La coloscopie flexible chez la souris pour évaluer la sévérité de la colite et de tumeurs colorectales l'aide d'un système validé endoscopique de notation

Summary

Au cours des dernières années, de nouveaux endoscopes génération ont émergé comme aides à la recherche de diagnostic importants pour évaluer la colite murine et les tumeurs colorectales. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'évaluation endoscopique de tumeurs colorectales et inflammation chez des souris, ainsi que d'un système de pointage roman qui utilise des identificateurs décimaux pour documenter la sévérité de la colite endoscopique et tumeurs colorectales.

Abstract

L'utilisation de l'endoscopie moderne à des fins de recherche a grandement facilité notre compréhension des pathologies gastro-intestinales. En particulier, l'endoscopie expérimental a été très utile pour des études qui nécessitent des évaluations répétées sur un seul animal de laboratoire, tels que ceux évaluer les mécanismes de la maladie intestinale inflammatoire chronique et la progression du cancer colorectal. Cependant, les méthodes utilisées dans les études sont très variables. Au moins trois systèmes de notation endoscopiques ont été publiées pour la colite murine et publié protocoles pour l'évaluation des tumeurs colorectales ne parviennent pas à répondre à la présence d'une inflammation du côlon concomitante. Cette étude développe et valide un système de notation endoscopique reproductible qui intègre en même temps une évaluation de l'inflammation et des tumeurs. Ce nouveau système de notation comporte trois grands volets: 1) l'évaluation de l'étendue et de la gravité de l'inflammation du côlon (basé sur les résultats périanales, la transparence de l'wall, des saignements des muqueuses et des lésions focales), 2) l'enregistrement quantitative des lésions tumorales (de la carte de la grille et graphique à barres), et 3) tri numérique de cas cliniques par leur pertinence pathologique et de la recherche en fonction des unités décimales avec les catégories affectées de lésions observées et complications endoscopiques (identifiants décimales). La vidéo et le manuscrit présenté ici ont été préparés suivant des protocoles IACUC approuvés, pour permettre aux enquêteurs de marquer leurs propres souris expérimentales en utilisant une méthode endoscopique bien validé et hautement reproductible, avec l'option de système de différencier distale de la colite endoscopique proximale (D-PECS ).

Introduction

Endoscopie murin a été réalisée comme un outil de recherche utile pour plus d'une décennie ^1-3. À ce jour, la plupart des études utilisant l'endoscopie murin ont utilisé les endoscopes rigides, même si certains ont également utilisé la sigmoïdoscopie flexible. Endoscopie murin fournit des résultats immédiats et une estimation plus objective de la mesure de la normalité intestinale, la sévérité de l'inflammation, et la progression de la tumeur par rapport à des mesures indirectes, comme la perte de poids, diarrhée, et l'histologie (qui n'est pas optimale lorsque les lésions sont inégaux), tandis que offrant un aperçu sur l'état de santé général du côlon. Plus particulièrement, l'endoscopie permet d'évaluer répétée de modèles d'animaux de laboratoire au fil du temps, par opposition à l'examen histologique traditionnelle qui exige que l'animal soit euthanasié et colons à être récoltées pour l'analyse ^1. Malgré ces avantages, l'utilisation de la technologie endoscopique murin n'a pas été répandu et est limitée par le manque de protocoles normalisés pour implementatisur et la notation des résultats pathologiques. Correctement mis en œuvre, l'endoscopie murin est très prometteuse pour faciliter notre compréhension et la caractérisation de modèles animaux de plusieurs états de maladies gastro-intestinales chroniques, notamment les maladies inflammatoires de l'intestin, colite, et les tumeurs colorectales.

L'utilité de la technologie endoscopique murin repose sur sa reproductibilité et l'objectivité, ce qui nécessite l'existence de procédures d'examen normalisés et un système de notation cohérente, non redondante et fiable pour les pathologies intestinales. Au moins trois systèmes de notation pour l'évaluation endoscopique descriptives de la colite ^4-6, ainsi que pour les tumeurs du colon chez les souris ^4,7,8 ont été publiées. Cependant, ces approches déclarés et les systèmes de notation ne sont pas facilement comparables entre les études. Dans de nombreux cas, il n'existe pas de définition claire des critères utilisés pour la classification des lésions, et lorsque les critères sont donnés, ils sont très variables. De plus,il n'existe aucun système de notation signalés qui intègrent l'évaluation à la fois la colite et les tumeurs, deux pathologies coliques les plus courants qui peuvent se produire simultanément et avoir des effets interactifs sur le résultat, dans un outil de mesure unique. Enfin, les systèmes de notation endoscopiques qui n'existent pour la colite ont souvent catégories inflammatoires de la discrimination limitée (c.-à-. D'options étroites de notation sur des échelles entières courtes, souvent 1-4) pour représenter correctement la maladie scénarios de progression et permettre l'utilisation de l'analyse statistique paramétrique.

Dans ce document, nous décrivons l'utilisation d'un endoscope flexible pour évaluer la sévérité de la colite murine et les tumeurs du côlon et de décrire un protocole standardisé pour l'emploi de cette technologie dans l'évaluation anatomique de la région péri-anale, du rectum et du côlon distal. Nous illustrons dépannage efficace pendant l'endoscopie pour minimiser les traumatismes et les artefacts d'image, et nous décrivons un système de notation reproductiblebasée sur des paramètres cliniques publiées validés. Le système de notation intègre l'évaluation de l'inflammation intestinale et les tumeurs en utilisant un niveau élevé de discrimination avec 12 niveaux possibles de la cartographie de l'inflammation, tumeur et des options de tracé, et un nouveau système de l'unité décimale (c'est à dire, les identificateurs décimaux) pour mettre en évidence les résultats avec une valeur diagnostique spécifique ( le développement de tumeurs à savoir, les complications au cours de l'endoscopie, etc.) L'utilisation d'identificateurs décimaux permet un suivi rapide des ensembles de données pertinents pour une analyse ultérieure en aval. Enfin, nous effectuons essais de fiabilité et de validité du système de notation dans plusieurs modèles murins de colite et cancer de la colite associée (sulfate de dextran sodium (DSS) induite par la colite, infection à Clostridium difficile, et azoxyméthane / induite par DSS-cancer du côlon).

Protocol

Une. Mise en place du système d'endoscopie

1. Mettre en place le système d'endoscopie avant d'anesthésier les souris, en suivant les instructions du fabricant. Utilisez une urétéroscope vidéo conçu pour les humains de ce protocole (Figure 1). Le diamètre externe du tube d'insertion est de 9,9 Fr (3,3 mm), son extrémité distale est de 8,5 Fr (2,8 mm), et le diamètre intérieur du canal d'instrumentation est 6 Fr (1,2 mm).
2. Bien que l'utilisation d'endoscopes n'ont pas été liée à la transmission de la maladie [9], stériliser l'endoscope et de la lentille avec 70% d'éthanol ou ¹⁰ par des techniques appropriées lorsque l'on travaille avec des micro-organismes formant des spores. Préparer lubrifiant bactériostatique et non-grattage essuyer tissus pour saturer le bout de l'endoscope.
3. Attacher une seringue de 3 ml remplie d'air (ou d'un mélange de gaz approprié de CO ₂₎ à la partie supérieure du canal d'instrumentation.
4. Tournez sur la puissance, et mettre en place la balance des blancs dans la lumière blanche normale,ainsi que le mode étroit imagerie de bande (NBI), le cas échéant. Depuis 2001, le PNB a procuré des avantages de l'imagerie diagnostique comme il met l'accent sur ​​les structures fines des vaisseaux sanguins sur les muqueuses, y compris les lésions ulcéreuses et tumorales, qui ont une vascularisation anormale caractéristique ^11. Mode NBI-filtre limite la longueur d'onde de la lumière capturée à 390-445 nm et 530-550 nm, qui met en évidence les structures avec l'hémoglobine.
5. Imprimer le formulaire d'évaluation de notation (figure 2) pour enregistrer vos résultats. Se familiariser avec les images normales et attendues de l'IBN (figure 3A) et la définition et les qualités de chaque critère avant l'examen (voir la section 6.1).
6. Préparer une solution à base de colorant sur le tampon phosphate salin (PBS) pour chromoendo, si on le souhaite. En chromoendoscopie, l'examen est effectué en utilisant un colorant comme agent de contraste pour mettre en évidence les modifications de la muqueuse. Utilisez le bleu de méthylène (0,1-1%) et de l'indigo carmin (0,1%) solutions (figure 3B). Remarqueque le bleu de méthylène est un agent d'oxydo-réduction qui peut produire des radicaux oxydants, la reticulation indirect de résidus d'acides aminés, et la dégradation de l'ADN ^12, ce qui pourrait interférer avec l'analyse de l'échantillon.

2. Anesthésie générale de la souris

1. Choisissez l'agent et la voie d'administration anesthésique. Consulter un vétérinaire à partir d'un centre de ressources animales de soins et d'utilisation des animaux institutionnel Comité (IACUC) concernant les interférences potentielles des médicaments avec le système immunitaire et les objectifs de recherche. Certains médicaments peuvent influencer le profil de l'expression des cytokines chez les animaux, y compris les rongeurs ^13. Utilisez tribromoéthanol injectable pour les procédures de terminal ou l'isoflurane pour les endoscopies de survie, avec des contrôles appropriés.
2. Pour l'induction, administrer 4-5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un taux de 0,2-0,5 L / min; utiliser 0,5-2% pour l'entretien. Ce protocole n'est pas approprié pour tous les animaux. Consultez votre établissement vétérinairepour les instructions et la formation nécessaires. Respecter les recommandations pertinentes du IACUC pour atteindre les plus hautes normes de bien-être animal. Assurez-vous que la souris si totalement anesthésiée.
3. «Strap» La souris anesthésiée à une table de surface de support dans une dorsale ou ventrale en utilisant du ruban adhésif de laboratoire. Méfiez-vous de l'orientation anatomique sur l'écran de votre endoscope. Fixer ses membres inférieurs et la queue. Une bande de bande peut également être placé sur la poitrine pour empêcher le mouvement loin de l'appareil respiratoire, mais éviter de restreindre les mouvements ventilatoires thoraciques.

3. Examen détaillé endoscopique

1. Rechercher des lésions péri-anales avant d'insérer l'endoscope dans le rectum, puis avancez le champ par l'anus.
2. Manteau de l'endoscope avec un lubrifiant chirurgical stérile. Veillez à ne pas recouvrir la surface de la CCD (dispositif à couplage de charge) capteur.
3. Insérez l'endoscope et commencer l'enregistrement. Les vidéos enregistrées sont utiles pour mévaluation eticulous de l'endoscopie si nécessaire après l'examen. Essayez d'effectuer la endoscopie dans la longueur moins de temps possible pour minimiser l'irritation intestinale / muqueuse.
4. Appliquer de l'air à l'aide d'une seringue à mettre lentement en dehors de la paroi intestinale. Selon la taille de la souris, en utilisant 1 à 2 ml d'air. Évitez excessive insufflation d'air, il peut causer de la détresse respiratoire et la mort de la souris anesthésiée.
5. Faire progresser l'endoscope avant que vous ne videz pas la façon avec de l'air ou une légère rotation de la portée. Ne pas avancer l'endoscope si vous ne voyez pas la lumière intestinale. Perforations ou rectales / côlon larmes peuvent se produire à ce stade, en particulier chez les jeunes souris (<8-10 semaines). Prenez des photos si nécessaire.
6. Comme la portée avance, évaluer s'il ya saignements spontanés (définie comme l'état naturel des muqueuses hémorragie pas associée à l'endoscopie traumatique). Saignements spontanés peut être observé comme l'endoscope entre le rectum et le côlon.
7. CommeSess la transparence de la paroi colique. La transparence est définie comme étant la capacité de visualiser les vaisseaux sanguins intra-muros dans le colon et que d'autres viscères environnants (figure 4). Mouvement doux de la portée (arrière-avant, droite, à gauche) vous aidera à déterminer si les vaisseaux sanguins peuvent être vus dans le contexte d'autres viscères. Tissu adipeux mésentérique peut également être considérée. Notez que si le rectum à l'intérieur de la cavité pelvienne apparaît moins transparente que la paroi du côlon dans la cavité abdominale.
8. Inspecter pour déterminer le type et le nombre de lésions focales (zones oedémateux, des érosions, des ulcères, des masses tumorales). Ce sera enregistrée sous forme de notation à l'aide du score d'inflammation du côlon et les identificateurs décimaux qui ont été développés.
9. Une fois la zone où le colon fléchit caudale dans le côlon proximal est atteinte, retirer l'endoscope lentement et rechercher la présence de saignements de contact (qui se produit en raison de la friabilité des muqueuses après laendoscope est avancé ou retiré). Il n'est pas nécessaire de gratter la surface du colon intentionnellement. Muqueuse colorectale saine ne saigne pas après examen endoscopique approprié.

4. Biopsie

1. Lorsque biopsies sont nécessaires, insérer la pince à biopsie à travers le canal de l'endoscope dédiée pour l'instrumentation. Surveillance de l'avancement de la pince sur l'écran de l'endoscope pour éviter une perforation intestinale.
2. Ouvrez les coupes de biopsie de la pince à environ un angle de 60-80 ° tasse à café, et les diriger vers la zone d'intérêt. Une pince ou d'une pression excessive ouverts peuvent comprendre des couches supplémentaires de tissu intestinal, ce qui se traduit par une perforation induite par biopsie des parois intestinales transparentes sains. Si la perforation se produit, euthanasier l'animal pendant l'anesthésie suivant vos recommandations IACUC. Les perforations se traduisent par une endotoxémie et d'une péritonite.
3. Fermez les coupes de biopsie, et de les sortir tout en gardant les pinces fermées.
4. Remove de l'échantillon à partir de la pince en rinçant le tissu avec une solution qui est doux pour le tissu et la pince. ARN tard et PBS sont des solutions de travail communes, si nécessaire, utiliser l'aiguille pour déloger l'échantillon. Éviter d'éroder les tasses de pince ou arêtes de coupe.

5. Récupération de l'anesthésie

1. À l'issue de l'examen, un environnement chaud à la souris jusqu'à ce qu'il récupère. Utilisez soit une lampe électrique, ou un tampon chaud réglé à 37 ° C. Éviter la surchauffe; vasodilatation périphérique compromet récupération d'animaux. Surveillance de la souris près jusqu'à guérison complète.

6. Scoring System endoscopique intégré de santé colorectal avec décimales identificateurs

1. Utilisez le formulaire de notation (figure 2) et les définitions de paramètres ci-dessous (évaluation endoscopique de murins colorectal inflammation et les tumeurs en utilisant un système décimal pondéré de notation: Définitions des paramètres, et le Protocole) pourexemples et la «distal-proximal endoscopique colite système de notation» en option (D-PECS) que des lignes directrices pour l'évaluation non biaisée et la tenue de registres détaillés.
2. Note les quatre paramètres de l'inflammation colorectal décrits sur le formulaire de système de notation (figure 2). Évaluer soigneusement la région péri-anale, la transparence intestinale, le type de saignement intestinal (le cas échéant), et la présence et la quantité de lésions focales (érosive, hémorragique et / ou tumorale).
3. Lors de l'évaluation des tumeurs à des fins de recherche, d'examiner la quantité, l'emplacement et la taille, et les décrire à l'aide de la carte du côlon et graphique à barres sur le formulaire de notation. La somme numérique des scores obtenus et le nombre de lésions (le cas échéant) afin de déterminer l'arrière-plan inflammation du côlon, du type de lésion le plus prédominant, et le nombre de lésions.

Representative Results

Le protocole et les images présentées dans cette étude ont été préparés avec un endoscope souple Olympus URF-V ¹⁴ et PNB ^11,15. Les images vidéo ont été enregistrés dans le format MPEG-2 et des images au format JPG, TIF, PNG, ou format DICOM avec un maximum de 1280 x 1024 pixels, transférables à des mémoires portables USB flash standard. Le PNB augmente le contraste visuel des tissus contenant de l'hémoglobine. Lumière normale et imagerie PNB sont des éléments clés pour illustrer l'anatomie normale de la muqueuse colorectale et les différences entre la vascularisation normale et anormale au cours de l'ulcération et le développement de la tumeur (figures 3A et 6A). Images avec du bleu de méthylène comme agent de contraste au cours de la chromoendoscopie montrent ses avantages pour les photos en gros plan, révélant l'aspect aérienne normale en nid d'abeille des cryptes du côlon (voir gros plan sur la figure 3B).

À ce jour, nous avons réalisé plus de 500 endoscopies murins Folloaile ce protocole, avec environ 10% représentant des examens répétés. En règle générale, la procédure nécessite 10-15 minutes à compléter, réparti de manière égale entre l'administration de l'anesthésie, de l'endoscopie et la récupération de l'anesthésie. L'examen porte sur de l'anus à l'angle splénique du côlon distal. Nous avons également effectué avec succès les examens post-mortem d'endoscopie du côlon proximal, le caecum et l'iléon, dans certains cas, après dissection des tissus post-mortem immédiatement avant les prélèvements de tissus pour l'histologie (figure 6B). Dans un cas, nous avons également observé et confirmé la dilatation gastrique suspecté chez une souris atteinte de sténose duodénale sévère et impaction due à des adhérences intestinales. L'image anormal n'a été observé transmurale de l'aspect le plus crânienne d'un côlon distal légèrement enflammée; autopsie a montré l'estomac distendu a été juxtaposée à la virgule.

Nous avons développé un valides et fiables pondéré décimaux-ssystème de carottage pour améliorer l'application standardisée de l'endoscopie murin dans les études de recherche publiés. Trois systèmes de notation ont déjà été employée et a servi de base pour le développement de notre système pondéré décimal ^4-6. Bien que ces systèmes permettent le classement des divers critères et les niveaux de la gravité des lésions, ils manquent de définitions de critères appropriés, dont certains sont difficiles à évaluer à partir des images endoscopiques. Dans certains cas, les paramètres ambigus inclus dans les systèmes de notation ont une pertinence douteuse d'un examen endoscopique chez la souris. Un résumé de onze paramètres publiés ^4-6 et leurs avantages endoscopiques, les limites et pertinence physiologique sont présentés dans le tableau 1.

Parce que le système de notation proposé endoscopie colique murin sera utilisé à des fins de recherche, son utilité pour effectuer l'inférence statistique est indispensable. Afin d'assurer que le système de notation étaitgrande validité de construit, nous avons élaboré un cadre conceptuel pour identifier les paramètres pertinents, regroupé ces paramètres à moins de critères (n = 3), et évalué leur colinéarité et corrélation avec la présence réelle de l'inflammation et de la guérison (figure 7). Ensuite, nous avons ajouté les résultats périanales utilisant des entiers distincts pour représenter les niveaux ordinaux de gravité, et intégré le concept de l'induction et le développement tumoral en utilisant des identificateurs décimaux. En outre, nous avons ajouté 'sténoses' un autre paramètre en tant que pas considéré auparavant / rapporté en endoscopie intestinal murin. Les scores de sortie résultant produisent une grande validité et sont adaptés à l'analyse statistique paramétrique. Enfin, nous avons ajouté la cartographie et les capacités de traçage numériques pour la surveillance de la maladie détaillée.

Pour évaluer la validité convergente de notre système d'évaluation, les résultats obtenus à partir de trois paramètres publiés pour 36 coloscopies de souris ont été comparés aux scores obtenie par la même personne utilisant aveuglément trois systèmes de notation précédentes ^4-6. Chaque comparaison a montré une bonne corrélation positive, indiquant une forte validité convergente de notre système intégré de notation (Pearson p <0,0001; Figure 8). L'analyse soutient l'inclusion des résultats périanales dans le cadre des critères cliniques pour évaluer la santé du côlon, comme il était communément présents dans les cas de colite sévère et une meilleure dispersion des données (P = 0,0351 entre le score de 0 à 1, P = 0,0086 entre le score 2 et 3, Figure 8B). Lorsque le système de notation intégré (après ajout des résultats périanales) a été comparé aux autres systèmes disponibles, il était évident que 2 des 3 autres systèmes ont une limitation d'inférence majeur en raison de la concentration de cas à l'une des quatre catégories entières possibles, une grande indication de la méthode des erreurs de classification (figure 8C) ^16. Avec identificateurs décimaux, notre nouveau système de notation a la plus faible probabilité de clusTering points de données dans des catégories entières.

Figure 1. Instruments. D'endoscope flexible, système de contrôle vidéo, source de lumière, enregistreur vidéo, et l'inhalation appareils d'anesthésie utilisée dans cette étude. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2. Forme de système de notation décimal pour l'évaluation de la colite et colorectal tumeurs chez la souris. Le système a une composante inflammatoire noyau de quatre paramètres non co-linéaires, des graphiques pour tumor informations et unités décimales à des lésions ou complications notables. Voir critères détaillés et des exemples dans la section ci-dessous (évaluation endoscopique de murins colorectal inflammation et tumeurs en utilisant un système de notation décimale pondérée). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3. Images paires de muqueuse normale en mode normal de lumière endoscopique, le mode PNB, et avec chromoendoscopie. Arborisation des vaisseaux sanguins est normalement moins commun dans le rectum. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 4. Représentation en coupe d'anses intestinales à illustrer le principe de transparence endoscopique de la paroi intestinale chez la souris. Visualisation endoscopique des vaisseaux intestinaux murales et de la graisse mésentérique, et que des vaisseaux mésentériques et de la graisse de viscères sains adjacents, est possible à travers la paroi d'un côlon sain. L'inflammation et l'épaississement de la paroi intestinale dans les sections péritonéale du côlon distal empêche la visualisation des structures intra-muros et de transmurales autres viscères, même si d'autres segments intestinaux sont en bonne santé. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure 5. Dépannage. Résoudre faible visibilité causée par le contenu intestinal, des images floues et les mouvements péristaltiques. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 6. Images appariées (lumière régulière contre d'imagerie à bande étroite, NBI) de la muqueuse du côlon malade et d'autres segments intestinaux proximaux. NBI permet d'identifier ulcéreuse et lésions tumorales. Certains ulcères apparaissent brunâtre avec un PNB; autres, couverts de matière fibrineuse semblent épais et blanc. Tumeurs AOM / DSS sont mieux caractérisé avec un PNB, en particulier au cours des premières étapes quand ils ne sont pasfaisant saillie dans la lumière. Les astérisques (*) soulignent artefact endoscopique (d'ondulation muqueuse) dans le côlon rempli de PBS, pas observée dans toutes les autres images où côlon est distendu par l'air. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 7. Corrélation théorique et co-linéarité entre la sévérité de l'inflammation intestinale et la capacité de différents critères publiés visuellement discerner et qualité de l'inflammation du côlon (voir le tableau 1). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 8. Comparaison des performances entre notre système de notation et des systèmes de notation publiées précédemment. Données à partir d'analyses aveugles paires de 36 vidéo endoscopies de souris. A) Comparaison du Système A (5 paramètres) pour les paramètres inflammatoires, à l'exception des lésions péri-anales (3 paramètres). B) importance d'inclure les résultats périanales dans le système de notation;. examen périanale toujours fourni un complément d'information statistiquement significative des cas de colite modérée / sévère chez la souris C) Performance du système de notation après y compris les conclusions périanales par rapport aux systèmes précédemment rapportés (36 vidéo de la souris endoscopies ont été marqués à chaque méthode). Notez que les systèmes B et C ont une limitation majeure en raison de la concentration de cas dans un de leurs quatre principales catégories de misclassificatbiais d'ions (systèmes B et C des grappes de cas dans les catégories non équivalents). En ajoutant décimales identifiants, nous avons également abaissé la chance de regroupement dans des catégories entières, tout en permettant le suivi des scores numériques maintenant significatifs. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Tableau 1. Paramètres cliniques publiés comme critères endoscopiques pour évaluer l'inflammation intestinale chez la souris. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Endoscopique ANALYSESnt de murin colorectal inflammation et tumeurs en utilisant un système de notation décimale pondérée: Définitions et paramètres Protocole

Notre système de notation endoscopique intégré pour la santé colorectal comporte trois grands volets: 1) l'évaluation de l'étendue et de la gravité de l'inflammation du côlon, avec quatre paramètres et 12 notes numériques possibles; 2) l'enregistrement de l'emplacement, la taille et le nombre de lésions tumorales et 3 unités décimales) avec des types affectés de lésions primaires ou prédominants et les complications endoscopiques pour mettre en évidence les résultats d'une importance particulière pour le chercheur, ci-après dénommées "décimales identificateurs". L'emplacement et la taille des tumeurs sont enregistrées sur une carte virtuelle du côlon, et le nombre de tumeurs dans chaque pourcentage de saillie (obstruction) dans la lumière sont enregistrées sur un graphique. Ces deux tableaux fournissent des informations de la tumeur qui peut être intégré dans les trois dimensions. Les unités décimales pour les catégories de lésions vont de 0,0 à 0,9. Si le nombrenombre de lésions pour une catégorie particulière est décimales pertinentes, deuxième et troisième peuvent être utilisés pour indiquer le nombre de lésions. Par exemple, si trois lésions sont observées, en ajoutant 0,003 permettrait au chercheur de savoir qu'il y avait trois lésions; s'il ya 12 lésions, puis 0,012 seraient utilisés. Ce système de suivi est particulièrement bénéfique si les examens endoscopiques répétées sont prévus. Les définitions détaillées des critères de l'inflammation et des grades de gravité sont donnés ci-dessous.

A. Évaluation infammation colorectal avec quatre paramètres cliniques - définition de critères endoscopiques

Une. Conclusions périanales: Évaluer cet aspect avant de commencer portée pour éviter toute confusion avec des saignements post-endoscopie. Santé de la région péri-anale est un indicateur de l'état de santé du côlon, de la peau, et l'attitude de l'animal en général, et est inclus dans le cadre de l'examen endoscopique parce que certaines lésions ne peuvent pas et should pas être examinés de près à l'œil nu. Appliquer des mesures de biosécurité, le cas échéant. Notez que les habitudes de toilettage en bonne santé par les souris peuvent retirer sang / rejets, mais ne fera pas disparaître les lésions de la peau de la région péri-anale. Pointage:

0. Normal. Pas de sang, diarrhée, fissures, fistules ou décharge observés.
1. Amas de matière fécale ou de la diarrhée observés.
2. Caillots / bouquets de décharge sanglante, des selles molles (diarrhée), de pus, ou des ulcérations mineures observées.
3. Le tissu de granulation ou de lésions observées qui impliquent plus de la peau environnante et indiquant que l'animal a marqué une irritation ou une inflammation dans la région péri-anale; prolapsus rectal.

2. Transparence du côlon: Défini comme la possibilité de visualiser les vaisseaux sanguins ou des organes extra-muros à travers la paroi du côlon que le colon-endoscope est légèrement déplacé. Notez que le rectum est naturellement moins transparent en raison des couches musculaires uned parce que c'est dans la cavité pelvienne où existe moins de contraste. C'est l'un des paramètres physiologiquement plus complets car il reflète l'état inflammatoire global ou la santé du côlon murin. Notez qu'il est possible d'avoir un colon non enflammé avec la muqueuse érosions / ulcères dans les premiers stades de l'infection ou des effets toxiques sur l'épithélium. Attention cette solution isotonique physiologique doit être utilisée pour le rinçage pendant l'endoscopie, que des solutions hypotoniques, tels que l'eau, provoque des changements avec le blanchiment et la contraction de la muqueuse chez la souris si l'utilisation pendant des périodes prolongées (Voir astérisques sur la figure 6).

0. Normal. Grands et petits vaisseaux sanguins du côlon et les viscères environnants sont clairement visibles. Déplacez l'endoscope légèrement (d'avant en arrière, horloge / gauche). Blanc graisse mésentérique ou le contenu sombre d'autres viscères peuvent également être observés.
1. Les petits bateaux sont partiellement invisible, mais les grands navires sont visibles.
2. Petit vessels sont invisibles et les gros vaisseaux ne sont pas claires. La muqueuse ne pas apparaître épaissie.
3. Épaississement apparent de la paroi intestinale et / ou œdème de la muqueuse / généralisée. Les vaisseaux sanguins ne sont pas visibles. Peu de navires distendu / varices peuvent être visibles dans certains cas.

3. Saignements des muqueuses: Différencier le contact des saignements de saignements spontanés. Procédures endoscopiques standards courants dans les souris saines ne doivent pas induire des saignements. S'il ya inflammation, la vascularisation de la muqueuse et de la fragilité accrue des tissus peuvent mener à l'érosion de la muqueuse et des saignements. Il n'est pas nécessaire de gratter intentionnellement le côlon pour évaluer ce paramètre.

0. Normal, pas de saignement.
1. Saignements de contact commun. Ce saignement traumatique est défini comme saignements de contact, il doit être jugé uniquement après le retrait de l'endoscope.
2. Non applicable. Intentionnellement pas affecté à forcer l'examinateur de décider de la nature de saignement.
3. Saignement spontané, définie comme une hémorragie non-traumatique et d'origine naturelle qui est observée comme l'endoscope entre dans le côlon. Parfois, l'insufflation d'air induit des saignements spontanés pendant la colite sévère.

4. Lésions focales: Pour répondre à la nature imprévisible inégale des maladies colorectales, ce système de notation intégré permet le classement de la présence de lésions focales (surtout hémorragique dans la nature) par la sévérité de l'inflammation. Depuis le côlon est un segment tubulaire court, droit chez la souris, il a été jugé nécessaire de décrire la localisation des lésions. Au lieu de cela, le nombre de lésions sont enregistrés et ajouté au score total à l'aide du système d'identificateurs décimaux. Toutefois, si l'accent sur la localisation des lésions est nécessaire, nous avons une option appelée «distal-proximal endoscopique colite système de notation» (D-PECS) décrit ci-dessous dans la section F. applications complémentaires peuvent être simplifiéesprovenant de notre système de notation décimale. Parce que les tumeurs sont rares, sans induire une certaine forme de l'inflammation dans la région colorectal chez la souris, nous avons inclus des tumeurs dans la section décimales identificateurs pour permettre uniquement l'étude des tumeurs dans le contexte de la santé intestinale (voir ci-dessous).

0. Normal, pas de lésions focales.
1. Des zones bien définies de petite élévation plat couverts par la muqueuse normale observées. C'est pour aborder des domaines oedémateux locaux ou des zones potentielles d'infiltration / prolifération cellulaire, que l'on trouve dans la colite légère.
2. Rougies ou zones érosives observées.
3. Ulcération ou restrictions. Ulcères sont identifiés par des rougeurs et des déformations (bords irréguliers avec des preuves de la vascularisation anormale) en raison de oedémateux ou fibrotique la réparation des plaies. NBI endoscopie est utile de distinguer la détection ou d'observation des ulcérations. Les sténoses sont reconnues comme zones anormalement étroites, circulaires ou irrégulières et statiques en forme, qui ne contractent ou se dilatent comme expected. Souvent restrictions concernent les domaines de cryptes anormales, ou villosités de l'iléon. Dans le cas des endoscopes flexibles (diamètre extérieur = 3,3 mm) l'incapacité prudent de faire avancer la portée dans des zones plus proximaux du côlon a toujours été associé à des rétrécissements anormaux vérifiées post-mortem.

B. graphiques tumorales pour l'emplacement d'enregistrement, la taille et le nombre

Une. Carte du côlon virtuelle: Cette carte est une image virtuelle de point de vue de la partie distale du côlon et du rectum qui est fait en coupant le haut de la lumière (0 °) et le déployer. Le haut et le bas du tableau sont affectés proximale du colon (flexion), et de l'anus, respectivement. La ligne médiane (180 °) indique le fond de la lumière (d'aspect ventral de l'animal), et des moitiés droite et gauche des demi-cercles indiquent la paroi de gauche à droite et de la lumière. La carte peut être utilisée pour décrire la position et la taille horizontale de tumeurs, ainsicomme des ulcérations.

2. nombre de tumeurs pour chaque degré d'occupation de la tumeur: Bien que la carte du côlon fournit uniquement des informations en deux dimensions, la mesure dans laquelle les tumeurs se développent dans la lumière intestinale est une caractéristique importante de tumeurs, depuis saillie peut causer une sténose intestinale ou obstruction. Pour capter cette information, nous avons ajouté un graphique d'enregistrement pour cent pour saillie dans la lumière qui documente le nombre de tumeurs dans chaque plage de pourcentage, ce qui permet une perspective en trois dimensions pour évaluer l'étendue de tumeurs du côlon.

Identificateurs C. décimales à faire des scores numériques significative et accélérées cas pertinents

Notre système de pointage utilise un nouveau système d'identificateur décimal pour enregistrer la présence de lésions ou de complications pertinents. Ces identifiants sont à des fins descriptives et visent à faciliter l'interprétation d'une partition et accélérées numériques cas d'intérêt endoscopique. Cependant, ils servent aussi à numériquement poids principaux types de lésions, et de permettre la génération d'ensembles pouvant faire l'objet de statistiques paramétriques de données. Lorsque vous utilisez le formulaire de notation mis au point, marquer les lésions, le cas échéant, et choisir un identifiant de décimales à ajouter au score inflammatoire.

0. Pas de conclusions particulières.
1. Fistule péri-anale, ou inflammation périanale excessive, un prolapsus rectal.
2. Lésions érosives principalement avec la participation de la paroi mineur.
3. Lésions ulcéreuses la plupart du temps, certains recouverts de fibrine, des saignements ou grande, avec des formes irrégulières en raison de la coalescence de petits ulcères (le nombre d'ulcères peut être enregistré comme 0,301 pour une tumeur, 0,302 pour deux tumeurs, 0,311 pour onze tumeurs, etc.).
4. Sténose intestinale (facultatif car sténose est une complication inflammatoire sévère dans la colite, ajouter 2 points au score inflammatoire total).
5. Plaque bien définie (tissu épais / non transparent dans la paroi intestinale, par exemple & #160; une tumeur de faible hauteur à plat). Le nombre de plaques peut être enregistré comme décrit pour les lésions (c.-à-0.401, 0.402, 0.411 ..., etc.). Ils peuvent apparaître comme une surface extensible non plat qui peut paraître à émerger jusqu'à environ 5-10%, ce qui modifie l'apparence circonférentielle de la lumière intestinale.
6. Saillie de masse ou une lésion tumorale. Le nombre de masses peut être enregistré comme décrit pour les lésions (c.-à-0.601, 0.602, 0.611 ..., etc.). Ils sont clairement renflement, mais peuvent apparaître à plat mais faisant saillie> 15% de la circonférence distendue de la lumière intestinale.
7. Induite par la déchirure / perforation pendant l'endoscopie.
8. Mort de l'animal pendant l'endoscopie.
9. Autres: _____________ (par exemple, la colite grave endoscopique proximale, voir distal-proximal endoscopique colite système de notation ci-dessous).

D. Exemples et applications

Le système de notation endoscopie murin présentée dans cet article est depecifically conçu pour intégrer la collecte et l'analyse des données sur l'inflammation du côlon et les tumeurs colorectales. En ce qui concerne les tumeurs, les données peuvent être analysées en utilisant des approches statistiques multiples, l'aire sous la courbe, la médiane, le mode, ou analyse en composantes principales, y compris. Au niveau individuel, le système de notation peut aider les chercheurs à surveiller la santé du côlon en un seul clic avec le temps. Après avoir résumé les sous-scores inflammatoires et en ajoutant l'identificateur décimal pour le type et le nombre de lésions cas échéant, le score total permettra aux chercheurs de quantifier numériquement le degré d'inflammation du côlon, le type prédominant de la lésion, et le nombre de lésions. Par exemple, un score de 12,609 indique que cette souris a une inflammation grave colorectal et neuf saillie masses tumorales; une souris saine avec une région péri-anale normale et muqueuse colorectale qui a été perforé lors de l'endoscopie aurait un score total de 0,7. Le système d'identification décimalpermettent aux chercheurs de catalogue et de rechercher facilement les grands dépôts de données de souris marqués. Par exemple, un chercheur pourrait établir des critères de recherche pour identifier toutes les partitions qui se terminent par "0,6" et retrouvez tous les cas qui ont des tumeurs saillantes. D'autres exemples sont illustrés dans les figures complémentaires S1-S3.

E. distal-proximal système de notation de la colite endoscopique (D-PECS)

Il s'agit d'une modification facultative de notre système de notation décimale identificateur pour différencier les cas de grave colite étendue / proximale. Parce que les signes endoscopiques de colite et les tumeurs colorectales chez la souris semblent se développer de manière cohérente dans les segments distaux du côlon, nous vous recommandons:

• Pour marquer le côlon suivant les critères décrits, en accordant une attention particulière aux deux tiers distaux du côlon et ignorer le segment proximal si elle est apparemment en bonne santé. Cela évite la confusion et augmente la puissance discriminatoire de l'endoscopie à différenanimaux cier avec divers degrés de colite étendue.
• Si des modifications inflammatoires ou tumorales sont observées dans le tiers proximal, nous vous recommandons d'ajouter un point à la note totale (1.0) et assigner l'identifiant en décimal '0 .9 - Autres », qui pourrait être étiqueté comme grave colite endoscopique proximale. Tracer les résultats dans la grille de la carte et de graphique à barres.
• Surveillance des animaux qui présentent des anomalies endoscopiques dans le tiers proximal du côlon. Payez post-mortem de l'attention particulière, car la maladie peut être particulièrement grave ou peut s'étendre au-delà l'angle splénique vers le côlon proximal.
• Si cette recommandation est suivie, enregistrer cette approche dans la section des observations »du formulaire d'évaluation, et de suivre cette tendance à travers des expériences. S'il vous plaît citer dans votre publication finale que l'évaluation a été menée à la suite de notre «système distale proximale endoscopique colite notation» ou D-PECS, qui varie de 0 à 13,9. Notez que cette modification n'a pas de STATISTIQUES effet sur notre système de notation si utilisé chez les animaux sans colite étendue / grave proximale.

Les chiffres supplémentaires.

Figure s1. Exemple d'évaluation endoscopique d'une souris avec les tumeurs colorectales. Les animaux ont été traités avec l'OMA et DSS endoscopie avant. A) Représentant l'image en mode normal et le PNB, respectivement. B) sous forme de notation rempli avec les résultats endoscopiques. Notez que bien qu'il y ait deux conclusions pertinentes, le chercheur a choisi d'assigner l'identifiant en décimal 0,6 sur la base de la gravité clinique et les objectifs de recherche. Une variété de l'analyse statistique paramétrique peut être réalisée avec les données enregistrées dans le «Plan de tumeurs / ulcères» et le «Registre des saillies tumorales Classements. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure s2. Exemple d'une souris avec un rétrécissement du côlon et d'une complication endoscopique. Notez le rétrécissement de la lumière intestinale et qu'un nonperforating, la déchirure de la muqueuse a été induite pendant l'endoscopie juste en aval de l'emplacement de la sténose. Rétrécissement et affaiblissement du côlon peut entraîner une inflammation de la muqueuse en larmes. L'animal était sous anesthésie générale. Notez que le système de notation nous a permis de surveiller et de réduire les complications procédurales. Cliquez ici pour agrandir l'image .

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Figure s3. Exemple d'évolution dans le temps de l'inflammation et de la notation endoscopique dans une souris DSS-traitée. Notez que les numéros peuvent être auto-explicatif et indiquent que l'inflammation du côlon progressé (de 1-5 et 8), et que les érosions développées par jour 8 (décimal 0,2 ulcères) et par jour 11 (décimal 0,3). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Il ya plusieurs considérations concernant la modification et la réparation de la technique endoscopique chez la souris. Aspects critiques de la procédure qui doivent être maîtrisées lors de l'utilisation de l'endoscopie souple comprennent l'ajustement du volume d'air nécessaire pour éviter une distension abdominale et de troubles respiratoires de la souris, et les aspects techniques mineures de vue contrôle de la coordination des contrôles d'angulation et de couple . Le contrôle de couple est important de réduire au minimum le risque de perforation intestinale. Lorsque manipulé correctement, l'endoscopie souple murin devient, une procédure rapide très sûr qui permet la visualisation directe et des biopsies de zones intestinales d'intérêt de la recherche.

Pour résoudre vue obstructions dues à la matière fécale (Figure 5), il est important de comprendre que les pelotes fécales sont habituellement observées même après le jeûne ou l'utilisation de laxatifs. Lorsqu'ils sont présents, les selles peuvent être facilement déplacés proximale par ins d'air douxufflation. Dans environ 11% des cas, il est nécessaire d'utiliser également 1 ml de PBS lavement. Avant d'effectuer le lavement, faire preuve de prudence lors de l'examen des animaux qui semblent avoir une distension abdominale ou qui sont enceintes. Pour les mouvements péristaltiques, il est important d'attendre quelques secondes jusqu'à ce que l'onde péristaltique passe depuis insufflation d'air ne s'arrête pas le péristaltisme.

À ce jour, la plupart des systèmes d'évaluation endoscopiques utilisés pour évaluer la maladie intestinale murine sont spécifiques soit pour la colite ou le cancer. Étant donné que ces deux conditions se produisent souvent de façon concomitante et peuvent interagir les uns avec les autres, un système de notation normalisé qui tient compte à la fois l'inflammation et la formation de tumeurs faciliterait grandement la communication inter-discipline, ce qui améliore la facilité d'utilisation de l'information acquise au cours de la recherche gastro-intestinale par des chercheurs de cancer, et vice versa. Parce que les tumeurs sont rares, sans induire une certaine forme d'altération inflammatoire dans la région colorectal in souris, nous avons inclus des tumeurs, dans la partie décimale des identificateurs de notre système de score unique pour permettre l'étude des tumeurs dans le contexte de la santé intestinale. Pour améliorer la validité et la fiabilité du système de notation et de faciliter son utilisation dans des expériences à long terme ou d'essais cliniques, nous avons également développé un formulaire de rapport standardisé à utiliser avec le système de notation (figure 2), qui stocke systématiquement les éléments de données nécessaires pour calculer murins d'inflammation intestinale scores, sur la base de définitions précises pour chacun des critères de classification.

La disponibilité précédente de multiples systèmes murins endoscopie de notation de validité limitée empêche l'interprétation des résultats des différentes études. Afin de minimiser la confusion vécue par le personnel de laboratoire pour décider qui a publié la méthode à utiliser, nous recommandons d'effectuer un examen endoscopique en utilisant des critères qui peuvent être déduites à partir d'images bidimensionnelles (par exemple éviter les critères that se référer à la texture ou la consistance - de matières fécales;. noter que certaines souris, y compris sans germes peuvent avoir des selles molles), et qui ne sont pas co-linéaire (c'est à dire qui sont physiologiquement et temporellement entraîné par le même contexte inflammatoire) Parce que les signes cardinaux de l'inflammation sommes séquentielle due à chronologique des événements inflammatoires, nous vous recommandons les critères suivants: 1) la transparence intestinale, d'abord décrit par Becker et al ^4, comme un reflet de l'épaisseur du mur, 2) des saignements, comme un indicateur de la muqueuse et de l'intégrité des vaisseaux sanguins. ; 3) les résultats périanales, comme un indicateur de l'intégrité du côlon et de l'irritation ou de la prédisposition à la peau une inflammation excessive, et 4) des lésions focales, au grade de la gravité des lésions inflammatoires (qui sont chez les souris principalement ulcéreuse). À ce jour, nous n'avons pas vu lésions tumorales dans les modèles typiques de 3% induite par DSS-murin de colite. Le système de score endoscopique murin décrit dans le présent document fournit pour la première fois, à notre connaissance,un mécanisme d'évaluation quantitative de la présence et de l'induction de lésions tumorales dans le cadre de l'inflammation du côlon.

Pour la première fois, nous soulignons également l'importance d'inclure des sténoses comme un paramètre lors de l'endoscopie murin, car ils semblent être souvent présent dans certains modèles animaux d'inflammation intestinale, par exemple SAMP / Yit / Fc. Les sténoses représentent (semi-) zones périphériques de la sous-muqueuse inflammation chronique, avec une perte d'élasticité intestinale due à l'augmentation de la fibrose, qui sont difficiles à évaluer par voie endoscopique pour le novice. Nous avons remarqué chez les souris de sténose touchés par endoscopie définies, qu'il ya plus de l'inflammation dans les segments qui sont à proximité de la sténose par rapport aux segments distaux (qui peuvent être examinés par endoscopie), probablement en raison d'un ralentissement du transit intestinal. Pour des fins de recherche, il est conseillé de suivre les animaux en histologie à la fin des expériences afin de mieux caractériser l'inflammationréponses matoires qui flanquent les régions de sténose candidats.

Sans une formation adéquate et des commentaires d'experts, un système de notation peut avoir la variabilité à un moment donné. Il est important de souligner que les procédures de formation endoscopiques menées sur des souris doivent être surveillés par un vétérinaire qualifié de professionnel de la santé pour assurer: i) une formation adéquate d'autres scientifiques ou techniciens, et ii) de veiller à ce que les animaux ne sont pas diagnostiqués à tort ou blessés par inadvertance au cours de la procédure. Consulter le vétérinaire en charge de votre centre de recherche sur les animaux pour des conseils d'experts avant de procéder à la mise en œuvre de cette procédure pour s'assurer que les meilleures pratiques possibles et bien-être animal. Il est recommandé de surveiller régulièrement la performance des endoscopistes formés. Utilisez les images que nous avons présentés ici comme des lignes directrices, tirer au hasard l'ordre dans lequel les animaux sont évalués, et d'évaluer tous les animaux en aveugle. Consultez les définitions des paramètres et des critères du protocole périodiquement et kEEP sous la main lors de l'endoscopie et de la notation Section 6).

En résumé, une équipe de gastro-entérologues médicaux et vétérinaires, nous présentons un protocole normalisé et système de notation semi-quantitative pour l'évaluation endoscopique de modèles murins de colite et les tumeurs. Ces outils de recherche permettront aux chercheurs d'effectuer des endoscopies murins de routine, et vont permettre au personnel de recherche à tous les niveaux d'expérience pour générer des mesures reproductibles et comparables de l'inflammation intestinale et la formation de tumeurs dans les laboratoires et entre les disciplines. Nous avons développé le système pour produire des scores numériques significatives avec une haute validité, et a fourni des capacités pour le suivi rapide des résultats particuliers, qui peuvent être personnalisable pour une utilisation interne au sein de différents laboratoires. Nous décrivons également une alternative de cotation discriminatoire qui tienne compte des différences de sensibilité régionale à la maladie dans le côlon (voir la section E, ̵6; distal-proximal système de notation colite endoscopique, acronyme D-PECS). Le formulaire de rapport des données et des chiffres peuvent être utilisés comme affiches pour aider les scientifiques inexpérimentés (figures 1, 3, 5, 6). Mise en œuvre réussie de l'endoscopie murin dépend de se familiariser avec l'anatomie normale de la jonction cutanéo-muqueuse de l'anus, du rectum, du côlon, et viscères environnants, que les différences anatomiques expliquent les différences subtiles endoscopiques ^17.

Bien que à l'heure actuelle, même les plus petits, les plus flexibles et les plus fins technologies endoscopiques ne peuvent pas atteindre le côlon proximal in vivo, en mouvement rapide des progrès technologiques dans le domaine de la capsule et unique endoscopie à fibres pourraient devenir disponibles pour les souris dans un proche avenir. Le protocole normalisé et le système de notation endoscopique présentées dans ce document constituent des outils précieux pour la visualisation et l'évaluation de l'état de l'environnement intestinal murin d'animaux vivants. Ces outils seront facilitercomparabilité des résultats entre tate papiers et dans toutes les disciplines, et sera applicable à technologies nouvelles et émergentes endoscopiques murins.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System