Гибкая Колоноскопия у мышей, чтобы оценить тяжесть колита и колоректального опухолей возможность использования системы Validated Эндоскопическая Scoring

Summary

За последние несколько лет, новые эндоскопы поколения появились в качестве важных диагностических исследований СПИДа для оценки мышиный колит и колоректального опухолей. Мы представляем здесь подробный протокол для эндоскопической оценки воспаления и колоректального опухолей у мышей, а также в качестве нового балльной системе, которая использует десятичные идентификаторы для документирования эндоскопическое тяжесть колита и колоректального опухолей.

Abstract

Использование современных эндоскопии для исследовательских целей в значительной степени облегчает наше понимание желудочно-кишечных патологий. В частности, экспериментальная эндоскопия была весьма полезна для исследований, требующих повторных взносы в одной лабораторных животных, таких, как тех, кто оценивает механизмы хронического воспалительного заболевания кишечника и прогрессирование рака прямой кишки. Однако методы, используемые в различных исследованиях, крайне непостоянны. По крайней мере, три эндоскопические системы скоринга были опубликованы для мышиного колита и опубликованы протоколы для оценки толстого кишечника не решают присутствие сопутствующей толстой воспаления. Это исследование разрабатывает и утверждает воспроизводимый эндоскопическое систему подсчета очков, которая интегрирует оценку как воспаления и опухоли одновременно. Эта система роман забил состоит из трех основных компонентов: 1) оценка степени и тяжести колоректального воспаления (на основе перианальных выводов, прозрачность вальл, кровотечение слизистой, и очаговые поражения), 2) количественный учет опухолевых поражений (сетка карты и гистограммы), и 3) численное сортировки клинических случаев их патологической и исследовательской актуальности на основе десятичных единиц с назначенных категорий наблюдаемых поражений и эндоскопические осложнения (десятичные идентификаторы). Видео и рукописи, представленные здесь были подготовлены после IACUC утвержденных протоколов, чтобы следователи забить свои собственные экспериментальные мышей, используя хорошо проверенные и хорошо воспроизводимый эндоскопической методики, с возможностью системы дифференцировать дистальнее от проксимального эндоскопической колита (D-ПЕСГ ).

Introduction

Мышиные эндоскопия была выполнена в качестве полезного инструмента исследования для более десяти лет ^1-3. На сегодняшний день большинство исследования с использованием мышиного эндоскопии использовали жесткие эндоскопы, хотя некоторые из них также используется гибкий сигмоидоскопию. Мышиные эндоскопия дает немедленные результаты и более объективная оценка степени кишечной нормальной, тяжести воспаления и прогрессирования опухоли по сравнению с косвенных мер, таких как потеря веса тела, диарея и гистологии (который является неоптимальным, когда поражения пятнистый), в то время как предлагая взглянуть на общее состояние здоровья толстой кишки. В частности, эндоскопии позволяет повторной оценки моделей лабораторных животных с течением времени, в отличие от традиционного гистологического исследования, что требует животному быть умерщвлены и двоеточие быть собраны для анализа ^1. Несмотря на эти преимущества, использование мышиного технологии эндоскопического не было широко распространено и ограничено отсутствием стандартных протоколов для implementatiна и озвучивание патологических. Правильно реализован, мышиный эндоскопии открывает большие перспективы для дальнейшего облегчения наше понимание и характеристика животных моделях множественными хроническими состояниями желудочно-кишечных заболеваний, в том числе воспалительных заболеваний кишечника, колита и колоректального опухолей.

Утилита мышиного эндоскопической техники петли после его воспроизводимости и объективности, который требует существование стандартизированных процедур экспертизы и последовательной, без резервирования, и надежную систему оценки для кишечных патологий. По меньшей мере три описательные системы баллов для эндоскопической оценки колита ^4-6, а также для толстой опухолей у мышей ^4,7,8 были опубликованы. Однако эти сообщенные подходы и скоринговые системы не являются легко сопоставимы в разных исследованиях. Во многих случаях нет четкого определения критериев, используемых для классификации поражений, и когда критерии приведены, они отличаются друг от друга. Кроме того,нет сообщалось системы скоринга, которые объединяют оценку как колит и опухолей, два из наиболее распространенных кишечных патологий, которые могут произойти одновременно и имеют интерактивные эффекты на исходе, в единый инструмент измерения. Наконец, эндоскопические системы скоринга, которые действительно существуют для колит часто имеют воспалительные категории с ограниченной дискриминации (т.е.. Узкие параметры скоринга на короткие целыми масштабах, часто 1-4), чтобы должным образом представляют сценарии прогрессирования заболевания и позволяющие использовать параметрического статистического анализа.

В данной работе мы описываем использование гибкого эндоскопа для оценки тяжести мышиного колит и толстой опухолей и описать стандартизированный протокол для использования этой технологии в анатомическом оценки перианальной области, прямой кишки и дистального отдела толстой кишки. Проиллюстрируем эффективное устранение неполадок при эндоскопии, чтобы минимизировать травмы и графические артефакты, и опишем воспроизводимую систему подсчета очковна основе проверенных опубликованных клинических параметров. Система подсчета очков интегрирует оценку как воспаления кишечника и опухолей с использованием высокий уровень дискриминации с 12 возможных сортов воспаления, отображение опухоли и построения вариантов, и нового блока десятичной системе (т.е. десятичные идентификаторы), чтобы выделить результаты с конкретной диагностической ценности ( т.е. развитие опухоли, осложнения во время эндоскопии и т.д.). Использование десятичных идентификаторов позволяет быстро отслеживания соответствующих наборов данных для дальнейшего нисходящего анализа. Наконец, мы выполняем надежность и тестирование действия системы скоринга в нескольких мышиных моделей колит и колит рака, ассоциированного с (декстран сульфат натрия (DSS), индуцированное-колит, Clostridium несговорчивый инфекции, и azoxymethane / DSS-индуцированной рака толстой).

Protocol

1. Настройка Эндоскопия системы

1. Настройте систему эндоскопии до обезболивающее мышей, в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте видео уретероскопа предназначен для людей для этого протокола (рис. 1). Наружный диаметр вставной трубки составляет 9,9 Fr (3,3 мм), его дистальный конец составляет 8,5 Fr (2,8 мм), а внутренний диаметр измерительной канала 6 Fr (1,2 мм).
2. Хотя использование эндоскопов не были связаны с передачи заболеваний [9], стерилизовать эндоскоп и объектив с 70% этанола ¹⁰ или с соответствующими методами при работе с спорообразующих микроорганизмов. Приготовьтесь бактериостатическое стерильной смазки и не царапины протрите ткани того чтобы насытить подсказку эндоскопа.
3. Прикрепите шприц 3 мл, полный воздуха (или подходящий CO ₂ газовой смеси) к верхней части приборного канала.
4. Включите питание, и настроить баланс белого в нормальном белом свете,а также узким изображений полоса (НБР) режим, когда это применимо. С 2001 года НБР предоставил диагностические преимущества визуализации, как это подчеркивает тонкие структуры кровеносных сосудов на слизистые оболочки, в том числе язвенных и опухолевых поражений, которые имеют характерный ненормальное васкуляризации ^11. Режим НБР-фильтр ограничивает длину волны захваченного света 390-445 нм и 530-550 нм, в которой подчеркивается структур с гемоглобином.
5. Распечатать Количественная оценка форму (рис. 2), чтобы записать ваши выводы. Ознакомиться с ожидаемыми нормальными и НБР изображений (рис. 3А) и определения и сортов каждого критерия перед экзаменом (см. раздел 6.1).
6. Подготовка краситель на основе раствора на фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение хромоэндоскопии, если это необходимо. В хромоэндоскопии, экзамен проводится с использованием красителя, как контрастного вещества, чтобы выделить слизистых изменения. Используйте метиленовый синий (0,1-1%) и индиго кармин (0,1%) решения (рис. 3б). Примечаниечто метиленовый синий является агентом окислительно-восстановительный, которые могут производить окислительные радикалы, косвенное сшивание аминокислотных остатков и деградации ДНК ^12, которые могут повлиять на анализ пробы.

2. Общая анестезия Мыши

1. Выберите анестетика и способа введения. Проконсультируйтесь с ветеринаром из центра учета ресурсов животных или институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) относительно возможных помех лекарств с иммунной системой и исследовательских целей. Некоторые лекарства могут влиять на экспрессию цитокинов профиля в животных, в том числе грызунов ^13. Используйте инъекций tribromoethanol для терминальных процедур или изофлураном для эндоскопии выживания, наряду с соответствующим контролем.
2. Для индукции, администрирование 4-5% изофлуран в 100% кислорода со скоростью 0,2-0,5 л / мин; использовать 0,5-2% на техническое обслуживание. Этот протокол не подходит для всех животных. Обратитесь в ветеринаруза инструкциями и обучения. Соблюдать соответствующие рекомендации IACUC для достижения самых высоких стандартов защиты животных. Убедитесь в том, что мышь, если полностью под наркозом.
3. 'Ремень' под наркозом мыши к опорной поверхности стола в спинной или брюшной положение с помощью лабораторных клейкую ленту. Остерегайтесь анатомической ориентации на экране эндоскопа. Закрепите свои нижние конечности и хвост. Полоса ленты также могут быть размещены на груди, чтобы предотвратить движение от респиратора, но не ограничивать грудной движения вентиляционной.

3. Подробное эндоскопическое обследование

1. Ищите перианальных поражений, прежде чем вставлять эндоскоп в прямую кишку, затем перейти сферу через анус.
2. Пальто эндоскоп стерильной хирургической смазки. Убедитесь, что не покрывать поверхность ПЗС сенсора (прибор с зарядовой связью).
3. Вставьте эндоскоп и начните запись. Записанное видео можно использовать для мпри необходимости после осмотра eticulous оценка эндоскопии. Попробуйте провести эндоскопию в мере возможного промежутка времени, чтобы минимизировать кишечника / слизистой раздражение.
4. Применить воздух с помощью шприца медленно отделил стенки кишечника. В зависимости от размера мыши, использовать 1-2 мл воздуха. Избегайте чрезмерного вдувания воздуха; это может привести к дыхательной недостаточности и смерти анестезированной мыши.
5. Авансовые эндоскоп вперед, как вы расчистить путь воздухом или легким вращением сферы. Не продвижения эндоскопа, если вы не видите просвет кишечника. Перфорации или ректальные / толстой слезы может происходить на этой стадии, особенно в молодых мышей (<8-10 недель). Сфотографируйте по мере необходимости.
6. По мере развития сферы, оценить, если есть спонтанное кровотечение (определяется как естественным кровоизлияние слизистой не связано с травматической эндоскопии). Спонтанные кровотечения могут наблюдаться как эндоскоп входит прямой и толстой кишки.
7. КакSESS прозрачность кишечной стенки. Прозрачность определяется как способность визуализировать очной кровеносные сосуды в толстой кишке, и что из других близлежащих внутренних органов (рис. 4). Слабый движение рамки (назад-вперед, по часовой стрелке, против часовой стрелки) поможет определить, если кровеносные сосуды можно увидеть в контексте других внутренних органов. Брыжеечный жировой ткани может также рассматриваться. Помните, что если прямой кишки внутри полости малого таза кажется менее прозрачным, чем кишечной стенки в брюшную полость.
8. Проверьте, чтобы определить тип и количество очаговых поражений (отечные районов, эрозий, язв, опухолевых масс). Это будет записан в виде скоринга с использованием толстой счет воспаления и десятичные идентификаторы, которые были разработаны.
9. После того, как область, где двоеточие сгибает каудально в проксимальном отделе толстой кишки достигается, снять эндоскоп медленно и смотреть на наличие контакта кровотечения (которое происходит из-за слизистой рыхлость послеэндоскоп является передовой или удален). Это не обязательно, чтобы очистить поверхность толстой кишки намеренно. Здоровый колоректальный слизистая не кровоточит после тщательного осмотра эндоскопической.

4. Биопсия

1. При биопсии необходимы, вставьте щипцы биопсии через эндоскоп канала, выделенной для приборов. Контролировать продвижение пинцетом на экране эндоскопа для предотвращения перфорации кишечника.
2. Откройте биопсии чашек пинцетом до 60-80 ° чашки к чашке углом, и направить их в интересующей области. Чрезмерно открытые щипцы или давление может понять дополнительные слои ткани кишечника, что приводит к биопсии, вызванной перфорации здоровых прозрачных стенок кишечника. Если перфорация происходит, усыпить животное во время анестезии следующие ваших рекомендаций IACUC. Перфорация привести к эндотоксемии и перитонита.
3. Закройте биопсии чашки, и вытащить их, сохраняя при этом щипцы закрыты.
4. Ремове образца из щипцов с помощью промывки ткани раствором, приятный для ткани и пинцетом. РНК позже и PBS общие рабочие растворы; при необходимости, использовать иглу, чтобы выбить образца. Избегайте подрывает Forcep чашки или режущих кромок.

5. Восстановление после анестезии

1. После завершения экспертизы, обеспечить теплую среду для мыши, пока он не выздоровеет. Используйте либо электрический свет или тепло колодки для при 37 ° С Избегайте перегрева; периферическая вазодилатация компромиссы восстановление животных. не Монитор мыши тесно до полного выздоровления.

6. Интегрированный Эндоскопическая система оценки колоректального здравоохранения с десятичной идентификаторов

1. Используйте голевой форму (рис. 2) и определения параметров ниже (эндоскопической оценки мышиной колоректального Воспаление и опухолей с помощью десятичной-взвешенный система подсчета очков: определения параметров и протокол) дляпримеры и дополнительный "Дистальная-Проксимальный Эндоскопическая колит забив система '(Д-УИК) в качестве руководства для nonbiased оценки и детального учета.
2. Оценка четыре параметры колоректального воспаления, описанные на скоринг системы виде (рис. 2). Тщательно оценить перианальной области, кишечные прозрачность, тип кишечное кровотечение (если есть), а наличие и количество очаговых поражений (эрозивно, язвенный, и / или опухолевой).
3. При оценке опухолей в исследовательских целях, изучить количество, расположение и размер, и описать их с помощью толстой карту и гистограмму на форме выигрыше. Численное сумму баллов, полученных и число поражений (когда применимо) будет определять фона толстой воспаление, наиболее преобладающим типом поражения, и количество поражений.

Representative Results

Протокол и изображения представлены в данном исследовании были подготовлены с Olympus СПС-V гибким эндоскопом ¹⁴ и НБР ^11,15. Видео изображения были сохранены в формате MPEG-2 и фотографии в формате JPG, TIF, PNG, или в формате DICOM с максимальными 1280 х 1024 пикселей, передаваемых со стандартными USB флэш портативных воспоминаний. НБР усиливает визуальный контраст гемоглобина-содержащих тканей. Нормальный свет и изображения НБР являются основными характеристиками, иллюстрирующих нормальную анатомию толстой слизистой и различия между нормальным и ненормальным васкуляризации во язв и развития опухоли (рис. 3А и 6А). Изображения с метиленовым синим, как контрастного вещества во время хромоэндоскопии показать свои преимущества для крупным планом фотографии, раскрывая воздушную нормальную сотовую появление крипт ободочной кишки (см. закрыть в рис. 3б).

На сегодняшний день, мы провели более 500 мышиных эндоскопии FOLLOкрыло этот протокол, при этом около 10%, представляющей повторную экспертизу. Как правило, процедура требует 10-15 минут, чтобы закончить, делится поровну между администрацией анестезии, эндоскопии, и выхода из наркоза. Исследование охватывает от ануса до селезеночного изгиба дистальной ободочной кишке. Мы также успешно провели посмертных эндоскопические обследования проксимальном отделе толстой кишки, слепой кишки и подвздошной кишки в некоторых случаях, после патологоанатомическом вскрытии ткани непосредственно перед заготовки тканей для гистологического (фиг.6В). В одном случае, мы также наблюдали и подтвердил, подозреваемого желудка расширение в мыши пострадавших с тяжелой двенадцатиперстной стриктуры и столкновение из-за кишечных спаек. Аномальный изображение наблюдалось transmurally от самого черепа аспекте мягко воспаленной дистального отдела толстой кишки; посмертное исследование показало растянутый желудок противопоставляется толстой кишки.

Мы разработали достоверных и надежных десятичные-взвешенный секотбор керна системы для улучшения стандартизированный применение мышиного эндоскопии через опубликованных научных исследований. Три скоринговые системы были ранее заняты и служил в качестве основы для развития нашей десятичной, взвешенных системы ^4-6. Хотя эти системы позволяют категоризации различных критериев и степени тяжести повреждения, они не имеют надлежащих определения критериев, некоторые из которых являются трудно оценить из эндоскопических изображений. В некоторых случаях, неоднозначные параметры, включенные в системы скоринга имеют сомнительную отношение к эндоскопического обследования у мышей. Краткое изложение одиннадцать опубликованных параметров ^4-6 и их эндоскопических преимуществ, ограничений и физиологическое значение, представлены в таблице 1.

Поскольку предлагаемый мышиный ободочную эндоскопия забил будет использоваться для исследовательских целей, его полезность для выполнения статистический вывод имеет важное значение. Чтобы гарантировать, что система подсчета очков былавысокая конструкция действия, мы впервые разработала концептуальную основу для определения соответствующих параметров, сгруппированных эти параметры к меньшему количеству критериев (N = 3), и оценили их колинеарности и корреляцию с фактическим наличием воспаления и заживления (рис. 7). Затем мы добавили перианальных результаты, используя дискретные целые представлять порядковые степени тяжести, и интегрированы концепции индукции опухоли и развития, используя десятичные идентификаторы. Кроме того, мы добавили "стриктуры" в качестве еще одного параметра не ранее считались / сообщили в мышиной кишечной эндоскопии. Полученные в результате оценки выходных производить высокую надежность и пригодны для параметрического статистического анализа. Наконец, мы добавили отображение и численные возможности построения графиков для детального мониторинга заболевания.

Для оценки сходящийся обоснованность нашей системе оценки, баллы, полученные из трех опубликованных параметров для 36 колоноскопии мыши сравнивались с оценками obtaiнед и тот же человек слепо используя три предыдущих скоринговые системы ^4-6. Каждый Сравнение показало хорошую положительную корреляцию с указанием высокой конвергентных действия для нашей интегрированной системы скоринга (Пирсон р <0,0001; рис. 8). Анализ поддерживает включение перианальных выводов в рамках клинических критериев для оценки колоректального здоровья, как это было обычно присутствует в случаях тяжелого колита и улучшенной дисперсии данных (P = 0,0351 между счетом 0 и 1, P = 0,0086 между счетом 2 и 3, 8В). Когда интегрированная система подсчета очков (после добавления перианальных выводы) был по сравнению с другими имеющимися системами, было очевидно, что 2 из 3 других систем играют важную выведенный ограничение из-за кластеризации случаев к одному из четырех возможных целых категорий, одной из основных указание метода ошибочной классификации предвзятости (рис. 8C) ^16. С десятичных идентификаторов, наша система роман забил самый низкий вероятность кластесеяния точек данных в целых категорий.

Рисунок 1. Инструменты. Гибких эндоскопов, система управления видео, источник света, видеомагнитофон, и ингаляционного наркоза машина используется в данном исследовании. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2. Десятичной форме система подсчета очков для оценки колит и толстого кишечника у мышей. Система имеет основной воспалительный компонент из четырех не-ко-линейных параметров, графики для тUmor информация, и десятичные единицы в заметных повреждений или осложнений. См. подробные критерии и примеры в разделе ниже (эндоскопической оценки мышиной колоректального Воспаление и опухолей с помощью десятичной-взвешенный система подсчета очков). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3. Парные образы нормальной слизистой в нормальном режиме эндоскопическая света, режиме NBI, и с хромоэндоскопии. Разветвление кровеносных сосудов, как правило, реже в прямой кишке. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

FO: содержание-шир = "5 дюймов" FO: Пребывание "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4highres.jpg" Первоначально "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4.jpg" ширина = "500px" />
Рисунок 4. Поперечного сечения представление кишечных петель, чтобы проиллюстрировать принцип эндоскопической прозрачности стенки кишечника у мышей. Эндоскопическая визуализация росписи кишечных сосудов и брыжейки жира, и что из сосудов брыжейки и жира из соседнего здорового внутренних органов, можно через стенку Здоровой толстой кишки. Воспаление и утолщение кишечной стенки в брюшной разделах дистального отдела толстой кишки препятствует визуализации очной и трансмуральных структур из других внутренних органов, даже если другие кишечные сегменты здоровы. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

3/50843fig5highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50843/50843fig5.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок 5. Поиск и устранение неисправностей. Решение плохой видимости, вызванной кишечной содержания, смазанных изображений и перистальтических движений. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 6. Парные изображения (обычный свет против узкополосного визуализации, NBI) из больного колоректальным слизистой оболочки и других проксимальных кишечных сегментов. НБР помогает выявить язвенный и опухолевых поражений. Некоторые язвы появляются коричневатые с НБР, другие, покрытые фибринозным материала появляются толстые и белый. Опухоли ОСО / DSS являются лучше охарактеризовать с НБР, особенно на ранних стадиях, когда они невыступающий в полость. Звездочки (*) выделить эндоскопическое артефакт (слизистой гофрирования) в толстой кишке, наполненной PBS, не наблюдается и во всех других изображений, где двоеточие растянут воздухе. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 7. Теоретическая корреляции и со-линейность между тяжестью воспаления кишечника и способность к визуально различить и надежности различных опубликованных критериев толстой воспаления (см. таблицу 1). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 8. Сравнение производительности между нашей системы скоринга и ранее опубликованных скоринговых систем. Данных из парных слепых анализа 36 мыши видео эндоскопии.) Сравнение системой А (5 параметров) к воспалительных параметров, за исключением перианальных поражений (3 параметра). Б) Важность в том числе перианальных выводы в балльной системе;. перианальной экспертиза последовательно обеспечивали дополнительное статистически значимой информации в случаях умеренной / тяжелой колит у мышей С) Выполнение системы счета, после включая перианальной выводы по сравнению с ранее описанной системы (36 мышь видео эндоскопии были забиты с каждым методом). Обратите внимание, что системы В и С имеют серьезные ограничения в связи с кластеризации случаев в одном из своих четырех категорий, ведущих к misclassificatионный смещения (Системы В и С кластерные случаи в неэквивалентных категорий). Добавляя десятичные идентификаторы, мы также снизили шансы кластеризации в целых категорий, позволяя при этом отслеживание теперь значимых баллах. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Таблица 1. Клинические параметры, публикуемые в эндоскопических критериев для оценки кишечное воспаление у мышей. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Эндоскопическая Assessmeнт мышиной колоректального Воспаление и опухолей с помощью десятичной-взвешенный система подсчета очков: Определения параметров и протокол

Наша интегрированная система подсчета очков эндоскопическая колоректального здоровья состоит из трех основных компонентов: 1) оценка степени и тяжести колоректального воспаления, с четырьмя параметрами и 12 возможных численных классов; 2) Регистрация местоположения, размера и количества опухолевых поражений и 3 ) десятичные блоки с назначенных типов первичных или преобладающих поражений и эндоскопических осложнений выделите выводы особое значение для исследователя, здесь называют "десятичных идентификаторов". Расположение и размер опухолей записаны на виртуальной толстой карте, и количество опухолей в каждой процентах от выступа (обструкции) в просвет записывается на графике. Эти две диаграммы предоставить информацию опухоли, которые могут быть интегрированы в трех измерениях. Десятичные единицы для поражения категорий в диапазоне от 0.0-0.9. Если питBER поражений для определенной категории является соответствующим, второй и третий знаков после запятой может быть использован для указания количества поражений. Например, если наблюдаются три поражения, добавив 0,003 позволит исследователь знать, что было три поражения, если есть 12 поражений, то 0,012 будет использоваться. Эта система слежения имеет особое благо, если повторные эндоскопические исследования, как ожидается. Подробные определения критериев воспаления и тяжести марок приведены ниже.

А. Оценка колоректального infammation с четырех клинических параметров - определение эндоскопических критериев

1. Перианальные выводы: Оценка этого аспекта перед началом область видимости, чтобы избежать путаницы с пост-эндоскопии кровотечения. Здоровье перианальной области является прокси для состояния здоровья толстой кишки, кожи, и отношение животного в целом, и включен в качестве части эндоскопического обследования, потому что некоторые поражения не может и сhould не внимательно изучить невооруженным глазом. Упражнение меры биобезопасности при необходимости. Обратите внимание, что здоровые привычки по уходу за шерстью по мышей может удалить крови / сбросов, но не будет удалять повреждения кожи от перианальной области. Начисление очков:

0. Нормальный. Нет крови, диарея, трещины, свищи или разряд не наблюдаются.
1. Глыбы фекалиями или диарея наблюдается.
2. Сгустков / сгустки кровянистые выделения, сыпучих кале (диарея), гноя или незначительных язв наблюдается.
3. Грануляционная ткань или поражения, наблюдаемые, которые включают большую часть окружающей кожи и указывают, что животное отмечены раздражение или воспаление в перианальной области; выпадения прямой кишки.

2. Прозрачность толстой кишки: Определяется как способности визуализировать кровеносные сосуды или заочных органы через стенки кишки в качестве толстой кишки-эндоскопа осторожно переехал. Обратите внимание, что прямая кишка, естественно, менее прозрачны из-за мышечных слоевг, потому что это в полости малого таза, где меньше контраст существует. Это является одним из физиологически наиболее полных параметров, как это отражает общую воспалительного состояния или здоровья мышиного толстой кишки. Обратите внимание, что можно есть невоспаленной двоеточие с слизистых эрозий / язв в ранних стадиях инфекции или токсического воздействия на эпителий. Помните, что физиологическая изотонический раствор следует использовать для промывки при эндоскопии, а гипотонических растворов, таких как вода, вызывают изменения с отбеливания и сокращения слизистой у мышей, если использование в течение длительного времени (см. звездочки на рисунке 6).

0. Нормальный. Крупные и мелкие кровеносные сосуды толстой кишки и окружающие внутренние органы хорошо видны. Перемещение эндоскоп немного (туда и обратно, часы / против часовой стрелки). Белый брыжеечной жира или темно содержание других внутренних органов можно наблюдать.
1. Малые суда частично невидимым, но крупные сосуды могут видеть.
2. Малый VesseLs невидимы и крупных сосудов не ясны. Слизистая оболочка не появляется загустеет.
3. Видимое утолщение стенки кишечника и / или отек слизистой оболочки / обобщенной. Кровеносные сосуды не видны. Мало растянут / варикозное расширение сосудов могут быть видны в некоторых случаях.

3. Слизистой кровотечение: Дифференцировать контакт кровотечение из спонтанного кровотечения. Обычные стандартные эндоскопические процедуры в здоровых мышей не должно вызвать кровотечение. Если есть воспаление, увеличение венозность слизистой и тканей хрупкость может привести к эрозии слизистой оболочки и кровотечения. Там нет необходимости, чтобы намеренно очистить двоеточие, чтобы оценить этот параметр.

0. Нормальный, без кровотечения.
1. Общий контакт кровотечение. Это травматическое кровотечение определяется как контактного кровотечения; следует судить только после снятия эндоскоп.
2. Не применимо. Намеренно не назначен, чтобы заставить экзаменатора решить Натурэ кровотечения.
3. Спонтанные кровотечения, определяется как нетравматического и природной кровоизлияния, которое наблюдается как эндоскоп входит толстой кишки. Иногда, воздух вдувания вызывает спонтанное кровотечение во время тяжелого колита.

4. Очаговых поражений: Для размещения пятнистый, непредсказуемый характер колоректального заболеваний, это интегрированная система скоринга позволяет градация на наличие очаговых поражений (в основном язвенный характер) по тяжести воспаления. С толстой кишки является короткий, прямой сегмент трубчатый у мышей, было сочтено ненужным описать расположение поражений. Вместо этого, число поражений записаны и добавлены в общий счет использования системы знаков идентификаторов. Однако, если акцент на месте поражений необходимо, у нас есть вариант под названием "Дистальная-Проксимальный Эндоскопическая колит система оценки '(Д-УИК), описанный ниже в разделе F. усовершенствована приложения могут бытьНа основании наших десятичной системе скоринга. Поскольку опухоли редко существовать, не вызывая некоторую форму воспаления в толстой области у мышей, мы включили опухоли в разделе десятичные идентификаторы однозначно позволить изучение опухолей в контексте здоровья кишечника (см. ниже).

0. Нормальный, без очаговых поражений.
1. Четко определенные области маленький плоский фасад, охваченные нормальной слизистой наблюдается. Это для решения местных отечные участки или потенциальные области клеточной инфильтрации / распространению, а найти в легкой колита.
2. Покраснел или наблюдается эрозивно области.
3. Язвы или стриктуры. Язвы идентифицируются покраснение и деформации (неровные края с признаками аномальной васкуляризации) в связи с отечной или фиброзной заживления раны. НБР эндоскопия полезно дифференцировать обнаружения или наблюдение язв. Резкая критика признаются областях аномально узких, круглых или нерегулярных и статических в форме, которые не сжаться или расшириться, как эксpected. Часто стриктуры привлекать области аномальных слизистой склепов, или ворсинок в подвздошной кишке. В случае гибких эндоскопов (наружный диаметр = 3,3 мм) неспособность осторожным, чтобы перейти в область более проксимальных участках толстой кишки последовательно связаны с патологическими стриктур проверенных вскрытие.

В. Опухолевые диаграммы для местонахождения записи, размера и числа

1. Виртуальный ободочной карта: Эта карта является виртуальным перспективе изображение дистального отдела толстой кишки и прямой кишки, который сделан путем разрезания верхней части полости (0 °) и прокатки его. Верхняя и нижняя части графика назначены проксимально толстой кишки (изгиб), а анус, соответственно. Центральная линия (180 °) указывает на дно полости (вентральной животного), а правая и левая половинки полукругов указывают на правый и левый стенкой просвета. Карта может быть использован, чтобы описать местоположение и горизонтальный размер опухолей, а такжекак язвы.

2. Номера Опухолевые для каждой степени оккупации опухоли: Хотя толстой карту предоставляет только двумерную информацию, степень, в которой опухоли растут в просвет кишечника является важной особенностью опухолей, так как выступ может вызвать кишечные стеноз или препятствие. Для захвата эту информацию, мы добавили записи график для процентов выступа в просвет, что документы количество опухолей в каждом процентном диапазоне, что позволяет трехмерный перспективу для оценки степени толстой опухолей.

С. Десятичные идентификаторы, чтобы сделать численные оценки смысла и ускоренные соответствующие случаи

Наша система подсчета очков использует новый десятичную систему идентификатор записать наличие соответствующих поражений или осложнений. Эти идентификаторы в описательных целях и предназначены для облегчения толкования балльная оценка и ускоренную случаев эндоскопического интерес. Тем не менее, они также служат для численного веса преобладающие виды поражений, и позволяют поколение наборов данных, поддающихся параметрической статистики. При использовании развитой формой забил, отметьте поражения по мере необходимости, а также выбрать один идентификатор десятичной которые будут добавлены к воспалительной счет.

0. Никаких специальных выводы.
1. Перианальные свищ, или чрезмерное перианальной воспаление, выпадение прямой кишки.
2. В первую очередь эрозионные поражения с незначительным участием стены.
3. В основном язвенные поражения, некоторые покрыты фибрина, кровотечение или большой с неправильной формы из-за связывающей малых язв (количество язв могут быть записаны как 0,301 для одного опухоли, 0,302 в течение двух опухолей, 0,311 для одиннадцати опухолей и т.д..).
4. Кишечные стриктуры (опционально потому стриктуры является серьезным воспалительным осложнением при колитах, прибавьте 2 балла к общей воспалительной счетом).
5. Четко определенные доска (толщиной / непрозрачной ткани в стенке кишечника; например & #160; плоский опухоли низкой высота). Количество бляшек могут быть записаны, как описано для поражений (т.е. 0,401, 0,402, 0,411 ..., и т.д..). Они могут появиться в виде плоской, не расширяемой поверхности, что может показаться, чтобы выступать до 5-10%, который модифицирует окружной появление просвета кишечника.
6. Выступающие массу или опухолевую поражения. Количество массы могут быть записаны, как описано для поражений (т.е. 0,601, 0,602, 0,611 ..., и т.д..). Они четко выпуклые, но может появиться плоский выступающий но> 15% вспученного окружности просвета кишечника.
7. Индуцированные слезоточивый / перфорации при эндоскопии.
8. Смерть животного во время проведения эндоскопии.
9. Другое: _____________ (например, сильная проксимального эндоскопическая колит, см. Дистальный-Проксимальный Эндоскопическая колит система подсчета очков ниже).

D. Примеры и приложения

Мышиный система эндоскопии забил представлены в этой статье, сpecifically предназначен для интеграции сбор и анализ данных о толстой воспаления и толстого кишечника. В отношении опухолей, данные могут быть проанализированы с помощью нескольких статистических подходов, в том числе площадь под кривой, медиана, мода, или анализа главных компонент. На индивидуальном уровне, система подсчета очков может помочь исследователям контролировать толстой здоровье в одном мыши с течением времени. После подведения воспалительные subscores и добавления надлежащего идентификатор десятичную для типа и количества поражений в соответствующих случаях, общий балл позволит исследователям численно количественной оценки степени толстой воспаления, преобладающему типу поражения, и количество поражений. Например, оценка 12,609 указывает, что эта мышь имеет сильную колоректального воспаление и девять выступающую опухолевых масс; здоровый мыши с нормальным перианальной области и колоректального слизистой оболочки, который был перфорирован во время эндоскопического исследования будет иметь общий балл 0,7. Десятичная система идентификатор будетпозволит исследователям в каталог и легко найти большие хранилища данных из забитых мышей. Например, исследователь может установить критерии поиска, чтобы выявить все баллы, которые заканчиваются на "0,6" и получить все случаи, которые имеют выступающие опухоли. Больше примеров проиллюстрированы в дополнительных рисунках S1-S3.

Е. Дистальный-проксимального эндоскопическая колит система подсчета очков (D-УИК)

Это необязательный модификация нашей десятичной системы идентификатор выигрыше дифференцировать случаи с тяжелым / обширного проксимального колита. Потому что эндоскопические признаки колита и колоректального опухолей у мышей, кажется, развивать последовательно в дистальных сегментах толстой кишки мы рекомендуем:

• Чтобы забить двоеточие в соответствии с критериями, описанными, обращая особое внимание на дистальных двух третей толстой кишки и игнорировать проксимального сегмента, если он, по-видимому здоровым. Это позволяет избежать путаницы и увеличивает дискриминационного силу эндоскопии в дифференциальныхtiate животные с разной степенью обширной колита.
• Если воспалительные или опухолевые изменения наблюдаются в проксимальной трети, мы рекомендуем, чтобы добавить одно очко в общем зачете (1.0) и назначить десятичную идентификатор как '0 0,9 - прочее ", который можно было бы назвать тяжелой проксимального эндоскопической колита. Участок выводы в карте сетки и гистограммы.
• Монитор животных, которые имеют эндоскопические отклонения в проксимальной трети толстой кишки. Обратите особое внимание посмертно, как болезнь может быть необычно тяжелой или может выходить за пределы селезеночного изгиба в направлении ближнего толстой кишки.
• Если последовали этой рекомендации, записать этот подход в разделе 'наблюдений' вида оценки, и следовать этой тенденции через экспериментов. Просьба привести в окончательной публикации, что оценка была проведена после нашего "дистальной-проксимального эндоскопической колит выигрыше системы 'или D-УИК, которая колеблется от 0-13.9. Обратите внимание, что эта модификация не имеет S tatistical эффект на нашу систему скоринга, если используется в животных без обширного / тяжелой проксимального колита.

Дополнительные показатели.

Рисунок S1. Пример эндоскопической оценки мышь с толстого кишечника. Животных обрабатывали с ОСО и DSS предварительного эндоскопии.) Представитель изображение в нормальном и NBI режиме, соответственно. Б) форма Заброшенные заполнены эндоскопических находок. Обратите внимание, что, хотя есть два соответствующие выводы, исследователь решил назначить десятичную идентификатор 0,6 на основе клинической тяжести и научно-исследовательских целей. Разнообразие параметрического статистического анализа может проводиться с данными, записанными в «Карта опухолей / язв» и «Record опухолевых выступы" хит-парадов. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок s2. Пример мыши с толстой стриктуры и эндоскопической осложнения. Примечание сужение просвета кишечника и, что nonperforating, слизистой слеза была вызвана во время проведения эндоскопии, расположенной по периферии стриктуры сайте. Сужение и ослабление воспаленной толстой кишки может привести к слизистой слез. Животное было под общим наркозом. Обратите внимание, что система подсчета очков позволило нам контролировать и уменьшить процессуальные осложнений. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

43/FigureS3.jpg "ширина =" 500px "/>
Рисунок S3. Пример временного хода воспаления и эндоскопической скоринга в DSS обращению мыши. Обратите внимание, что цифры могут быть очевидными и указывают, что толстой воспаление прогрессировала (от 1-5 и 8), и что эрозии, разработанные 8-й день (в десятичной системе 0.2 ) и язвы по 11-й день (в десятичной системе 0.3). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Discussion

Есть несколько соображений относительно модификации и поиска неисправностей в эндоскопической техники у мышей. Критические аспекты процедуры, которые должны быть освоены в ходе использования гибкой эндоскопии включают регулировку объема воздуха, необходимого для предотвращения вздутие живота и нарушение дыхания мыши, и незначительные технические аспекты управления представления с координации управления ангуляцию и крутящего момента . Управление моментом важно свести к минимуму риск перфорации кишечника. При правильном обращении, мышиный гибкой эндоскопии становится очень безопасный, быстрый процедура, которая позволяет прямой визуализации и биопсии выборки кишечных областях научных интересов.

Для решения вид препятствия из-за фекалий (рис. 5), важно понимать, что фекальные шарики, как правило, наблюдается даже после голодания или использование слабительных. Если они присутствуют, кал может быть легко перемещены проксимально с нежными модулей воздушныхufflation. В 11% случаев необходимо также использовать 1 мл PBS клизмы. До проведения клизму, проявлять осторожность при рассмотрении животных, которые, кажется, чтобы иметь вздутие живота или, что беременны. Для перистальтических движений важно подождите несколько секунд, пока перистальтический волна не проходит, так как вдувания воздуха не останавливается перистальтику.

На сегодняшний день большинство эндоскопические системы оценки, используемые для оценки мышиный кишечного заболевания являются специфическими для любого колита или рака. Учитывая, что эти два условия часто происходят одновременно и могут взаимодействовать друг с другом, стандартизированной системы подсчета очков, которая учитывает как воспаление и формирование опухоли в значительной степени облегчит кросс-дисциплину связь, тем самым повышается удобство работы информацию, полученную во время желудочно-кишечного исследованию исследователей рака, и наоборот. Поскольку опухоли редко существуют, не вызывая некоторую форму воспалительного изменения в колоректального регионе ян мышей, мы включили опухоли в разделе десятичные идентификаторы нашей системы счета, чтобы однозначно дать изучение опухолей в контексте здоровья кишечника. Для повышения достоверности и надежности системы скоринга и облегчения ее использования в долгосрочных экспериментов или клинических испытаний, мы также разработали стандартизированную форму отчетов для использования вместе с скоринга системы (рис. 2), который систематически хранятся элементы данных, необходимые для рассчитать мышиных кишечные баллы воспаление, основанные на точных определений для каждого критерия классификации.

В предыдущем наличие нескольких мышиных эндоскопия скоринговых систем ограниченного действия препятствует интерпретацию результатов различных исследований. Чтобы свести к минимуму путаницу сталкиваются лабораторного персонала в принятии решений, которые опубликованный метод использовать, мы рекомендуем выполнять эндоскопическую оценку с использованием критериев, которые могут быть выведены из двумерных изображений (например, избежать критерии тхат относятся к текстуре и консистенции - кала;. отметить, что некоторые мыши в том числе свободных от бактерий может иметь мягкие стулья), и которые не являются со-линейная (т.е., которые физиологически и во времени обусловлено той же воспалительного контексте) Потому что кардинальные знаки воспаления являются последовательное из-за хронологическим воспалительных явлений, мы рекомендуем следующие критерии: 1) кишечный прозрачности, впервые описанный Беккер и др. ^4, как отражение толщиной стенки; 2) кровотечение, как индикатор слизистых оболочек и целостности кровеносных сосудов. ; 3) перианальной данные, в качестве индикатора толстой целостности и раздражение кожи или предрасположенности к чрезмерному воспаление и 4) очаговых поражений, в классе тяжести воспалительных поражений (которые прежде всего у мышей язвенный). На сегодняшний день мы не видели опухолевых поражений в типичных моделях 3% DSS-индуцированной мышиной колита. Мышиный эндоскопическая система подсчета очков описано в этой статье предусматривает впервые, насколько нам известноколичественный механизм для оценки присутствия и индукцию опухолевых поражений в контексте толстой воспаления.

Впервые, мы также подчеркнуть важность включить стриктуры в качестве параметра во время мышиного эндоскопии, так как они, кажется, обычно присутствуют в некоторых моделях животных воспаления кишечника, например SAMP / Yit / Fc. Резкая критика представляют (полу) окружные области подслизистом хронического воспаления, с потерей кишечной упругости в связи с увеличением фиброза, который трудно оценить эндоскопически для новичка. Мы заметили, в эндоскопически, определенных стриктуры, пострадавших от мышей, что есть еще воспаление в сегменты, которые проксимальнее стриктуры по сравнению с дистальных сегментов (которые могут быть рассмотрены эндоскопически), вероятно, из-за замедленного кишечного транзита. Для исследовательских целей, желательно следить за животных гистологическое в конце экспериментов, чтобы лучше охарактеризовать воспалительногоmatory ответы, которые фланге кандидатов стриктуры регионы.

Без надлежащей подготовки и обратной связи экспертов, любая система подсчета очков может иметь изменчивость в любой момент времени. Важно подчеркнуть, что эндоскопические процедуры обучения, проводимые на мышах должно контролироваться опытным ветеринарии медицинских работников для обеспечения: I) надлежащее обучение других ученых и техников, и б) для того, чтобы животные не диагностируется или непреднамеренно ранен во время процедура. Обратитесь к ветеринару, ответственного за ваше животных научно-исследовательский центр для консультации экспертов, прежде чем приступить к реализации этой процедуры для обеспечения наилучших возможных методов и условий содержания животных. Желательно, чтобы регулярно отслеживать эффективность подготовленных эндоскопистов. Используйте изображения мы представили здесь в качестве руководящих принципов, в случайном порядке, в котором животные оцениваются, и оценить каждое животное слепым. Периодически Проконсультируйтесь определения параметров и критериев протокола и кEep их под рукой во время эндоскопии и забил разделе 6).

Таким образом, как команда медицинских и ветеринарных гастроэнтерологов, мы представляем стандартизированный протокол и полуколичественный систему подсчета очков для эндоскопической оценки мышиных моделях колита и опухолей. Эти инструменты исследования позволит исследователям проводить рутинные мышиных эндоскопию, и позволит научных кадров на всех уровнях опыта, чтобы создать воспроизводимые и сопоставимые меры воспаления кишечника и образования опухоли через лабораторий и между дисциплинами. Мы разработали систему для получения значимых численные результаты с высокой действия, и при условии, возможности для быстрого отслеживания конкретных результатов, которые могут быть настраиваемый для внутреннего использования в рамках отдельных лабораторий. Мы также описываем дискриминационную забил альтернативу, которая принимает во внимание различия в региональном восприимчивости к болезням в толстой кишке (см. раздел E, ̵6; Дистальный-проксимального эндоскопическая система колит скоринга, аббревиатура D-УИК). Форма отчета данных и некоторые иллюстрации могут быть использованы в качестве стеновых плакатов, чтобы помочь неопытным ученых (рис. 1, 3, 5, 6). Успешная реализация мышиного эндоскопии зависит от ознакомления с нормальной анатомии кожи и слизистых оболочек перехода в анус, прямой кишки, толстой кишки и окружающих внутренних органов, как счет анатомические различия для тонких эндоскопических различий ^17.

Хотя в настоящее время даже самые маленькие, самые гибкие, и лучшие технологии эндоскопические не может достичь проксимального двоеточия в естественных условиях, быстро движущихся технологических достижений в области капсулы и одного эндоскопии волокна могут стать доступными для мышей в ближайшем будущем. Стандартизированный протокол и эндоскопическая система подсчета очков в данной работе представляют ценных инструментов для визуализации и оценки состояния мышиного кишечника среды в живых животных. Эти инструменты будут FaciliТейт сопоставимость результатов между работах и ​​в других отраслях, и будет иметь применимость на новые и возникающие мышиных технологий эндоскопических.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System