A colonoscopia flexível em camundongos para avaliar a gravidade da colite e colorretal Tumores Usando um sistema validado endoscópica Scoring

Summary

Ao longo dos últimos anos, novas endoscópios geração surgiram como importantes auxiliares de pesquisa de diagnóstico para a avaliação de colite murina e tumores colorectais. Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a avaliação endoscópica de inflamação e tumores colo-rectal em ratos, bem como um novo sistema de pontuação que utiliza identificadores decimais para documentar a gravidade endoscópico de colite e tumores colorectais.

Abstract

O uso da endoscopia moderna para fins de pesquisa facilitou enormemente a nossa compreensão de patologias gastrointestinais. Em particular, a endoscopia experimental tem sido muito útil para estudos que requerem avaliações repetidas em um único animal de laboratório, tais como os mecanismos de avaliação de doença inflamatória intestinal crônica ea progressão do câncer colorretal. No entanto, os métodos utilizados em todos os estudos são altamente variáveis. Pelo menos três sistemas de pontuação endoscópicos foram publicadas para a colite murina e publicado protocolos para a avaliação dos tumores colorretais não conseguem resolver a presença de inflamação do cólon concomitante. Este estudo desenvolve e valida um sistema de pontuação endoscópica reprodutível que integra a avaliação de inflamação e tumores simultaneamente. Este novo sistema de pontuação tem três componentes principais: 1) avaliação da extensão e da gravidade da inflamação colorectal (baseado em achados perianal, a transparência do wall, sangramento das mucosas e lesões focais), 2) a gravação quantitativa de lesões tumorais (mapa de grade e gráfico de barras), e 3) a classificação numérica de casos clínicos por sua relevância patológica e de investigação com base em unidades decimais com categorias atribuídas de lesões observadas e complicações endoscópicas (identificadores decimais). Foram preparadas O vídeo eo manuscrito aqui apresentada, seguindo protocolos IACUC-aprovados, para permitir que os investigadores para marcar os seus próprios camundongos experimentais usando uma metodologia endoscópica bem validada e altamente reprodutível, com a opção de sistema para diferenciar distal de colite endoscópica proximal (D-PECS ).

Introduction

Endoscopia de murino foi realizada como uma ferramenta de pesquisa útil para mais de uma década ^1-3. Até o momento, a maioria dos estudos que empregam endoscopia murino têm utilizado endoscópios rígidos, embora alguns também têm usado a sigmoidoscopia flexível. Endoscopia Murino proporciona resultados imediatos e uma estimativa mais objetiva da extensão da normalidade intestinal, a gravidade da inflamação e progressão do tumor em comparação com medidas indiretas, tais como perda de peso, diarréia e histologia (que é abaixo do ideal quando as lesões são irregulares), enquanto oferecendo insights sobre a saúde geral do cólon. Mais notavelmente, a endoscopia permite uma avaliação repetida de modelos animais de laboratório ao longo do tempo, em oposição ao exame histológico tradicional que exige que o animal ser sacrificado e de dois pontos a ser colhido para análise ^1. Apesar destas vantagens, a utilização de tecnologia endoscópica murino não foi generalizada e é limitada pela falta de protocolos padronizados de implementatiem e pontuação de achados patológicos. Devidamente implementado, endoscopia murino é uma grande promessa para facilitar ainda mais a nossa compreensão e caracterização de modelos animais de vários estados de doença gastrointestinais crônicas, incluindo doenças inflamatórias intestinais, colite, e tumores colorretais.

A utilidade da tecnologia endoscópica murino dobradiças em cima de sua reprodutibilidade e objetividade, o que requer a existência de procedimentos de análise padronizados e um sistema de pontuação consistente, não redundante e confiável para patologias intestinais. Pelo menos três sistemas de pontuação descritivo para a avaliação endoscópica de colite ^4-6, bem como para os tumores do cólon em ratinhos ^4,7,8 foram publicados. No entanto, estas abordagens relatados e sistemas de pontuação não são facilmente comparáveis ​​entre os estudos. Em muitos casos, não existe uma definição clara dos critérios utilizados para a classificação das lesões, e quando os critérios são dados, eles variam muito. Além disso,não existem sistemas de pontuação relataram que integram a avaliação de ambos colite e tumores, duas das patologias do cólon mais comuns que podem ocorrer simultaneamente e têm efeitos interativos sobre o resultado, em uma única ferramenta de medição. Por fim, os sistemas de pontuação endoscópicos que existem para a colite têm frequentemente categorias inflamatórios com discriminação limitada (ie. Opções estreitas de pontuação em escalas de inteiros curtos, muitas vezes 1-4) para representar adequadamente os cenários progressão da doença e permitem o uso de análise estatística paramétrica.

Neste trabalho, descreve-se o uso de um endoscópio flexível para avaliar a gravidade da colite murina e tumores do cólon e descrever um protocolo padronizado para empregar esta tecnologia na avaliação anatômica da região perianal, reto e cólon distal. Nós ilustramos solução de problemas eficaz durante a endoscopia para minimizar traumas e artefatos de imagem, e descrevemos um sistema de pontuação reprodutívelcom base nos parâmetros clínicos publicados validados. O sistema de pontuação integra avaliação tanto a inflamação intestinal e tumores utilizando um elevado nível de discriminação com 12 possíveis graus de inflamação, o mapeamento do tumor e as opções de traço, e um novo sistema de unidade decimal (isto é, os identificadores decimais) para destacar resultados com valor de diagnóstico específico ( ou seja, o desenvolvimento de tumores, complicações durante a endoscopia, etc.) A utilização de identificadores decimais permite monitoramento rápido de conjuntos de dados relevantes para uma análise mais aprofundada a jusante. Finalmente, realizamos testes de confiabilidade e do sistema de pontuação validade em vários modelos murinos de colite e câncer associado-colite (dextran sulfato de sódio (DSS), colite induzida, infecção Clostridium difficile, e azoximetano / câncer do cólon induzida por DSS).

Protocol

1. Configuração do Sistema de Endoscopia

1. Configure o sistema de endoscopia antes de anestesiar os ratos, seguindo as instruções do fabricante. Use um ureteroscope vídeo projetado para os seres humanos para este protocolo (Figura 1). O diâmetro externo do tubo de inserção é de 9,9 Fr (3,3 mm), a sua extremidade distal é de 8,5 Fr (2,8 mm), e o diâmetro interno do canal de instrumentação é 6 Fr (1,2 mm).
2. Embora o uso de endoscópios não têm sido associados a transmissão da doença [9], esterilizar a lente do endoscópio e com etanol a 70% ou ¹⁰ com técnicas adequadas quando se trabalha com microorganismos que formam esporos. Prepare lubrificante estéril bacteriostática e não coçar limpar tecidos para saturar a ponta do endoscópio.
3. Anexar uma seringa de 3 ml cheio de ar (ou de uma mistura de gases adequados CO ₂₎ para a parte superior do canal de instrumentação.
4. Ligue o aparelho e configurar o balanço de branco em luz branca normal,modo, assim como estreita banda de imagem (NBI), quando aplicável. Desde 2001, a NBI tem proporcionado benefícios de diagnóstico por imagem, uma vez que enfatiza estruturas dos vasos sanguíneos finos nas membranas mucosas, incluindo lesões ulcerativas e tumorais, que têm característica vascularização anormal ^11. Modo NBI-filtro restringe o comprimento de onda da luz captada para 390-445 nm e 530-550 nm, que destaca as estruturas com a hemoglobina.
5. Imprimir o formulário de pontuação de avaliação (Figura 2) para registrar suas descobertas. Familiarize-se com as imagens normais e esperados NBI (Figura 3A) ea definição e graus de cada critério antes do exame (ver Secção 6.1).
6. Prepara-se uma solução à base de corante em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para cromoendoscopia, se desejado. Em cromoendoscopia, o exame é realizado utilizando um corante como meio de contraste para realçar as alterações da mucosa. Use azul de metileno (0,1-1%) e indigotina (0,1%) soluções (Figura 3B). Notaque o azul de metileno é um agente de oxidação-redução, que pode produzir radicais oxidantes, reticulação indirecta de resíduos de aminoácidos e degradação de ADN ^{de 12,} o que poderia interferir com a análise de uma amostra.

2. Anestesia Geral do Rato

1. Escolher o agente e via de administração do anestésico. Consulte um veterinário de uma facilidade de recursos animais ou Animal Care e Use Institucional Committee (IACUC) sobre a possibilidade de interferências de medicamentos com o sistema imunológico e os objetivos da pesquisa. Alguns medicamentos podem influenciar a expressão do perfil de citocinas em animais, incluindo roedores ^13. Use tribromoetanol injetável para procedimentos terminais ou isoflurano para endoscopias sobrevivência, junto com controles adequados.
2. Por indução, administrar 4-5% de isoflurano em oxigênio a 100% a uma taxa de 0,2-0,5 L / min; usar 0,5-2% para manutenção. Este protocolo não é apropriado para todos os animais. Consulte seu veterinário facilidadepara instruções e treinamento adequados. Agir de acordo com as recomendações pertinentes IACUC para alcançar os mais altos padrões de bem-estar animal. Certifique-se de que o mouse se totalmente anestesiado.
3. "Strap" o rato anestesiado para uma mesa em uma superfície de apoio dorsal ou posição ventral com fita adesiva laboratório. Cuidado com a orientação anatômica na tela endoscópio. Proteja suas extremidades e cauda inferiores. A banda de fita também pode ser colocado sobre o peito para evitar o movimento para longe do respirador, mas evite restringir movimentos ventilatórios torácicas.

3. Endoscópica exame detalhado

1. Procure lesões perianais antes de introduzir o endoscópio no reto, em seguida, avançar o escopo através do ânus.
2. Brasão do endoscópio com lubrificante cirúrgico estéril. Não se esqueça de revestir a superfície do CCD (Charge Coupled Device) sensor.
3. Insira o endoscópio e iniciar a gravação. Os vídeos gravados são úteis para mavaliação eticulous da endoscopia, se necessário após o exame. Tente realizar a endoscopia no menor período de tempo possível para minimizar a irritação intestinal / mucosa.
4. Aplicar ar usando uma seringa para definir lentamente para além das paredes intestinais. Dependendo do tamanho do animal, usar 1-2 ml de ar. Evite insuflação de ar excessiva, que pode causar dificuldade respiratória e morte do rato anestesiado.
5. Avançar o endoscópio para a frente como você limpar o caminho com o ar ou a rotação suave do escopo. Não avance o endoscópio, se você não ver a luz intestinal. Perfurações ou lágrimas reto / cólon pode ocorrer nesta fase, especialmente em ratos jovens (<8-10 semanas de idade). Tire fotos, se necessário.
6. Como o escopo avanços, avaliar se há sangramento espontâneo (definido como natural hemorragia mucosa não associados a endoscopia traumático). Hemorragia espontânea pode ser observada quando o endoscópio entra no recto e cólon.
7. ComoSess a transparência da parede do cólon. A transparência é definido como a capacidade de visualizar os vasos sanguíneos intramurais no cólon e que das outras vísceras circundantes (Figura 4). Movimento suave do escopo (back-frente, no sentido horário, anti-horário) vai ajudar a determinar se os vasos sanguíneos pode ser visto no contexto de outras vísceras. Tecido adiposo mesentérica pode também ser visto. Nota se no recto para dentro da cavidade pélvica parece menos transparente do que a parede do cólon na cavidade abdominal.
8. Inspecione para determinar o tipo e número de lesões focais (áreas edematosas, erosões, úlceras, massas tumorais). Este será gravado na forma de pontuação pelo escore inflamação do cólon e os identificadores de decimais que têm sido desenvolvidos.
9. Uma vez que a área onde o cólon flexiona caudal no cólon proximal é atingido, retirar o endoscópio lentamente e procure a presença de hemorragia de contacto (que ocorre devido a mucosa após a friabilidadeendoscópio é avançado ou removido). Não é necessário para raspar a superfície do cólon intencionalmente. Mucosa colorectal saudável não sangra após exame endoscópico adequado.

4. Biopsia

1. Quando são necessárias biópsias, insira a pinça de biópsia através do canal endoscópio dedicado para instrumentação. Monitorar o avanço da pinça na tela do endoscópio para evitar perfuração intestinal.
2. Abra os copos de biópsia da pinça a cerca de um ângulo de copo para copo de 60-80 °, e dirigi-los para a área de interesse. Fórceps ou pressão excessivamente abertas pode compreender camadas adicionais de tecido intestinal, o que resulta numa perfuração induzida por biópsia de paredes intestinais transparentes saudáveis. Se ocorrer perfuração, a eutanásia do animal durante a anestesia seguindo suas recomendações IACUC. Perfurações resultar em endotoxemia e peritonite.
3. Feche os copos de biópsia, e retirá-los, mantendo a pinça fechada.
4. Remove a amostra de a pinça, através de lavagem do tecido com uma solução que é suave para o tecido e a pinça. ARN posterior e PBS são soluções de trabalho comuns, e se necessário, usar a agulha para retirar a amostra. Evite corroendo os copos de fórceps ou arestas cortantes.

5. A recuperação da anestesia

1. Após a conclusão do exame, proporcionar um ambiente acolhedor para o mouse até que ele se recupere. Utilize uma luz elétrica, ou uma almofada quente fixada em 37 ° C. Evitar o sobreaquecimento; vasodilatação periférica compromete a recuperação dos animais. Monitorar o mouse perto até a recuperação completa.

6. Integrado Scoring System endoscópica de colorretal Saúde com decimais Identifiers

1. Utilize o formulário de pontuação (Figura 2) e as definições de parâmetros abaixo (Avaliação endoscópica de Murino colorretal Inflamação e Tumores Usando um sistema decimal ponderada pontuação: Definições dos parâmetros e Protocol) paraexemplos e "sistema distal-proximal endoscópica Colite marcando 'opcional (D-PECS) como diretrizes para avaliação nonbiased e manutenção de registros detalhados.
2. Marque os quatro parâmetros de inflamação colorectal descritos no formulário sistema de pontuação (Figura 2). Meticulosamente avaliar a região perianal, a transparência intestinal, tipo de sangramento intestinal (se houver), e presença e quantidade de lesões focais (erosiva, ulcerosa, e / ou tumoral).
3. Ao avaliar tumores para fins de pesquisa, analisar a quantidade, localização e tamanho, e descrevê-los usando o mapa do cólon e gráfico de barras no formulário de pontuação. A soma numérica das pontuações obtidas e número de lesões (quando aplicável) irá determinar o fundo inflamação do cólon, o tipo mais predominante de lesão, e do número de lesões.

Representative Results

O protocolo e as imagens apresentadas neste estudo foram preparadas com um endoscópio flexível Olympus URF-V ¹⁴ e NBI ^11,15. As imagens de vídeo foram salvas em formato e de imagens em JPG, TIF, PNG ou formato DICOM com o máximo de 1280 x 1024 pixels, transferíveis para memórias Flash portátil USB padrão MPEG-2. NBI aumenta o contraste visual dos tecidos que contêm hemoglobina. A luz normal e NBI imagens são características fundamentais para ilustrar a anatomia normal da mucosa retal e as diferenças entre a vascularização normal e anormal durante a ulceração e desenvolvimento tumoral (Figuras 3A e 6A). Imagens com azul de metileno como meio de contraste durante cromoscopia mostrar seus benefícios para imagens close-up, revelando a aparência aérea normal, favo de mel das criptas do cólon (ver de perto na Figura 3B).

Até o momento, temos realizado mais de 500 endoscopias murino seguinasa este protocolo, com cerca de 10%, representando o exame repetido. Geralmente, o procedimento requer 10-15 minutos para ser concluída, divididos igualmente entre a administração da anestesia, endoscopia, e recuperação da anestesia. O exame cobre a partir do ânus para a flexura esplênica do cólon distal. Também foram conduzidos com sucesso exames endoscópicos post-mortem de cólon proximal, ceco e íleo, em alguns casos, a seguir a dissecção postmortem dos tecidos imediatamente antes da colheita de tecidos para a histologia (Figura 6B). Em um caso, também observamos e confirmou suspeita dilatação gástrica em um mouse afetados com estenose duodenal grave e impactação devido a aderências intestinais. A imagem de anormal foi observado transmuralmente do aspecto mais cranial de um cólon distal levemente inflamado; exame post-mortem mostrou que o estômago dilatado foi justaposto ao cólon.

Nós desenvolvemos uma válidos e confiáveis ​​s ponderada decimaissistema de retirada do dielétrico para melhorar a aplicação padronizada de endoscopia murino através de estudos publicados. Três sistemas de pontuação foram previamente empregado e serviu de base para o desenvolvimento do nosso sistema decimal ponderada ^4-6. Embora estes sistemas permitem a categorização de diferentes critérios e níveis de gravidade da lesão, faltam definições critérios próprios, alguns dos quais são difíceis de avaliar a partir de imagens endoscópicas. Em alguns casos, os parâmetros ambíguas incluídos nos sistemas de pontuação ter relevância questionável para exame endoscópico, em ratinhos. Um resumo das onze parâmetros publicados ^4-6 e as suas vantagens endoscópicos, limitações e relevância fisiológica são apresentados na Tabela 1.

Porque o sistema de endoscopia de pontuação do cólon murino proposto será utilizado para fins de investigação, a sua utilidade para a realização de inferência estatística foi essencial. Para garantir que o sistema de pontuação tevealta validade de construto, foi desenvolvido pela primeira vez uma estrutura conceitual para identificar parâmetros relevantes, agrupados estes parâmetros para menos (n = 3) critérios, e avaliaram sua colinearidade e correlação com a presença real de inflamação e cicatrização (Figura 7). Em seguida, nós adicionamos resultados perianal usando inteiros discretos para representar níveis ordinais de gravidade, e integrou o conceito de indução do tumor e desenvolvimento usando identificadores decimais. Além disso, nós adicionamos 'restrições' como outro parâmetro não considerado anteriormente / relatados em endoscopia intestinal murina. As notas de saída resultantes produzem alta validade e são adequados para a análise estatística paramétrica. Por fim, acrescentou mapeamento e capacidades de plotagem numéricos para monitoramento detalhado doença.

Para avaliar a validade convergente do nosso sistema de avaliação, os escores obtidos a partir de três parâmetros publicados para 36 colonoscopias rato foram comparados com os escores obtined pela mesma pessoa usando cegamente três sistemas de pontuação anteriores ^4-6. Toda comparação mostrou boa correlação positiva, indicando alta validade convergente para o nosso sistema integrado de pontuação (Pearson p <0,0001; Figura 8). A análise apoia a inclusão dos resultados perianal, como parte dos critérios clínicos para avaliar a saúde colorectal, como era comumente presente em casos de colite grave e maior dispersão dos dados (P = 0,0351 entre a pontuação 0 e 1, P = 0,0086 entre o escore 2 e 3, Figura 8B). Quando o sistema de pontuação integrado (após a adição de achados perianal) foi comparado com os outros sistemas disponíveis, era evidente que dois dos três outros sistemas têm uma limitação importante inferencial devido ao agrupamento dos casos a uma das quatro categorias inteiras possíveis, uma das principais indicação de tendência do método de classificação incorreta (Figura 8C) ^16. Com identificadores decimais, o nosso sistema de pontuação novela tem a menor probabilidade de cluspági pontos de dados em categorias inteiras.

Figura 1. Instruments. Endoscópio flexível, sistema de controle de vídeo, fonte de luz, gravador de vídeo e equipamento de anestesia inalatória utilizada neste estudo. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2. Formulário sistema de pontuação decimal para avaliação de tumores colorretais e colite em ratos. O sistema tem um componente inflamatório núcleo de quatro parâmetros não co-lineares, ilustrações de tumor informações, e unidades decimais para lesões notáveis ​​ou complicações. Veja os critérios e exemplos detalhados na seção abaixo (Avaliação endoscópica de Murino colorretal Inflamação e Tumores Usando um sistema de pontuação decimal ponderada). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3. Imagens pareadas de mucosa normal em modo normal luz endoscópica, modo NBI, e com cromoscopia. Arborização dos vasos sanguíneos normalmente é menos comum no reto. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Figura 4. Representação transversal de alças intestinais para ilustrar o princípio da transparência endoscópica da parede intestinal em camundongos. Visualização endoscópica de vasos intestinais murais e gordura mesentérica, e que dos vasos mesentéricos e gordura saudável a partir de vísceras adjacentes, é possível através da parede de um cólon saudável. A inflamação e espessamento da parede intestinal nas seções peritoneal do cólon distal impede a visualização de estruturas intramurais e transmural de outras vísceras, mesmo que outros segmentos intestinais são saudáveis. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Figura 5. Solução de problemas. Resolver baixa visibilidade causada por conteúdo intestinal, imagens borradas e movimentos peristálticos. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 6. Imagens emparelhados (luz normal vs imagem de banda estreita, NBI) de mucosa colorretal doente e outros segmentos intestinais proximais. NBI ajuda a identificar ulcerativa e lesões tumorais. Algumas úlceras aparecem marrom com NBI, outros cobertos com material fibrinoso aparecer grosso e branco. Tumores AOM / DSS são mais bem caracterizados com NBI, especialmente durante os estágios iniciais, quando eles não sãosalientes para o lúmen. Os asteriscos (*) destacam artefato endoscópica (ondulação da mucosa) no cólon preenchido com PBS, não observada em todas as outras imagens onde cólon é distendido com o ar. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 7. Correlação teórica e co-linearidade entre a gravidade da inflamação intestinal ea capacidade de vários critérios publicados visualmente discernir e grau de inflamação do cólon (ver Tabela 1). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 8. Comparação do desempenho entre o nosso sistema de pontuação e sistemas de pontuação previamente publicados. Dados de análises cegos pareadas de 36 endoscopias vídeo do mouse. A) Comparação de Sistema A (5 parâmetros) para os parâmetros inflamatórios, exceto as lesões perianais (3 parâmetros). B) importância de incluir descobertas perianal no sistema de pontuação; exame perianal consistentemente fornecido informações estatisticamente significativa adicional em casos de colite moderada / grave em camundongos C) Desempenho do sistema de pontuação depois de incluir os resultados perianal em comparação com sistemas previamente relatados (36 de vídeo mouse. endoscopias foram marcados com cada método). Note-se que os sistemas de B e C, têm uma limitação importante, devido à aglomeração de casos em uma das quatro categorias principais de misclassificatviés de íons (Sistemas B e C casos de agrupamento em categorias nonequivalent). Ao adicionar identificadores decimais, também reduziu a chance de agrupamento em categorias inteiras, permitindo o rastreamento de pontuações numéricas agora significativas. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Tabela 1. Parâmetros clínicos publicados como critérios endoscópicos para avaliar a inflamação intestinal em camundongos. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Endoscópica AVALIAÇÃOnt de Murino colorretal Inflamação e tumores usando um sistema de pontuação decimal ponderada: Definições dos parâmetros e Protocolo

Nosso sistema de pontuação endoscópica integrada para a saúde colorectal tem três componentes principais: 1) avaliação da extensão e da gravidade da inflamação colorretal, com quatro parâmetros e 12 possíveis notas numéricas, 2) de gravação da localização, tamanho e número de lesões tumorais, e 3 ) unidades decimais com tipos designados de lesões primárias ou predominantes e complicações endoscópicas para destacar conclusões de um significado especial para o pesquisador, aqui referido como "identificadores decimais". A localização e o tamanho dos tumores são registados num mapa do cólon virtual, e o número de tumores em cada percentagem de saliência (obstrução) para o lúmen é registada num gráfico. Estes dois gráficos fornecer informações de tumor que pode ser integrado em três dimensões. As unidades decimais para categorias de lesão variam 0,0-0,9. Se o númemero de lesões para uma determinada categoria é casas decimais relevantes, segundo e terceiro pode ser usado para indicar o número de lesões. Por exemplo, se três lesões são observadas, acrescentando 0.003 permitiria ao pesquisador saber que havia três lesões, se há 12 lesões, em seguida, 0.012 seriam utilizados. Esse sistema de rastreamento é um benefício especial, se repetidos exames endoscópicos são antecipados. Definições detalhadas dos critérios e graus de severidade de inflamação são dadas abaixo.

A. Avaliando infammation colorretal com quatro parâmetros clínicos - definição de critérios endoscópicos

1. Resultados Perianais: Avalie este aspecto antes de iniciar a delimitação do âmbito de evitar confusão com sangramento pós-endoscopia. Saúde da região perianal é uma proxy para o estado de saúde do cólon, pele e atitude do animal em geral, e é incluído como parte do exame endoscópico, pois algumas lesões não podem e should não ser examinado em estreita colaboração com a olho nu. Exercer medidas de biossegurança, conforme apropriado. Note-se que os hábitos de higiene saudáveis ​​por os ratinhos podem remover sangue / descargas, mas não irá remover as lesões da pele da região perianal. Pontuação:

0. Normal. Sem sangue, diarréia, fissuras, fístulas ou descarga observado.
1. Tufos de matéria fecal ou diarréia observado.
2. Coágulos / aglomerados de secreção sanguinolenta, fezes soltas (diarreia), pus ou ulcerações menores observados.
3. O tecido de granulação ou lesões observadas que envolvem a maior parte da pele circundante e indica que o animal marcado irritação ou inflamação na região perianal, prolapso rectal.

2. Transparência do cólon: Definido como a capacidade de visualizar os vasos sanguíneos ou órgãos extramuros através da parede do cólon como o cólon-endoscópio é delicadamente movido. Note-se que o reto é naturalmente menos transparente devido às camadas musculares umad porque está no interior da cavidade pélvica, onde existe menos do contraste. Este é um dos parâmetros fisiologicamente mais abrangente, uma vez que reflete a condição inflamatória geral ou a saúde do cólon murino. Note-se que é possível ter um cólon não-inflamada com a erosão da mucosa / úlceras nos estágios iniciais da infecção ou efeitos tóxicos sobre o epitélio. Tenha em atenção que uma solução isotónica fisiológico deve ser usada para lavagem durante a endoscopia, como soluções hipotónicas, tais como água, causar alterações com branqueamento e contracção da mucosa em ratos se uso por longos períodos (ver asteriscos na Figura 6).

0. Normal. Vasos sangüíneos grandes e pequenos do cólon e as vísceras circundantes são claramente visíveis. Mova o endoscópio ligeiramente (frente e para trás, relógio / anti-horário). Branco gordura mesentérica ou conteúdo escuro de outras vísceras também podem ser observados.
1. Pequenas embarcações são parcialmente invisível, mas grandes vasos são visíveis.
2. Pequeno vessels são invisíveis e grandes vasos não são claras. A mucosa não aparecer engrossar.
3. Aparente espessamento da parede do intestino e / ou edema da mucosa / generalizada. Os vasos sanguíneos não são visíveis. Alguns vasos distendidos / varicosas podem ser visíveis em alguns casos.

3. Sangramento das mucosas: Diferenciar contato sangramento de sangramento espontâneo. Procedimentos endoscópicos normais de rotina em ratos saudáveis ​​não devem induzir o sangramento. Se há uma inflamação, a um aumento da vascularização dos tecidos das mucosas e fragilidade pode levar a erosão da mucosa e sangramento. Não há necessidade de raspar intencionalmente o cólon para avaliar este parâmetro.

0. Normal, sem sangramento.
1. Sangramento contato comum. Este sangramento traumático é definido como contato sangramento, que deve ser julgado somente após a retirada do endoscópio.
2. Não aplicável. Intencionalmente não designado para forçar o examinador para decidir a nature de hemorragia.
3. Hemorragia espontânea, definida como uma hemorragia não traumático e de ocorrência natural que é observado quando o endoscópio entra no cólon. Às vezes, a insuflação de ar induz sangramento espontâneo durante colite grave.

4. Lesões focais: Para acomodar a natureza irregular e imprevisível de doenças colorectais, este sistema de pontuação integrado permite peneiração para a presença de lesões focais (principalmente de natureza ulcerativa) pela gravidade da inflamação. Uma vez que o cólon é um curto, segmento tubular direita em ratinhos, foi considerado desnecessário descrever a localização das lesões. Em vez disso, o número de lesões são registadas e adicionou-se a pontuação total utilizando o sistema de identificadores decimais. No entanto, se houver necessidade de ênfase na localização das lesões, temos uma opção chamada 'distal-proximal endoscópica Colite Scoring System' (D-PECS) descrito abaixo na seção F. aplicações mais ágeis pode serderivada de nosso sistema de pontuação decimal. Como os tumores raramente existem sem induzir algum tipo de inflamação na região colorectal em ratos, que têm incluído tumores na secção identificadores decimais para permitir exclusivamente o estudo de tumores no contexto de saúde intestinal (ver abaixo).

0. Normal, sem lesões focais.
1. Áreas bem definidas de pequena elevação plana coberta por mucosa normal observado. Esta é para tratar de áreas edematosas locais ou áreas potenciais de infiltração / proliferação de células, como encontrado em colite leve.
2. Avermelhada ou áreas erosivas observadas.
3. Ulceração ou restrições. Úlceras são identificados por vermelhidão e deformidade (bordas irregulares com evidência de vascularização anormal) devido a reparação ferida edematosa ou fibrótica. NBI endoscopia é útil para diferenciar a detecção ou a observação de ulcerações. Strictures são reconhecidos como áreas anormalmente estreitas, circulares ou irregulares e estáticas em forma, que não contrair ou expandir como exesperada. Muitas vezes as críticas envolvem áreas de criptas mucosas anormais, ou vilos no íleo. No caso dos endoscópios flexíveis (diâmetro externo = 3,3 mm) a incapacidade cuidado para avançar o alcance em áreas mais proximais do cólon tem sido consistentemente associada a restrições anormais verificados post-mortem.

B. gráficos Tumor de local de gravação, o tamanho eo número

1. Virtual mapa do cólon: O mapa é uma imagem perspectiva virtual do cólon distal e reto que é feita cortando a parte superior do lúmen (0 °) e implantá-la para fora. A parte superior e na parte inferior do gráfico são atribuídos proximal do cólon (flexão) e ânus, respectivamente. A linha de centro (180 °) indica a parte inferior do lúmen (aspecto ventral do animal), e as metades direita e esquerda dos semicírculos indicam a direita e para a parede esquerda do lúmen. O mapa pode ser utilizado para descrever a localização e tamanho horizontal de tumores, como bemcomo ulcerações.

2. Números de tumor para cada grau de ocupação do tumor: Embora o mapa do cólon fornece apenas uma informação bidimensional, a medida em que os tumores crescem dentro do lúmen do intestino é uma característica importante de tumores, uma vez que pode causar estenose saliência ou obstrução intestinal. Para capturar essas informações, nós adicionamos um gráfico de gravação para cento protrusão para o lúmen que documenta o número de tumores em cada faixa percentual, permitindo uma perspectiva tridimensional para avaliar a extensão dos tumores do cólon.

Identificadores C. decimais para fazer pontuações numéricas significativa e acelerados casos relevantes

Nosso sistema de pontuação usa um novo sistema de identificador decimal para registrar a presença de lesões ou complicações relevantes. Esses identificadores são para finalidades descritivas e visam facilitar a interpretação de uma pontuação numérica e acelerados casos de interesse endoscópica. No entanto, eles também servem para numericamente peso tipos predominantes de lesões, e permitir a geração de conjuntos de dados passíveis de estatísticas paramétricas. Ao usar a forma de pontuação desenvolvido, marque as lesões conforme o caso, e escolher um identificador decimal a ser adicionado à pontuação inflamatório.

0. Não há resultados especiais.
1. Fístula perianal, ou inflamação perianal excessiva, prolapso retal.
2. Principalmente lesões erosivas com envolvimento parede menor.
3. Lesões ulcerativas em sua maioria, algumas cobertas com fibrina, sangramento, ou grande, com formas irregulares, devido à coalescência de pequenas úlceras (o número de lesões pode ser registrada como 0.301 por um tumor, 0.302 para dois tumores, 0,311 por onze tumores, etc.).
4. Estenose intestinal (opcional porque estenose é uma complicação inflamatória grave na colite, adicione 2 pontos para a pontuação inflamatório total).
5. Placa bem definida (tecido espesso / não transparente dentro da parede intestinal, por exemplo & #160; um tumor de baixa altura flat). O número de placas pode ser gravada, tal como descrito por lesões (ou seja, 0,401, 0,402, 0,411 ..., etc.). Eles podem aparecer como uma superfície plana não expansível, que pode parecer a sobressair para cima a cerca de 5-10%, o que modifica a aparência circunferencial do lúmen intestinal.
6. Salientes em massa ou lesão tumoral. O número de massas podem ser registadas como descrito por lesões (ou seja, 0,601, 0,602, 0,611 ..., etc.). Eles são claramente abaulamento, mas pode aparecer plana mas saliente> 15% da circunferência do distendida do lúmen intestinal.
7. Induzida lágrima / perfuração durante a endoscopia.
8. Morte de animais durante a endoscopia.
9. Outros: _____________ (colite endoscópica proximal por exemplo, grave, consulte distal-proximal endoscópica Colite Scoring System abaixo).

D. Exemplos e aplicações

O sistema de pontuação endoscopia murino apresentada neste artigo é specifically projetado para integrar a recolha e análise de dados sobre a inflamação do cólon e tumores colorretais. No que diz respeito a tumores, os dados podem ser analisados ​​usando várias abordagens estatísticas, incluindo a área sob a curva, a mediana, o modo, ou análise de componentes principais. No nível individual, o sistema de pontuação pode ajudar os pesquisadores a monitorar a saúde do cólon em um único rato ao longo do tempo. Depois de somar os subscores inflamatórios e anexando o identificador decimal adequada para o tipo e número de lesões se for caso disso, a pontuação total irá permitir aos pesquisadores quantificar numericamente o grau de inflamação do cólon, o tipo mais predominante de lesão, e do número de lesões. Por exemplo, uma pontuação de 12,609 indica que este rato tem inflamação colorectal grave e nove salientes massas tumorais; um rato saudável com uma região perianal normal e mucosa retal que foi perfurado durante a endoscopia teriam uma pontuação total de 0,7. O sistema identificador decimal vontadepermitir aos pesquisadores para catalogar e pesquisar facilmente grandes repositórios de dados de camundongos marcados. Por exemplo, um pesquisador pode definir critérios de pesquisa para identificar todas as notas que terminam em "0.6" e recuperar todos os casos que têm tumores salientes. Mais exemplos são ilustrados na Figuras complementares S1-S3.

E. distal-proximal sistema de pontuação colite endoscópica (D-PECS)

Esta é uma modificação opcional do nosso sistema de identificador de pontuação decimal para diferenciar casos com vasta colite grave / proximal. Porque os sinais endoscópicos de colite e tumores colorretais em ratos parecem desenvolver de forma consistente nos segmentos distais do cólon recomendamos:

• Para marcar os dois pontos seguindo os critérios descritos, com especial atenção para os dois terços distais do cólon e ignorar o segmento proximal se é aparentemente saudável. Isto evita confusão e aumenta o poder discriminatório da endoscopia para a diferenciaçãoanimais tiate com vários graus de grande colite.
• Se alterações inflamatórias ou tumorais são observados no terço proximal, recomendamos adicionar um ponto ao escore total (1.0) e atribuir o identificador decimal como '0 0,9 - Outros ", que poderia ser rotulado como colite endoscópica proximal grave. Traçar as descobertas na grade mapa e gráfico de barras.
• Monitorar os animais que têm anormalidades endoscópicas no terço proximal do cólon. Preste postmortem atenção especial, como a doença pode ser invulgarmente grave ou pode estender-se para além da flexura esplênica para o cólon proximal.
• Se essa recomendação foi seguida, gravar essa abordagem na seção 'observações' do formulário de avaliação, e siga esta tendência através de experimentos. Por favor, citar em sua publicação final que a avaliação foi realizada seguindo o nosso "sistema distal-proximal endoscópica colite scoring 'ou D-PECS, que varia 0-13,9. Note-se que esta alteração não tem s Serviço Estatístico efeito em nosso sistema de pontuação, se usado em animais sem extensa colite proximal / grave.

Figuras suplementar.

Figura s1. Exemplo de avaliação endoscópica de um rato com tumores colorretais. Os animais foram tratados com AOM e DSS endoscopia anterior. A) Imagem representativa no modo normal e NBI, respectivamente. B) forma de pontuação cheia de achados endoscópicos. Note-se que, embora existam duas conclusões relevantes, a pesquisadora optou por atribuir o identificador decimal de 0,6 com base na gravidade clínica e os objetivos de pesquisa. Uma variedade de análise estatística paramétrica pode ser realizado com os dados gravados no "Mapa de tumores / úlceras 'eo' Record de saliências tumorais 'charts. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura s2. Exemplo de um rato com um estreitamento do cólon e complicação do exame endoscópico. Observe o estreitamento do lúmen intestinal e que um nonperforating, rasgo da mucosa foi induzida durante a endoscopia apenas distal ao local de estenose. Estreitamento e debilitação do cólon inflamado pode resultar em lágrimas mucosas. O animal estava sob anestesia geral. Note-se que o sistema de pontuação nos permitiu controlar e reduzir as complicações processuais. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

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Figura s3. Exemplo de curso de tempo de inflamação e marcar endoscópica num ratinho tratado com DSS. Note-se que os números podem ser auto-explicativa e indicam que a inflamação progrediu cólon (1-5 e 8), e que desenvolveram erosões por dia 8 (0,2 decimal ) e úlceras de dia 11 (decimal 0,3). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Discussion

Há várias considerações sobre modificação e solução de problemas da técnica endoscópica em camundongos. Aspectos críticos do procedimento que precisa ser dominado durante o uso da endoscopia flexível incluem o ajuste do volume de ar necessário para evitar a distensão abdominal e comprometimento respiratório do rato, e os aspectos técnicos menores de controle de exibição com a coordenação dos controles de angulação e torque . Controle de torque é importante para minimizar o risco de perfuração intestinal. Quando tratada adequadamente, a endoscopia flexível murino torna-se um procedimento muito seguro e rápido que permite a visualização direta e amostragem da biópsia de áreas intestinais de interesse da pesquisa.

Para resolver vista obstruções devidas a matéria fecal (Figura 5), é importante compreender que partículas fecais são geralmente observadas mesmo após jejum ou o uso de laxantes. Quando presentes, as fezes podem ser facilmente movidos proximal com ins ar suavesufflation. Em cerca de 11% dos casos, é necessário utilizar também um ml de PBS enema. Antes de realizar o enema, tenha cuidado ao examinar animais que parecem ter distensão abdominal ou que estão grávidas. Para os movimentos peristálticos, é importante esperar alguns segundos até que a onda peristáltica passa desde insuflação de ar não pára peristaltismo.

Até o momento, a maioria dos sistemas de avaliação endoscópicos utilizados para avaliar doença intestinal murina são específicas para qualquer colite ou câncer. Tendo em conta que estas duas condições, muitas vezes ocorrem concomitantemente e podem interagir uns com os outros, um sistema de pontuação padronizado que leva em conta tanto a inflamação e formação de tumores facilitaria muito a comunicação inter-disciplinar, aumentando assim a capacidade de utilização das informações obtidas durante a pesquisa gastrointestinal por pesquisadores de câncer, e vice-versa. Como os tumores raramente existem sem induzir algum tipo de alteração inflamatória na região colorretal in ratos, incluímos tumores na secção identificadores decimais de nosso sistema de pontuação para permitir exclusivamente o estudo de tumores no contexto de saúde intestinal. Para melhorar a validade ea confiabilidade do sistema de pontuação e facilitar seu uso em experimentos de longa duração ou clínicos, também desenvolvemos um modelo de relatório padronizado para usar em conjunto com o sistema de pontuação (Figura 2), que armazena de forma sistemática os dados necessários para calcular a pontuação de inflamação intestinal murina, com base em definições precisas para cada um dos critérios de classificação.

A disponibilidade prévia de múltiplos sistemas de endoscopia pontuação murinos de validade limitado dificulta a interpretação dos resultados entre os estudos. Para minimizar a confusão vivida por profissionais de laboratório para decidir qual método publicado para usar, recomendamos realizar a avaliação endoscópica utilizando critérios que podem ser inferidas a partir de imagens bidimensionais (por exemplo, evitar critérios that referem-se a textura ou consistência - de fezes;. note que alguns ratos incluindo livre de germes podem ter fezes moles), e que não são co-linear (ou seja, que são fisiologicamente e temporalmente impulsionado pelo mesmo contexto inflamatório) Porque os sinais cardinais de inflamação são seqüencial devido a cronológica eventos inflamatórios, recomendamos os seguintes critérios: 1) transparência intestinal, primeiramente descrita por Becker et al ^4, como um reflexo da espessura da parede, 2) o sangramento, como um indicador de mucosa e integridade dos vasos sanguíneos. e 3) resultados perianal, como um indicador da integridade do cólon e irritação da pele ou predisposição à inflamação excessiva, e 4) lesões focais, para classificar a gravidade de lesões inflamatórias (que estão em camundongos principalmente ulcerativa). Até o momento, não vimos lesões tumorais nos modelos típicos de 3% induzida por DSS murino colite. O sistema de pontuação endoscópica murino descrito neste artigo apresenta, pela primeira vez, para o nosso conhecimentoum mecanismo quantitativo para avaliar a presença e a indução de lesões tumorais no contexto da inflamação do cólon.

Pela primeira vez, nós também destacar a importância de incluir restrições como parâmetro durante a endoscopia murino, já que eles parecem ser comumente presente em alguns modelos animais de inflamação intestinal, por exemplo, SAMP / Yit / Fc. Strictures representar (semi) áreas circunferenciais de submucosa inflamação crônica, com perda de elasticidade intestinal devido ao aumento da fibrose, que são difíceis de avaliar por via endoscópica para o novato. Temos notado nos ratos afetados por estenose endoscopia definidas, que há mais inflamação em segmentos que estão próximos do estreitamento em relação aos segmentos distais (que podem ser examinados por endoscopia), provavelmente devido ao trânsito intestinal mais lento. Para efeitos de investigação, é aconselhável fazer o acompanhamento animais histologicamente ao fim de experiências para caracterizar melhor a inflamaçãorespostas inflamatória que ladeiam regiões estenose candidatos.

Sem treinamento adequado e sugestões de especialistas, qualquer sistema de pontuação pode ter variação em um dado momento. É importante ressaltar que os procedimentos de treinamento endoscópicos realizados em ratos deve ser monitorada por um veterinário treinado do profissional médico para garantir: i) formação adequada de outros cientistas ou técnicos, e ii) para garantir que os animais não são diagnosticadas ou inadvertidamente ferido durante o procedimento. Consulte o veterinário responsável pelo seu animal centro de pesquisa para aconselhamento especializado antes de prosseguir para implementar este procedimento para garantir o melhor possível, as práticas e bem-estar animal. É aconselhável monitorar rotineiramente o desempenho de endoscopistas treinados. Use as imagens que apresentamos aqui como diretrizes, embaralhar a ordem em que os animais são avaliados e avaliar todos os animais de forma cega. Consulte as definições de parâmetros e critérios do protocolo periodicamente e de kEEP-los na mão durante a endoscopia e pontuação Secção 6).

Em resumo, como uma equipe de gastroenterologistas médicos e veterinários, apresentamos um protocolo padronizado e sistema de pontuação semi-quantitativa para avaliação endoscópica de modelos murinos de colite e tumores. Estas ferramentas de pesquisa vai permitir aos investigadores para realizar endoscopias murino de rotina, e vai permitir que o pessoal de pesquisa em todos os níveis de experiência para gerar medidas reprodutíveis e comparáveis ​​de inflamação intestinal e formação de tumores em todo laboratórios e entre as disciplinas. Nós desenvolvemos o sistema para produzir pontuações numéricas significativas com alta validade, e desde capacidades de rastreamento rápido de resultados específicos, que podem ser personalizável para uso interno dentro de laboratórios individuais. Descrevemos também uma alternativa de pontuação discriminatória, que leva em consideração as diferenças regionais na susceptibilidade à doença dentro do cólon (ver Secção E, ̵6; distal-proximal sistema colite pontuação endoscópica, sigla D-PECS). O formulário de relatório de dados e algumas figuras podem ser usadas como cartazes de parede para ajudar os cientistas inexperientes (Figuras 1, 3, 5, 6). A implementação bem sucedida de endoscopia murino depende de se familiarizar com a anatomia normal da junção mucocutânea no ânus, reto, cólon e vísceras vizinhas, como diferenças anatômicas são responsáveis ​​por diferenças sutis endoscópicos ^17.

Embora actualmente mesmo as menores, mais flexíveis e melhores tecnologias endoscópicas não pode alcançar o cólon proximal in vivo, em movimento rápido dos avanços tecnológicos no campo da cápsula e endoscopia de fibra única pode se tornar disponível para os ratos em um futuro próximo. O protocolo padronizado e do sistema de pontuação endoscópica apresentada neste documento representam valiosas ferramentas para visualizar e avaliar o estado do ambiente intestinal murina de animais vivos. Estas ferramentas vão facilitarcomparabilidade tate de resultados entre papéis e através das disciplinas, e terá aplicabilidade a novas e emergentes tecnologias endoscópicas murinos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System