di visualizzare i vasi sanguigni o organi parascolastiche attraverso la parete del colon, come il colon-endoscopio viene delicatamente mosso. Si noti che il retto è naturalmente meno trasparente per via gli strati muscolari und perché è nella cavità pelvica dove esiste minore contrasto. Questo è uno dei parametri fisiologicamente più completi in quanto riflette la condizione infiammatoria generale o la salute del colon murino. Si noti che è possibile avere due punti non infiammati con mucose erosioni / ulcere nei primi stadi di infezione o di effetti tossici sul epitelio. Attenzione che la soluzione isotonica fisiologica deve essere utilizzata per il lavaggio durante l'endoscopia, come soluzioni ipotonici, come l'acqua, causano cambiamenti con sbiancamento e la contrazione della mucosa nei topi se l'uso per lunghi periodi (vedi asterischi in figura 6).

0. Normale. Grandi e piccoli vasi sanguigni del colon e dei visceri circostanti sono chiaramente visibili. Spostare l'endoscopio leggermente (avanti e indietro, orologio / antiorario). Possono anche essere osservati Bianco grasso mesenterico o il contenuto oscuro di altri visceri.
1. Piccoli vasi sono in parte invisibili ma grandi navi sono visibili.
2. Piccolo vesseLS sono invisibili e le grandi navi non sono chiare. La mucosa non appare ispessita.
3. Ispessimento apparente della parete intestinale e / o edema della mucosa / generalizzata. I vasi sanguigni non sono visibili. Poche navi dilatato / varicose possono essere visibili in alcuni casi.

3. Sanguinamento delle mucose: Differenziare contatto sanguinamento da emorragie spontanee. Procedure endoscopiche standard di routine in topi sani non devono indurre sanguinamento. Se vi è l'infiammazione, l'aumentata vascolarizzazione della mucosa e fragilità tissutale può portare alla mucosa erosione e sanguinamento. Non c'è bisogno di raschiare intenzionalmente colon per valutare questo parametro.

0. Normale, nessun sanguinamento.
1. Sanguinamento contatto comune. Questa emorragia traumatica è definito come il contatto sanguinamento, che dovrebbe essere giudicato solo dopo aver ritirato l'endoscopio.
2. Non applicabile. Intenzionalmente non assegnato forzare l'esaminatore per decidere la nature di sanguinamento.
3. Sanguinamento spontaneo, definito come una emorragia non traumatica e in natura che si osserva come l'endoscopio entra nel colon. A volte, insufflazione d'aria induce sanguinamento spontaneo durante una grave colite.

4. Lesioni focali: Per accogliere il chiazze, natura imprevedibile di malattie colorettali, questo sistema di punteggio integrato permette di classificazione per la presenza di lesioni focali (principalmente ulcerosa in natura) dalla gravità dell'infiammazione. Poiché il colon è un breve segmento tubolare, dritto nei topi, si è ritenuto necessario descrivere la posizione delle lesioni. Invece, il numero di lesioni vengono registrati e aggiunto al punteggio totale secondo il sistema di identificatori decimali. Tuttavia, se è necessaria l'accento sulla localizzazione delle lesioni, abbiamo un'opzione chiamata 'distale-prossimale endoscopica Colite Scoring System' (D-PECS) descritto di seguito nella sezione F. applicazioni ulteriormente semplificate possono esserederivata dal nostro sistema di valutazione decimale. Poiché esistono tumori raramente senza indurre una qualche forma di infiammazione nella regione retto nei topi, abbiamo incluso tumori nella sezione identificatori decimali per consentire univocamente studio dei tumori nel contesto della salute intestinale (vedi sotto).

0. Normale, niente lesioni focali.
1. Zone ben definite di piccola altura piatta coperti da mucosa normale osservati. Questo è quello di affrontare le aree edematose locali o potenziali aree di infiltrazione di cellule / proliferazione, come si trova nella colite lieve.
2. Arrossata o aree erosivi osservati.
3. Ulcerazione o stenosi. Le ulcere sono identificati da arrossamento e deformità (bordi irregolari con evidenza di vascolarizzazione anomala) a causa di riparazione edematosa o fibrotico ferita. NBI endoscopia è utile differenziare il rilevamento o l'osservazione di ulcerazioni. Stenosi sono riconosciuti come aree anormalmente strette, circolari o irregolari e statiche in forma, che non si contraggono o espandono come expected. Spesso le critiche riguardano le aree di cripte della mucosa anormali, o villi nel ileo. Nel caso degli endoscopi flessibili (diametro esterno = 3,3 millimetri) l'attenta incapacità di avanzare il campo di applicazione in aree più prossimali del colon è stato costantemente associato a stenosi anormali verificati post-mortem.

B. grafici tumore per luogo di registrazione, dimensione e numero

1. Virtuale mappa colon: Questa mappa è una immagine prospettica virtuale del colon distale e del retto che è fatta tagliando la parte superiore del lume (0 °) e stendendola. La parte superiore e inferiore del grafico vengono assegnati prossimale del colon (flessura), e l'ano, rispettivamente. La linea centrale (180 °) indica il fondo del lume (ventrale di animali), e delle metà destra e sinistra dei semicerchi indica la destra e sinistra parete del lume. La mappa può essere usato per descrivere la posizione e la dimensione orizzontale dei tumori, nonchécome ulcerazioni.

2. Numeri tumorali per ciascun grado di occupazione tumore: Sebbene la mappa colon fornisce solo informazioni bidimensionale, la misura in cui i tumori crescono nel lume intestinale è una caratteristica importante di tumori, poiché protrusione può causare stenosi intestinale o ostruzione. Per acquisire queste informazioni, abbiamo aggiunto un grafico di registrazione per cento protrusione nel lume che documenta il numero di tumori in ogni intervallo di percentuale, permettendo una prospettiva tridimensionale per valutare l'entità dei tumori del colon.

Identificatori C. decimali per rendere punteggi numerici significativi e casi pertinenti fast-track

Il nostro sistema di punteggio utilizza un sistema identificatore decimale romanzo per registrare la presenza di lesioni o complicazioni rilevanti. Questi identificatori sono puramente descrittive e hanno lo scopo di facilitare l'interpretazione di una partitura e accelerate numerici casi di interesse endoscopica. Tuttavia, essi servono anche a numericamente peso tipi predominanti di lesioni, e permettere la generazione di set di dati suscettibili di statistiche parametriche. Quando si utilizza il modulo di punteggio sviluppato, contrassegnare le lesioni come appropriato, e scegli un identificatore decimale da aggiungere al punteggio infiammatorio.

0. Nessuna risultati particolari.
1. Fistola perianale, o eccessiva infiammazione perianale, prolasso rettale.
2. Lesioni erosive Principalmente con coinvolgimento della parete minore.
3. Lesioni ulcerative Principalmente, alcune coperte con fibrina, sciogliersi o grande, con forme irregolari a causa della coalescenza di piccole ulcere (il numero di ulcere può essere registrato come 0.301 per un tumore, 0,302 per due tumori, 0,311 per undici tumori, ecc.).
4. Stenosi intestinale (opzionale perché stenosi è una grave complicanza infiammatoria nella colite, aggiungere 2 punti al punteggio infiammatorio totale).
5. Placca ben definiti (tessuto di spessore / non trasparente all'interno della parete intestinale, ad esempio & #160; un tumore a bassa altezza piatto). Il numero delle placche può essere registrato come descritto per le lesioni (ad esempio, 0,401, 0,402, 0,411 ..., ecc.). Possono apparire come una superficie non piana espandibile che può sembrare a sporgere fino a circa il 5-10% che modifica l'aspetto circonferenziale del lume intestinale.
6. Sporgenti di massa o lesione tumorale. Il numero delle masse può essere registrato come descritto per le lesioni (ad esempio, 0,601, 0,602, 0,611 ..., ecc.). Essi sono chiaramente sporgenti, ma possono apparire piatta ma sporgente> 15% della circonferenza disteso del lume intestinale.
7. Indotto lacrima / perforazione durante l'endoscopia.
8. La morte di animali durante l'endoscopia.
9. Altro: _____________ (ad esempio, una grave colite endoscopica prossimale, distale-prossimale vedere endoscopica Colite Scoring System sotto).

D. Esempi ed applicazioni

Il sistema di endoscopia punteggio murino presentata in questo documento è specifically progettato per integrare la raccolta e l'analisi dei dati relativi infiammazione del colon e tumori colorettali. Per quanto riguarda i tumori, i dati possono essere analizzati utilizzando diversi approcci statistici, inclusi area sotto la curva, mediana, moda, o analisi delle componenti principali. A livello individuale, il sistema di punteggio può aiutare i ricercatori a monitorare la salute del colon in un singolo mouse nel corso del tempo. Dopo sommando i punteggi parziali infiammatorie e aggiungendo l'identificatore decimale appropriato per il tipo e il numero di lesioni se del caso, il punteggio totale permetterà ai ricercatori di quantificare numericamente il grado di infiammazione del colon, il tipo più predominante di lesione, e il numero di lesioni. Ad esempio, un punteggio di 12,609 indica che questo mouse è grave infiammazione del colon e nove sporgenti masse tumorali; un topo sano con una regione perianale normale e mucosa colorettale che è stato perforato durante endoscopia avrebbe un punteggio totale di 0.7. Il sistema identificativo decimale saràconsentono ai ricercatori di catalogare e cercare facilmente grandi archivi di dati di topi segnati. Ad esempio, un ricercatore potrebbe impostare criteri di ricerca per individuare tutti gli spartiti che terminano in "0.6" e recuperare tutti i casi che hanno tumori sporgenti. Altri esempi sono illustrati nelle figure complementari S1-S3.

E. distale-prossimale sistema di punteggio colite endoscopico (D-PECS)

Si tratta di una modifica facoltativa del nostro sistema di identificazione di punteggio decimale di differenziare i casi con grave colite estesa / prossimale. Poiché i segni endoscopici di colite e tumori colorettali nei topi sembrano sviluppare costantemente nei segmenti distali del colon si consiglia di:

• Per segnare i due punti seguendo i criteri descritti, con particolare attenzione ai distali due terzi del colon e ignorare il segmento prossimale, se è apparentemente sani. Ciò evita confusione e aumenta il potere discriminatorio di endoscopia a differenanimali ziare con vari gradi di vasta colite.
• Se si osservano alterazioni infiammatorie o tumorali nel terzo prossimale, si consiglia di aggiungere un punto al punteggio totale (1.0) e assegnare l'identificatore decimale come '0 .9 - Altro ', che potrebbe essere etichettato come una grave colite endoscopica prossimale. Tracciare i risultati nella mappa di rete e grafico a barre.
• Monitorare gli animali che hanno anomalie endoscopiche nel terzo prossimale del colon. Prestare particolare attenzione post-mortem, la malattia può essere insolitamente grave o può estendersi oltre la flessura splenica verso il colon prossimale.
• Se questa raccomandazione è stata seguita, registrare questo approccio nella sezione 'osservazioni' del modulo di valutazione, e seguire questa tendenza attraverso esperimenti. Si prega di citare nella pubblicazione finale che la valutazione è stata condotta seguendo il nostro 'sistema distale-prossimale endoscopica di colite segnare' o D-PECS, che spazia 0-13,9. Si noti che questa modifica non ha s Effetto tatistical sul nostro sistema di valutazione, se utilizzato in animali senza estesa / grave colite prossimale.

Cifre supplementari.

Figura s1. Esempio di valutazione endoscopica di un mouse con i tumori del colon-retto. Gli animali sono stati trattati con AOM e DSS prima endoscopia. A) immagine Rappresentante in modalità normale ed NBI, rispettivamente. B) sotto forma di punteggio pieno di reperti endoscopici. Si noti che anche se ci sono due risultati rilevanti, il ricercatore ha scelto di assegnare l'identificatore decimale 0,6 in base alla gravità clinica e obiettivi di ricerca. Una varietà di analisi statistica parametrica può essere effettuata con i dati registrati nella 'Carta dei tumori / ulcere' e il 'Record di sporgenze tumorali' grafici. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura s2. Esempio di un mouse con una stenosi del colon e una complicazione endoscopica. Notare il restringimento del lume intestinale e che un nonperforating, mucosale strappo è stata indotta durante endoscopia appena distale al sito stenosi. Restringimento e debilitazione del colon infiammato può provocare lacrime mucose. L'animale era sotto anestesia generale. Si noti che il sistema di punteggio ci ha permesso di controllare e ridurre le complicazioni procedurali. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura s3. Esempio naturalmente tempo di infiammazione e segnando endoscopica in un mouse DSS-trattati. Notare che i numeri possono essere auto-esplicativo e indicano che l'infiammazione del colon progredito (da 1-5 e 8), e che erosioni sviluppate da giorno 8 (decimale 0,2 ) e ulcere di giorno 11 (decimale 0.3). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Discussion

Ci sono diverse considerazioni per quanto riguarda la modifica e la risoluzione dei problemi della tecnica endoscopica nei topi. Aspetti critici della procedura che deve essere padroneggiato durante l'uso di endoscopia flessibile includono la regolazione del volume d'aria necessario per prevenire distensione addominale e compromissione respiratoria del mouse, e gli aspetti tecnici minori del controllo della vista con il coordinamento dei controlli angolazione e di coppia . Controllo di coppia è importante ridurre al minimo il rischio di perforazione intestinale. Se gestita correttamente, murino endoscopia flessibile diventa molto sicuro, procedura rapida che permette la visualizzazione diretta e la biopsia intestinale campionamento di aree di interesse della ricerca.

Per risolvere view ostruzioni dovute alla materia fecale (Figura 5), è importante capire che il pellet fecali si osservano di solito anche dopo il digiuno o l'uso di lassativi. Quando presenti, le feci possono essere facilmente spostati prossimale con ins aria dolceufflation. In circa il 11% dei casi, è necessario utilizzare anche 1 ml di PBS clistere. Prima di svolgere il clistere, prestare attenzione quando si esaminano gli animali che sembrano avere distensione addominale o che sono incinte. Per i movimenti peristaltici, è importante attendere qualche secondo fino a quando l'onda peristaltica passa dal insufflazione d'aria non si ferma la peristalsi.

Ad oggi, la maggior parte dei sistemi di valutazione endoscopici utilizzati per valutare la malattia intestinale murino sono specifici sia per colite o cancro. Dato che queste due condizioni si verificano spesso in concomitanza e possono interagire uno con l'altro, un sistema di punteggio standardizzato che tiene conto sia l'infiammazione e la formazione di tumori faciliterebbe notevolmente la comunicazione interdisciplinare, rafforzando in tal modo la fruibilità delle informazioni acquisite nel corso della ricerca gastrointestinale dai ricercatori del cancro, e viceversa. Poiché esistono tumori raramente senza indurre una qualche forma di alterazione infiammatoria nella regione colorettale in topi, abbiamo incluso tumori nella sezione identificatori decimali del nostro sistema di valutazione per consentire univocamente studio dei tumori nel contesto della salute intestinale. Per migliorare la validità e l'affidabilità del sistema di punteggio e facilitare il suo utilizzo negli esperimenti a lungo termine o studi clinici, abbiamo anche sviluppato una forma di rapporto standardizzato da utilizzare unitamente al sistema di punteggio (Figura 2), che memorizza sistematicamente gli elementi di dati necessari per calcolare murini punteggi di infiammazione intestinale, sulla base di definizioni precise per ogni criterio di classificazione.

Il precedente disponibilità di più murini sistemi di endoscopia punteggio di validità limitata ostacola l'interpretazione dei risultati tra gli studi. Per ridurre al minimo la confusione vissuta da personale di laboratorio nel decidere quale pubblicò metodo da utilizzare, si consiglia di eseguire una valutazione endoscopica utilizzando criteri desumibili dalle immagini bidimensionali (ad esempio, evitare di criteri that si riferiscono alla trama o la coerenza - di feci,. notare che alcuni topi compresi privo di germi possono avere feci molli), e che non sono co-lineare (cioè che sono fisiologicamente e temporalmente guidato dallo stesso contesto infiammatorio) Poiché i segni cardinali di infiammazione sono sequenziali a causa cronologico eventi infiammatori, vi consigliamo i seguenti criteri: 1) trasparenza intestinale, in primo luogo descritto da Becker et al ^4, come un riflesso dello spessore della parete, 2) sanguinamento, come indicatore di mucosa e l'integrità dei vasi sanguigni. ; 3) risultati perianali, come indicatore di integrità del colon e irritazione cutanea o predisposizione per l'infiammazione eccessiva, e 4) lesioni focali, al grado della gravità delle lesioni infiammatorie (che sono in topi principalmente ulcerosa). Ad oggi, non abbiamo visto le lesioni tumorali nei modelli tipici del 3% DSS-indotta colite murina. Il sistema murino punteggio endoscopico descritto in questo documento fornisce per la prima volta, a nostra conoscenzaun meccanismo quantitativa per valutare la presenza e l'induzione di lesioni tumorali nel contesto di infiammazione del colon.

Per la prima volta, si sottolinea anche l'importanza di includere stenosi come parametro durante l'endoscopia murino, dal momento che sembrano essere comunemente presenti in alcuni modelli animali di infiammazione intestinale, per esempio SAMP / Yit / Fc. Stenosi rappresentano (semi) aree circolari di sottomucosa infiammazione cronica, con perdita di elasticità intestinale a causa di un aumento della fibrosi, che sono difficili da valutare endoscopicamente per il debuttante. Abbiamo notato nei topi stenosi colpite endoscopicamente definiti, che c'è più infiammazione in segmenti che sono prossimale alla stenosi rispetto ai segmenti distali (che possono essere esaminati endoscopicamente), probabilmente dovuto al transito intestinale rallentato. Ai fini della ricerca, si consiglia di seguire gli animali istologicamente alla fine degli esperimenti per caratterizzare meglio l'infiammazionerisposte dell'infiammazione che fiancheggiano le regioni stenosi candidati.

Senza una formazione adeguata e risposte di esperti, qualsiasi sistema di punteggio può avere variabilità in qualsiasi momento. E 'importante sottolineare che le procedure di formazione endoscopiche condotti sui topi dovrebbe essere monitorata da un veterinario qualificato di medico al fine di garantire: i) una formazione adeguata di altri scienziati o tecnici, e ii) assicurare che gli animali non sono mal diagnosticati o inavvertitamente feriti durante l' procedura. Prima di procedere ad attuare questa procedura per garantire la migliore prassi e il benessere degli animali Consultare il veterinario responsabile del centro di ricerca animale per la consulenza di esperti. Si consiglia di monitorare regolarmente le prestazioni di endoscopists addestrati. Utilizzare le immagini che abbiamo presentato qui come linee guida, casuale l'ordine in cui gli animali vengono valutati, e valutare ogni animale in cieco. Consulta le definizioni dei parametri e dei criteri di protocollo periodicamente e kli EEP a portata di mano durante l'endoscopia e il punteggio Sezione 6).

In sintesi, come una squadra di gastroenterologi medici e veterinari, vi presentiamo un protocollo standardizzato e sistema di punteggio semi-quantitativo per la valutazione endoscopica di modelli murini di colite e tumori. Questi strumenti di ricerca consentiranno ai ricercatori di condurre endoscopie murini di routine, e consentiranno personale di ricerca a tutti i livelli di esperienza per generare misure riproducibili e confrontabili di infiammazione intestinale e la formazione del tumore attraverso laboratori e tra le discipline. Abbiamo sviluppato il sistema per produrre punteggi numerici significativi con l'alta validità, e ha fornito capacità di rapida monitoraggio di particolari risultati, che possono essere personalizzabile per uso interno nei singoli laboratori. Abbiamo anche Descriviamo un discriminatoria alternativa punteggio che prende in considerazione le differenze nella suscettibilità alla malattia regionale all'interno del colon (vedere Sezione E, ̵6; distale-prossimale sistema colite punteggio endoscopico, sigla D-PECS). Il modulo di report di dati e alcune figure possono essere utilizzati come poster a parete per aiutare gli scienziati inesperti (Figure 1, 3, 5, 6). Implementazione di successo di endoscopia murino cerniere a familiarizzare con la normale anatomia della giunzione mucocutanea in ano, retto, colon e visceri circostanti, le differenze anatomiche rappresentano sottili differenze endoscopiche ^17.

Anche se al momento anche le tecnologie più piccole, più flessibili e più belli endoscopici non possono raggiungere il colon prossimale in vivo, in rapido movimento progressi tecnologici nel campo della capsula e singola endoscopia a fibre possono diventare disponibili per i topi in un prossimo futuro. Il protocollo standardizzato e il sistema di punteggio endoscopico presentato in questo documento rappresentano validi strumenti per la visualizzazione e la valutazione dello stato dell'ambiente intestinale murino di animali vivi. Questi strumenti saranno facilitarecomparabilità tate dei risultati tra carte e attraverso le discipline, e dovrà applicabilità alle nuove ed emergenti tecnologie endoscopiche murini.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System