La colonoscopia flexible en ratones para evaluar la gravedad de la colitis y colorrectal tumores utilizando un sistema validado de puntuación endoscópica

Summary

En los últimos años, los endoscopios de nueva generación se han convertido en importantes ayudas de investigación de diagnóstico para la evaluación de la colitis murina y tumores colorrectales. Se presenta en el presente documento un protocolo detallado para la evaluación endoscópica de la inflamación y tumores colorrectales en ratones, así como un sistema de puntuación novedoso que utiliza identificadores decimales para documentar la gravedad de la colitis endoscópica y tumores colorrectales.

Abstract

El uso de la endoscopia moderna con fines de investigación ha facilitado en gran medida nuestra comprensión de las patologías gastrointestinales. En particular, la endoscopia experimental ha sido de gran utilidad para los estudios que requieren evaluaciones repetidas en un solo animal de laboratorio, tales como los mecanismos de evaluación de la enfermedad intestinal inflamatoria crónica y la progresión del cáncer colorrectal. Sin embargo, los métodos utilizados en los estudios son muy variables. Al menos tres sistemas de puntuación endoscópicos se han publicado para la colitis murina y publicado protocolos para la evaluación de los tumores colorrectales no tienen en cuenta la presencia de inflamación colónica concomitante. Este estudio desarrolla y valida un sistema de puntuación endoscópica reproducible que integra la evaluación de la inflamación y los tumores de forma simultánea. Este novedoso sistema de puntuación tiene tres componentes principales: 1) la evaluación de la extensión y severidad de la inflamación colorrectal (basado en hallazgos perianales, la transparencia del wall, sangrado de la mucosa y lesiones focales), 2) de grabación cuantitativa de las lesiones tumorales (mapa de cuadrícula y gráfico de barras), y 3) la clasificación numérica de casos clínicos por su relevancia patológica y la investigación basada en unidades decimales con categorías asignadas de lesiones observadas y complicaciones endoscópicas (identificadores decimales). El vídeo y el manuscrito que aquí se presenta se prepararon siguiendo los protocolos aprobados por la IACUC, para permitir a los investigadores a los puntos de sus ratones experimentales utilizando una metodología endoscópica bien validado y altamente reproducible, con la opción de sistema para diferenciar distal proximal de colitis endoscópica (D-PECS ).

Introduction

Endoscopia murino se ha realizado como una herramienta de investigación útil para más de una década ^1-3. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que emplean la endoscopia murino han utilizado endoscopios rígidos, aunque algunos también han utilizado la sigmoidoscopia flexible. Endoscopia murino proporciona resultados inmediatos y una estimación más objetiva del grado de normalidad intestinal, la gravedad de la inflamación y la progresión del tumor en comparación con medidas indirectas, como la pérdida de peso, diarrea, y la histología (que no es óptima cuando las lesiones son irregulares), mientras que ofreciendo puntos de vista sobre el estado general de salud del colon. Más notablemente, la endoscopia permite la evaluación repetida de modelos de animales de laboratorio con el tiempo, a diferencia de examen histológico tradicional que requiere que el animal que ser sacrificados y los dos puntos que se recogerá para su análisis ^1. A pesar de estas ventajas, el uso de la tecnología endoscópica murino no ha sido extendido y está limitada por la falta de protocolos estandarizados para la impleen y la puntuación de los hallazgos patológicos. Implementado correctamente, endoscopia murino representa una gran promesa para facilitar aún más la comprensión y caracterización de modelos animales de múltiples estados patológicos gastrointestinales crónicas, incluyendo enfermedades inflamatorias del intestino, colitis, y los tumores colorrectales.

La utilidad de la tecnología endoscópica murino gira en torno a su reproducibilidad y objetividad, que requiere la existencia de procedimientos de examen estandarizados y un sistema de puntuación consistente, no redundante y confiable para las patologías intestinales. Al menos tres sistemas de puntuación para la evaluación endoscópica descriptivos de la colitis ^4-6, así como para los tumores de colon ^4,7,8 en ratones han sido publicados. Sin embargo, estos enfoques reportados y sistemas de puntuación no son fácilmente comparables entre los estudios. En muchos casos, no existe una definición clara de los criterios utilizados para la clasificación de las lesiones, y cuando se dan criterios, que varían ampliamente. Por otra parte,no hay sistemas de puntuación reportados que integran la evaluación tanto de la colitis y tumores, dos de las patologías del colon más comunes que pueden ocurrir al mismo tiempo y tienen efectos interactivos sobre el resultado, en una única herramienta de medición. Por último, los sistemas de puntuación endoscópicos que existen para la colitis menudo tienen categorías inflamatorios con la discriminación limitado (es decir. Opciones estrechas de puntuación en escalas de enteros cortos, a menudo 1-4) para representar adecuadamente los escenarios de progresión de la enfermedad y permitir el uso de análisis estadístico paramétrico.

En este trabajo se describe el uso de un endoscopio flexible para evaluar la gravedad de la colitis murino y los tumores del colon y describir un protocolo estandarizado para el empleo de esta tecnología en la evaluación anatómica de la región perianal, el recto y el colon distal. Nos ilustran la solución de problemas efectiva durante la endoscopia para minimizar el trauma y la imagen artefactos, y se describe un sistema de puntaje reproduciblebasado en parámetros clínicos publicados validados. El sistema de puntuación se integra la evaluación de la inflamación y tumores intestinales usando un alto nivel de discriminación con 12 posibles grados de inflamación, la cartografía del tumor y opciones de gráfica, y un novedoso sistema de unidades decimales (es decir, identificadores decimal) para resaltar hallazgos con valor diagnóstico específico ( el desarrollo del tumor, es decir, las complicaciones durante la endoscopia, etc.) El uso de identificadores decimales permite un rápido seguimiento de los conjuntos de datos relevantes para un análisis más profundo de aguas abajo. Por último, llevamos a cabo pruebas de fiabilidad y validez del sistema de puntuación en múltiples modelos murinos de colitis y el cáncer asociado con la colitis (dextrán sulfato sódico (DSS)-colitis inducida, infección por Clostridium difficile, y azoximetano / cáncer de colon inducida por DSS).

Protocol

1. Configuración del sistema de endoscopia

1. Establecer el sistema de endoscopia antes de anestesiar a los ratones, siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice un ureteroscopio video diseñado para los seres humanos de este protocolo (Figura 1). El diámetro exterior del tubo de inserción es 9,9 Fr (3,3 mm), su extremo distal es 8,5 Fr (2,8 mm), y el diámetro interior del canal de instrumentación es de 6 Fr (1,2 mm).
2. Aunque el uso de endoscopios no se han relacionado con la transmisión de la enfermedad [9], esterilizar el endoscopio y la lente con etanol al 70% o ¹⁰ con técnicas apropiadas cuando se trabaja con los microorganismos que forman esporas. Preparar lubricante estéril bacteriostática y que no raye limpiar tejidos para saturar la punta del endoscopio.
3. Acople una jeringa de 3 ml lleno de aire (o una mezcla de CO ₂ gas adecuado) a la parte superior del canal de instrumentación.
4. Encienda la fuente, y configurar el balance de blancos en luz blanca normal,así como el modo de imagen de banda estrecha (NBI), según proceda. Desde 2001, NBI ha proporcionado beneficios de diagnóstico por imagen, ya que hace hincapié en las estructuras de los vasos sanguíneos finos en las membranas mucosas, incluyendo lesiones ulcerosas y tumorales, que tienen características de vascularización anormal ^11. Modo de NBI-filtro restringe la longitud de onda de la luz capturada a 390-445 nm y 530-550 nm, lo que pone de relieve las estructuras con la hemoglobina.
5. Imprima el formulario de puntuación de evaluación (Figura 2) para registrar sus hallazgos. Familiarizarse con las imágenes normales esperados y NBI (Figura 3A) y la definición y grados de cada criterio antes del examen (ver sección 6.1).
6. Preparar una solución a base de colorante en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante cromoendoscopia, si se desea. En cromoendoscopia, el examen se lleva a cabo usando un colorante como medio de contraste para resaltar los cambios de las mucosas. Utilice el azul de metileno (0,1-1%) y carmín índigo (0.1%) soluciones (Figura 3B). Notaque el azul de metileno es un agente de oxidación-reducción que puede producir radicales oxidantes, reticulación indirecta de residuos de aminoácidos, y la degradación del ADN ^12, lo que podría interferir con el análisis de la muestra.

2. Anestesia General del Ratón

1. Elija la ruta agente y administración de la anestesia. Consulte a un veterinario de un centro de recursos animales o Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en cuanto a la posible interferencia de los medicamentos con el sistema inmune y los objetivos de investigación. Algunos medicamentos pueden influir en el perfil de la expresión de citoquinas en animales, incluyendo roedores ^13. Utilice tribromoethanol inyectable para procedimientos terminales o isoflurano para endoscopias de supervivencia, junto con los controles adecuados.
2. Para la inducción, administrar 4-5% de isoflurano en oxígeno al 100% a una velocidad de 0,2-0,5 l / min, el uso de 0,5-2% para el mantenimiento. Este protocolo no es apropiado para todos los animales. Consulte a su veterinario instalaciónpara las instrucciones y la formación adecuadas. Cumplir con las recomendaciones pertinentes del IACUC para alcanzar los más altos estándares de bienestar animal. Asegúrese de que el ratón si está completamente anestesiado.
3. 'Correa' el ratón anestesiado a una tabla en una superficie de apoyo dorsal o ventral posición con cinta adhesiva de laboratorio. Cuidado con la orientación anatómica en la pantalla del endoscopio. Asegure sus extremidades inferiores y la cola. Una banda de cinta también se puede colocar sobre el pecho para evitar el movimiento lejos de la mascarilla de respiración, pero evitar la restricción de movimientos ventilatorios torácicos.

3. Examen detallado endoscópica

1. Busque lesiones perianales antes de introducir el endoscopio en el recto, y luego avanzar en el ámbito de aplicación a través del ano.
2. Escudo del endoscopio con lubricante quirúrgico estéril. Asegúrese de no cubrir la superficie del CCD (dispositivo de carga acoplada) sensor.
3. Inserte el endoscopio y empezar a grabar. Los vídeos grabados son útiles para mEvaluación eticulous de endoscopia si es necesario después del examen. Intente realizar la endoscopia en la menor duración posible para minimizar la irritación intestinal / mucosa.
4. Aplicar aire mediante el uso de una jeringa para establecer lentamente aparte de las paredes intestinales. Dependiendo del tamaño del ratón, utilizar 1-2 ml de aire. Evite la excesiva insuflación de aire, ya que puede causar dificultad respiratoria y la muerte del ratón anestesiado.
5. Haga avanzar el endoscopio hacia adelante a medida que despejar el camino con el aire o rotación suave del alcance. No haga avanzar el endoscopio si no ve la luz intestinal. Perforaciones o desgarros rectales / colónica pueden ocurrir en esta etapa, especialmente en ratones jóvenes (<8-10 semanas de edad). Tome fotografías según sea necesario.
6. Como el alcance avanza, evaluar si hay sangrado espontáneo (definido como natural hemorragia mucosa no se asocia con la endoscopia traumática). El sangrado espontáneo se puede observar como el endoscopio entra en el recto y el colon.
7. ComoSESS la transparencia de la pared del colon. La transparencia se define como la capacidad de visualizar los vasos sanguíneos intramurales en el colon y el de las otras vísceras circundantes (Figura 4). Movimiento suave del alcance (back-hacia adelante, hacia la derecha, hacia la izquierda) le ayudará a determinar si los vasos sanguíneos pueden ser vistos en el contexto de otras vísceras. Tejido adiposo mesentérica también puede ser visto. Nota si el recto dentro de la cavidad pélvica aparece menos transparente que la pared del colon en la cavidad abdominal.
8. Inspeccione para determinar el tipo y el número de lesiones focales (áreas edematosas, erosiones, úlceras, masas tumorales). Esto se hará constar en el formulario de puntuación mediante la puntuación de la inflamación del colon y los identificadores de decimales que se han desarrollado.
9. Una vez se alcanza el área en la que el colon se flexiona caudalmente en el colon proximal, retirar el endoscopio lentamente y buscar la presencia de contactos de sangrado (que se produce debido a la mucosa después de la friabilidadendoscopio es avanzado o eliminado). No es necesario para raspar la superficie de colon intencionalmente. Mucosa colorrectal sana no sangra después de un examen endoscópico adecuado.

4. Biopsia

1. Cuando se necesitan biopsias, insertar los fórceps de biopsia a través del canal del endoscopio dedicado para la instrumentación. Monitorear el avance de las pinzas en la pantalla endoscopio para prevenir la perforación intestinal.
2. Abra las copas de biopsia de la pinza alrededor de a un ángulo de excavación-cup 60-80 º, y dirigirlos a la zona de interés. Fórceps o presión excesivamente abiertas pueden comprender capas adicionales de tejido intestinal, lo que resulta en una perforación inducida por biopsia de las paredes intestinales transparentes sanos. Si ocurre una perforación, la eutanasia a los animales durante la anestesia tras sus recomendaciones IACUC. Perforaciones resultan en la endotoxemia y la peritonitis.
3. Cierre las tazas de la biopsia, y tirar de ellos hacia fuera, manteniendo las pinzas cerradas.
4. Remove la muestra de los fórceps por lavado el tejido con una solución que es suave para el tejido y los fórceps. ARN más tarde y PBS son soluciones comunes de trabajo, si es necesario, utilice la aguja para sacar la muestra. Evitar la erosión de las copas de fórceps o bordes de corte.

5. La recuperación de la anestesia

1. Una vez finalizado el examen, proporcionar un ambiente cálido para el ratón hasta que se recupere. Utilice una luz eléctrica, o una compresa caliente a 37 ° C. Evitar el sobrecalentamiento; vasodilatación periférica compromete la recuperación de los animales. Vigilar estrechamente el ratón hasta la recuperación completa.

6. Sistema de puntuación endoscópica Integrado de Salud colorrectal con decimales Identificadores

1. Utilice el formulario de puntuación (Figura 2) y las definiciones de los parámetros por debajo (Evaluación endoscópica de murino colorrectal Tumores Inflamación y uso de un sistema ponderado Decimal Scoring: Definiciones de los parámetros, y el Protocolo) paraejemplos y el "sistema de distal-proximal endoscópica Colitis anotando 'opcional (D-PECS) como directrices para la evaluación no sesgada y mantenimiento de registros detallados.
2. Puntuación de los cuatro parámetros de inflamación colorrectal descritos en el formulario de sistema de puntuación (Figura 2). Meticulosamente evaluar la región perianal, la transparencia intestinal, tipo de sangrado intestinal (si está presente), y la presencia y la cantidad de lesiones focales (erosiva, ulcerosa, y / o tumoral).
3. Al evaluar los tumores con fines de investigación, examinar la cantidad, la ubicación y el tamaño, y describirlas utilizando el mapa del colon y el gráfico de barras en la forma de puntuación. La suma numérica de las puntuaciones obtenidas y número de lesiones (cuando sea aplicable) determinará el fondo de la inflamación del colon, el tipo más predominante de la lesión, y el número de lesiones.

Representative Results

El protocolo y las imágenes se presenta en este estudio se prepararon con un endoscopio flexible Olympus URF-V ¹⁴ y NBI ^11,15. Las imágenes de vídeo se guardan en formato MPEG-2 y las imágenes en formato JPG, TIF, PNG o formato DICOM con un máximo de 1280 x 1024 píxeles, transferibles a las memorias portátiles USB flash estándar. NBI mejora el contraste visual de los tejidos que contienen hemoglobina. La luz normal y la imagen NBI son características clave para ilustrar la anatomía normal de la mucosa colorrectal y las diferencias entre la vascularización normal y anormal durante la ulceración y el desarrollo tumoral (Figuras 3A y 6A). Las imágenes con azul de metileno como medio de contraste durante la cromoendoscopia demuestran sus beneficios para imágenes en primer plano, revelando la antena apariencia de panal normal de las criptas del colon (ver de cerca en la Figura 3B).

Hasta la fecha, hemos realizado más de 500 endoscopias murinos siguienala este protocolo, con alrededor del 10% que representa el examen repetido. En general, el procedimiento requiere 10-15 minutos para completar, dividido en partes iguales entre la administración de la anestesia, endoscopia, y la recuperación de la anestesia. El examen abarca desde el ano hasta el ángulo esplénico del colon distal. También hemos llevado a cabo con éxito los exámenes endoscópicos postmortem de el colon proximal, el ciego y el íleon en algunos casos, después de la disección post mortem de los tejidos inmediatamente antes de la cosecha de tejidos para histología (Figura 6B). En un caso, también se observó y confirmó la dilatación gástrica sospechoso en un ratón afectado con estenosis duodenal severa e impactación debido a adherencias intestinales. La imagen anormal se observó transmuralmente desde el aspecto más craneal de un colon distal ligeramente inflamado; examen postmortem mostró el estómago distendido se yuxtapone al colon.

Hemos desarrollado un s decimales ponderado válidos y fiablessistema de extracción de muestras para mejorar la aplicación normalizada de la endoscopia murino en todos los estudios de investigación publicados. Tres sistemas de puntuación han sido empleados anteriormente y sirvió como base para el desarrollo de nuestro sistema decimal ponderado ^4-6. Aunque estos sistemas permiten la categorización de los diferentes criterios y niveles de severidad de la lesión, carecen de definiciones de criterios propios, algunos de los cuales son difíciles de evaluar a partir de imágenes endoscópicas. En algunos casos, los parámetros ambiguos incluido en los sistemas de puntuación tienen relevancia cuestionable para el examen endoscópico en ratones. Un resumen de los once parámetros publicados ^4-6 y sus ventajas endoscópicos, limitaciones y relevancia fisiológica se presentan en la Tabla 1.

Debido a que el sistema de puntuación endoscopia del colon murino propuesta será utilizada para fines de investigación, su utilidad para llevar a cabo la inferencia estadística era esencial. Para asegurar que el sistema de puntuación teníaalta validez de constructo, primero desarrollamos un marco conceptual para identificar los parámetros relevantes, agrupamos estos parámetros a menos criterios (n = 3), y se evaluó su colinealidad y la correlación con la presencia real de la inflamación y la cicatrización (Figura 7). A continuación, hemos añadido hallazgos perianales usando números enteros discretos para representar los niveles ordinales de la gravedad y la integramos el concepto de inducción de tumores y el desarrollo mediante identificadores decimales. Además, hemos añadido 'restricciones' como otro parámetro no considerado previamente / reportado en endoscopia intestinal murino. Las puntuaciones de salida resultantes producen una alta validez y son adecuados para el análisis estadístico paramétrico. Por último, hemos añadido la cartografía y las capacidades de trazado numéricos para la supervisión detallada de la enfermedad.

Para evaluar la validez convergente de nuestro sistema de evaluación, los resultados obtenidos a partir de tres parámetros publicados para 36 colonoscopias ratón se compararon con las puntuaciones obtenido por la misma persona que usa ciegamente tres sistemas de puntuación anteriores ^4-6. Cada comparación mostró buena correlación positiva, lo que indica una alta validez convergente para nuestro sistema integrado de puntuación (Pearson p <0,0001, Figura 8). El análisis apoya la inclusión de los resultados perianales, como parte de los criterios clínicos para evaluar la salud colorrectal, ya que era comúnmente presentes en los casos de colitis severa y una mejor dispersión de los datos (P = 0.0351 entre la puntuación de 0 y 1, P = 0.0086 entre la puntuación de 2 y 3, Figura 8B). Cuando el sistema de puntuación integrado (después de añadir hallazgos perianales) se comparó con los otros sistemas disponibles, era evidente que 2 de los otros 3 sistemas tienen una importante limitación inferencial debido a la agrupación de los casos a una de las cuatro posibles categorías de enteros, un importante indicación del método de sesgo de clasificación errónea (Figura 8C) ^16. Con identificadores decimales, nuestro novedoso sistema de puntuación tiene la probabilidad más baja de clustering puntos de datos en categorías enteras.

Figura 1. Instrumentos. Endoscopio flexible, sistema de control de video, fuente de luz, grabador de vídeo, y la inhalación de la máquina de anestesia utilizada en este estudio. Haz click aquí para ver la imagen más grande .

Figura 2. Forma sistema de puntuación decimal para la evaluación de la colitis y colorrectales tumores en ratones. El sistema tiene un componente inflamatorio básico de cuatro parámetros no co-lineales, gráficos para tumor información, y unidades decimales a lesiones o complicaciones notables. Véanse los criterios y ejemplos detallados en la sección de abajo (Evaluación endoscópica de murino Colorrectal La inflamación y tumores utilizando un sistema de puntuación-Decimal ponderado). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3. Imágenes pareadas de mucosa normal en el modo normal de luz endoscópica, el modo de NBI, y con cromoendoscopia. Arborización de los vasos sanguíneos normalmente es menos común en el recto. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 4. Representación en sección transversal de las asas intestinales para ilustrar el principio de transparencia endoscópica de la pared intestinal en ratones. Visualización endoscópica de vasos intestinales murales y grasa mesentérica, y la de los buques y la grasa de las vísceras sano adyacente mesentéricos, es posible a través de la pared de un colon saludable. La inflamación y el engrosamiento de la pared intestinal en las secciones peritoneales del colon distal impide la visualización de las estructuras intramuros y transmural de otras vísceras, aunque otros segmentos intestinales son saludables. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 5. Solución de problemas. Resolver baja visibilidad causada por el contenido intestinal, imágenes borrosas y los movimientos peristálticos. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 6. Imágenes apareadas (luz normal vs formación de imágenes de banda estrecha, NBI) de la mucosa colorrectal enfermo y otros segmentos intestinales proximales. NBI ayuda a identificar ulcerosa y lesiones tumorales. Algunas úlceras aparecen de color marrón con NBI; otros, cubiertos con un material fibrinoso aparecen espeso y blanco. Tumores OMA / DSS son mejor caracterizado con NBI, especialmente durante las primeras etapas cuando no estánque sobresale en el lumen. Los asteriscos (*) destacan artefacto endoscópica (ondulación mucosa) en el colon lleno de PBS, no se observa en todas las demás imágenes en las que el colon se distiende con el aire. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 7. Correlación teórica y co-linealidad entre la severidad de la inflamación intestinal y la capacidad de diversos criterios publicados visualmente discernir y grado de inflamación del colon (ver Tabla 1). Haz click aquí para ver la imagen más grande .

Figura 8. Comparación de rendimiento entre nuestro sistema de puntuación y sistemas de puntuación previamente publicados. Datos de los análisis ciegos pareadas de 36 endoscopias de vídeo de ratón. A) Comparación de Sistema A (5 parámetros) para los parámetros inflamatorios, excepto las lesiones perianales (3 parámetros). B) Importancia de incluir conclusiones perianales en el sistema de puntuación;. examen perianal proporcionado constantemente información estadísticamente significativa adicional en casos de colitis moderada / severa en ratones C) Funcionamiento del sistema de puntuación después de incluir los hallazgos perianales en comparación con los sistemas de informes anteriores (36 videos ratón endoscopias fueron anotados con cada método). Tenga en cuenta que los sistemas B y C tienen una limitación importante debido a la agrupación de los casos en una de sus cuatro categorías principales de misclassificatsesgo de iones (Sistemas de casos del grupo C de las categorías no equivalentes y B). Mediante la adición de identificadores decimales, también disminuimos la posibilidad de agrupamiento en categorías enteros, al tiempo que permite el seguimiento de los resultados numéricos ahora significativos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Tabla 1. Parámetros clínicos publicados como criterios endoscópicos para evaluar la inflamación intestinal en ratones. Haz click aquí para ver la imagen más grande .

Endoscópica EVALUACIÓNnt de murino Colorrectal La inflamación y tumores utilizando un sistema de puntuación-Decimal ponderado: Definiciones de Parámetros y Protocolo

Nuestro sistema de puntuación endoscópica integrado para la salud colorrectal tiene tres componentes principales: 1) la evaluación de la extensión y severidad de la inflamación colorrectal, con cuatro parámetros y 12 posibles calificaciones numéricas, 2) de grabación de la ubicación, tamaño y número de las lesiones tumorales, y 3 ) unidades decimales con tipos asignados de lesiones primarias o predominantes y complicaciones endoscópicas para resaltar hallazgos de importancia especial para el investigador, se hace referencia en este documento como "identificadores decimales". La ubicación y el tamaño de los tumores se registran en un mapa virtual de colon, y el número de tumores en cada porcentaje de protrusión (obstrucción) en el lumen se registra en un gráfico. Estas dos tablas proporcionan información del tumor que puede ser integrado en tres dimensiones. Las unidades decimales para las categorías de lesiones oscilan 0,0-0,9. Si el númeroBER de lesiones para una categoría particular, es decimales pertinentes, segunda y tercera se pueden utilizar para indicar el número de lesiones. Por ejemplo, si se observan tres lesiones, añadiendo 0.003 permitiría que el investigador sepa que hubo tres lesiones, si hay 12 lesiones, a continuación, 0.012 se utilizarían. Este sistema de seguimiento es especialmente beneficioso si se prevén exámenes endoscópicos repetidas. Definiciones detalladas de los criterios de la inflamación y los grados de gravedad se dan a continuación.

A. Evaluación infammation colorrectal con cuatro parámetros clínicos - Definición de criterios endoscópicos

1. Hallazgos perianales: Evalúe este aspecto antes de comenzar alcance para evitar la confusión con el sangrado post-endoscopia. Salud de la región perianal es un indicador de estado de la salud del colon, piel, y la actitud del animal en general, y se incluye como parte del examen endoscópico debido a que algunas lesiones no puede y should no se examinaría de cerca con el ojo desnudo. Ejercer medidas de bioseguridad, según corresponda. Tenga en cuenta que los hábitos de aseo saludables por parte de los ratones pueden extraer sangre / las descargas, pero no eliminarán las lesiones de la piel de la región perianal. Puntuación:

0. Normal. No hay sangre, diarrea, fisuras, fístulas o de descarga observados.
1. Los grupos de la materia fecal o diarrea observados.
2. Coágulos / grumos de secreción con sangre, heces blandas (diarrea), pus o ulceraciones leves observadas.
3. El tejido de granulación o lesiones observadas que implican la mayor parte de la piel que la rodea y que indican que el animal ha marcado irritación o inflamación en la región perianal, prolapso rectal.

2. Transparencia de los dos puntos: Se define como la capacidad de visualizar los vasos sanguíneos u órganos extramuros a través de la pared del colon como el colon-endoscopio se mueve suavemente. Tenga en cuenta que el recto es naturalmente menos transparente debido a las capas musculares unaD, ya que está en la cavidad pélvica, donde existe menos contraste. Este es uno de los parámetros fisiológicamente más completos, ya que refleja la condición inflamatoria en general o la salud del colon murino. Tenga en cuenta que es posible tener un colon no inflamado con erosiones de la mucosa / úlceras en las primeras etapas de la infección o efectos tóxicos sobre el epitelio. Tenga en cuenta que la solución isotónica fisiológica se debe utilizar para el lavado durante la endoscopia, como soluciones hipotónicas, tales como agua, causa cambios con el blanqueamiento y la contracción de la mucosa en ratones si el uso durante períodos prolongados (Ver asteriscos en la Figura 6).

0. Normal. Grandes y pequeños vasos sanguíneos de los dos puntos y las vísceras de los alrededores son claramente visibles. Mueva el endoscopio ligeramente (de ida y vuelta, reloj / antihorario). Grasa mesentérica Blanco o contenido oscuro de otras vísceras también se pueden observar.
1. Los barcos pequeños son parcialmente invisible, pero los grandes vasos son visibles.
2. Pequeño Vessels son invisibles y los grandes vasos no están claras. La mucosa no aparecer engrosada.
3. Engrosamiento aparente de la pared intestinal y / o edema de la mucosa / generalizada. Los vasos sanguíneos no son visibles. Pocos vasos distendidos / varicosas pueden ser visibles en algunos casos.

3. Sangrado de las mucosas: Diferenciar contacto sangrado de sangrado espontáneo. Procedimientos endoscópicos estándar de rutina en ratones sanos no deben inducir sangrado. Si hay inflamación, el aumento de la vascularización de la mucosa y fragilidad de los tejidos puede conducir a la erosión de la mucosa y sangrado. No hay necesidad de raspar intencionalmente el colon para evaluar este parámetro.

0. Normal, no hay sangrado.
1. Sangrado Contacto común. Esta hemorragia traumática se define como el sangrado de contacto, sino que debe ser juzgado sólo después de retirar el endoscopio.
2. No aplicable. Intencionalmente no asignadas a la fuerza al examinador decidir la nature de sangrado.
3. El sangrado espontáneo, que se define como una hemorragia no traumática y de origen natural que se observa como el endoscopio entra en el colon. A veces, la insuflación de aire induce hemorragia espontánea durante la colitis severa.

4. Las lesiones focales: Para dar cabida a la naturaleza irregular e imprevisible de las enfermedades colorrectales, este sistema de puntuación integrado permite la clasificación para la presencia de lesiones focales (sobre todo ulcerosa en la naturaleza) por la gravedad de la inflamación. Dado que el colon es un segmento tubular corto, recto en ratones, se ha considerado innecesaria para describir la localización de las lesiones. En lugar de ello, el número de lesiones se registran y se añade a la puntuación total usando el sistema de identificadores decimales. Sin embargo, si se necesita énfasis en la localización de las lesiones, tenemos una opción llamada 'distal-proximal endoscópica Colitis Scoring System' (D-PECS) se describe a continuación en la sección F. Otras aplicaciones pueden ser racionalizadosderivado de nuestro sistema de calificación decimal. Debido a que los tumores rara vez existen sin inducir algún tipo de inflamación en la región colorrectal en ratones, hemos incluido tumores en la sección de identificadores decimales para permitir únicamente el estudio de tumores en el contexto de la salud intestinal (ver más abajo).

0. Normal, sin lesiones focales.
1. Áreas bien definidas de pequeña elevación plana cubiertas por mucosa normal observaron. El objetivo es resolver las áreas edematosas locales o áreas potenciales de infiltración / proliferación celular, tal como se encuentra en la colitis leve.
2. Enrojecidos o zonas erosivas observadas.
3. La ulceración o estenosis. Las úlceras se identifican por el enrojecimiento y la deformidad (bordes irregulares con evidencia de vascularización anormal), debido a la reparación de heridas edematosa o fibrótico. NBI endoscopia es útil para diferenciar la detección o la observación de ulceraciones. Las estenosis se reconocen como zonas anormalmente estrechos, circulares o irregulares y estáticas en la forma, que no tienen contrato o se expanden a medida exesperado. A menudo estenosis implican áreas de criptas mucosas anormales, o vellosidades en el íleon. En el caso de los endoscopios flexibles (diámetro exterior = 3,3 mm) la incapacidad cuidado para avanzar en el ámbito de aplicación a las zonas más proximales del colon se ha asociado consistentemente con estenosis anormales verificadas post-mortem.

B. tablas de tumor para el lugar de grabación, el tamaño y número

1. Mapa del colon virtual: El mapa es una imagen virtual de la perspectiva de colon distal y el recto que se hace por corte de la parte superior del lumen (0 °) y rodar hacia fuera. La parte superior e inferior de la tabla se asignan proximal del colon (flexión) y el ano, respectivamente. La línea central (180 °) indica la parte inferior del lumen (aspecto ventral de animales), y mitades derecha e izquierda de los semicírculos indican la derecha y la izquierda de la pared del lumen. El mapa se puede utilizar para describir la ubicación y el tamaño horizontal de tumores, asícomo ulceraciones.

2. Números de tumor para cada grado de ocupación del tumor: Aunque el mapa del colon proporciona sólo información de dos dimensiones, el grado en que los tumores crecen en la luz intestinal es una característica importante de los tumores, ya que la protrusión puede causar estenosis u obstrucción intestinal. Para capturar esta información, hemos añadido un gráfico de grabación para ciento protrusión hacia la luz que documenta el número de tumores en cada rango de porcentaje, lo que permite una perspectiva tridimensional para evaluar la extensión de los tumores de colon.

Identificadores C. decimales para hacer puntuaciones numéricas significativa y por la vía rápida los casos pertinentes

Nuestro sistema de puntuación utiliza un novedoso sistema identificador decimal para registrar la presencia de lesiones o complicaciones relevantes. Estos identificadores son para fines descriptivos y se pretende facilitar la interpretación de una partitura y de vía rápida numéricos casos de interés endoscópica. Sin embargo, también sirven para numéricamente peso tipos predominantes de las lesiones, y permitir la generación de conjuntos de datos susceptibles de estadísticas paramétricas. Cuando se utiliza la forma de puntuación desarrollado, marque las lesiones, según corresponda, y elegir un identificador decimal que se añade a la puntuación inflamatoria.

0. No hay resultados especiales.
1. Fístula perianal, o inflamación perianal excesiva, prolapso rectal.
2. Principalmente lesiones erosivas con afectación de la pared de menor importancia.
3. Lesiones ulcerosas Sobre todo, algunos cubiertos con la fibrina, sangrado o grandes, con formas irregulares debido a la coalescencia de las úlceras pequeñas (el número de úlceras se puede registrar como 0.301 por un tumor, 0.302 para dos tumores, 0.311 durante once tumores, etc.).
4. Estenosis intestinal (opcional porque la estenosis es una complicación inflamatoria severa en la colitis, añadir 2 puntos a la puntuación inflamatoria total).
5. Placa bien definida (tejido grueso / no transparente dentro de la pared intestinal, por ejemplo & #160; un tumor de bajo altura plana). El número de placas se puede grabar como se describe para las lesiones (es decir, 0.401, 0.402, ... 0.411, etc.). Pueden aparecer como una superficie no plana expansible que puede parecer para sobresalir hasta aproximadamente 5-10%, lo que modifica la apariencia circunferencial de la luz intestinal.
6. Sobresaliendo masa o lesión tumoral. El número de masas se puede grabar como se describe para las lesiones (es decir, 0.601, 0.602, ... 0.611, etc.). Ellos son el abultamiento claramente, pero pueden aparecer plana pero que sobresale> 15% de la circunferencia distendido de la luz intestinal.
7. Inducida lágrima / perforación durante la endoscopia.
8. La muerte de los animales durante la endoscopia.
9. Otro: _____________ (por ejemplo severa colitis endoscópica proximal, distal-proximal ver endoscópica Colitis sistema de puntuación de más abajo).

D. Ejemplos y aplicaciones

El sistema de puntuación de la endoscopia murino se presenta en este documento es specifically diseñado para integrar la recopilación y análisis de datos sobre la inflamación del colon y los tumores colorrectales. Con respecto a los tumores, los datos se pueden analizar utilizando múltiples enfoques estadísticos, incluyendo el área bajo la curva, mediana, modo, o análisis de componentes principales. A nivel individual, el sistema de puntuación puede ayudar a los investigadores monitorear la salud del colon en un solo ratón con el tiempo. Después de resumir los resultados parciales inflamatorias y luego el identificador decimal correcto para el tipo y el número de lesiones en su caso, la puntuación total permitirá a los investigadores para cuantificar numéricamente el grado de inflamación del colon, el tipo más predominante de la lesión, y el número de lesiones. Por ejemplo, una puntuación de 12.609 indica que este ratón tiene inflamación colorrectal grave y nueve sobresale masas tumorales, un ratón sano con una región perianal normal y mucosa colorrectal que se ha perforado durante la endoscopia tendría una puntuación total de 0,7. El sistema identificador decimalpermiten a los investigadores para catalogar y buscar fácilmente repositorios de datos grandes de ratones obtenidos. Por ejemplo, un investigador podría establecer criterios de búsqueda para identificar todos los puntajes que terminan en "0.6" y recuperar todos los casos que tienen tumores que sobresalen. Más ejemplos se ilustran en las figuras S1-S3.

Sistema de puntuación de colitis endoscópica E. distal-proximal (D-PECS)

Se trata de una modificación opcional de nuestro sistema de calificación decimal identificador para diferenciar los casos con colitis extensa severa / proximal. Debido a que los signos endoscópicos de colitis y tumores de colon en ratones parecen desarrollarse sistemáticamente en los segmentos distales del colon se recomienda:

• Para anotar los dos puntos siguiendo los criterios expuestos, prestando especial atención a los dos tercios distales del colon e ignorar el segmento proximal si es aparentemente sano. Esto evita la confusión y aumenta el poder discriminatorio de endoscopia para diferencialanimales ciar con varios grados de colitis extensa.
• Si se observan cambios inflamatorios o tumorales en el tercio proximal, se recomienda añadir un punto a la puntuación total (1,0) y asignar el identificador decimal como '0 0.9 - Los demás, 'que podría ser etiquetado como severa colitis endoscópica proximal. Trace los hallazgos en la red mapa y gráfico de barras.
• Observar a los animales que tienen anormalidades endoscópicas en el tercio proximal del colon. Preste atención especial post mortem, como la enfermedad puede ser inusualmente severo o puede extenderse más allá del ángulo esplénico hacia el colon proximal.
• Si se sigue esta recomendación, registre este enfoque en la sección "observaciones" del formulario de evaluación, y de seguir esta tendencia a través de experimentos. Para citar este artículo en su publicación final que la evaluación se llevó a cabo después de nuestro "sistema-distal proximal endoscópica de puntuación colitis 'o D-PECS, que va desde 0 hasta 13,9. Tenga en cuenta que esta modificación no tiene s efecto tatistical sobre nuestro sistema de puntuación si se usa en animales sin colitis extensa proximal / grave.

Figuras Complementarios.

Figura s1. Ejemplo de la evaluación endoscópica de un ratón con un tumor colorrectal. Los animales fueron tratados con OMA y DSS endoscopia previa. A) Imagen de Representación en el modo normal y el NBI, respectivamente. B) Forma de puntuación llena de hallazgos endoscópicos. Tenga en cuenta que aunque hay dos hallazgos relevantes, el investigador decidió asignar el identificador decimal 0.6 basado en la severidad clínica y los objetivos de la investigación. Una variedad de análisis estadístico paramétrico puede llevarse a cabo con los datos registrados en el 'Mapa de Tumores / úlceras "y el" Registro de protuberancias tumorales gráficos. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura s2. Ejemplo de un ratón con una estenosis del colon y una complicación endoscópica. Nota el estrechamiento de la luz intestinal y que un nonperforating, desgarro de la mucosa fue inducida durante la endoscopia justo distal a la estenosis sitio. El estrechamiento y debilitamiento del colon inflamado puede resultar en desgarros de la mucosa. El animal estaba bajo anestesia general. Tenga en cuenta que el sistema de puntuación que nos ha permitido controlar y reducir las complicaciones del procedimiento. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura S3. Ejemplo de curso temporal de la inflamación y la puntuación endoscópica en un ratón tratados con DSS. Tenga en cuenta que los números pueden explicarse por sí mismo e indican que la inflamación del colon avanzado (de 1-5 y 8), y que erosiones desarrollados por día 8 (decimal 0,2 ) y úlceras por día 11 (decimal 0,3). Haz click aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Hay varias consideraciones respecto a la modificación y la resolución de problemas de la técnica endoscópica en ratones. Aspectos críticos del procedimiento que tiene que ser dominado durante el uso de la endoscopia flexible incluyen el ajuste del volumen de aire necesario para evitar la distensión abdominal y el compromiso respiratorio del ratón, y los aspectos técnicos de menor importancia del control de vista de la coordinación de los controles de angulación y torque . El control de par es importante reducir al mínimo el riesgo de perforación intestinal. Cuando se maneja adecuadamente, endoscopia flexible murino se convierte en un procedimiento muy seguro y rápido que permite la visualización directa y toma de biopsias de las zonas intestinales de interés para la investigación.

Para resolver vista obstrucciones debido a la materia fecal (Figura 5), es importante entender que los pellets fecales se observan por lo general incluso después de un ayuno o el uso de laxantes. Cuando está presente, las heces se pueden mover fácilmente proximal con ins aire suavesufflation. En aproximadamente 11% de los casos, es necesario utilizar también 1 ml de PBS enema. Antes de realizar el enema, tenga cuidado al examinar los animales que parecen tener la distensión abdominal o que están embarazadas. Para los movimientos peristálticos, es importante esperar unos segundos hasta que la onda peristáltica pasa desde la insuflación de aire no se detiene la peristalsis.

Hasta la fecha, la mayoría de los sistemas de evaluación endoscópicos utilizados para evaluar la enfermedad intestinal murino son específicos, ya sea para la colitis o cáncer. Dado que estos dos padecimientos se presentan de forma concomitante y pueden interactuar con otros, un sistema de puntuación estandarizado que tiene en cuenta tanto la inflamación y la formación de tumores facilitaría enormemente la comunicación interdisciplinaria, mejorando así la capacidad de uso de la información obtenida durante la investigación gastrointestinal por los investigadores del cáncer, y viceversa. Debido a que rara vez existen tumores sin inducir alguna forma de alteración inflamatoria en la región colorrectal iN ratones, se han incluido los tumores en la sección de identificadores decimal de nuestro sistema de puntuación para permitir únicamente el estudio de tumores en el contexto de la salud intestinal. Para mejorar la validez y fiabilidad del sistema de puntuación y facilitar su uso en experimentos a largo plazo o ensayos clínicos, también desarrollamos un modelo de informe estandarizado para utilizar junto con el sistema de puntuación (Figura 2), que almacena de forma sistemática los elementos de datos necesarios para calcular las puntuaciones murinos de inflamación intestinal, basados ​​en definiciones precisas para cada criterio de clasificación.

La disponibilidad previa de múltiples sistemas de puntuación endoscopia murinos de validez limitado dificulta la interpretación de los resultados entre los estudios. Para minimizar la confusión que experimenta el personal de laboratorio para decidir qué publicó método a utilizar, se recomienda la realización de la evaluación endoscópica con criterios que pueden inferirse a partir de imágenes bidimensionales (por ejemplo, evitar criterios that se refieren a la textura o consistencia - de las heces;. notar que algunos ratones incluyendo sin gérmenes pueden tener deposiciones blandas), y que no son co-lineal (es decir, que son fisiológicamente y temporalmente impulsado por el mismo contexto inflamatorio) Debido a que los signos cardinales de la inflamación son secuenciales debido cronológica eventos inflamatorios, le recomendamos los siguientes criterios: 1) transparencia intestinal, primero descrito por Becker et al ^4, como un reflejo de espesor de pared, 2) sangrado, como un indicador de la mucosa y la integridad de los vasos sanguíneos. ; 3) las conclusiones perianales, como un indicador de la integridad del colon y la irritación de la piel o de la predisposición a la inflamación excesiva, y 4) las lesiones focales, para calificar la gravedad de las lesiones inflamatorias (que son en ratones principalmente ulcerosa). Hasta la fecha, no hemos visto las lesiones tumorales en los modelos típicos de 3% inducida por DSS murino colitis. El sistema de puntuación endoscópica murino se describe en este documento se ofrece por primera vez, a nuestro conocimientoun mecanismo cuantitativo para la evaluación de la presencia y la inducción de las lesiones tumorales en el contexto de la inflamación del colon.

Por primera vez, también destacamos la importancia de incluir restricciones como parámetro durante la endoscopia murino, ya que parecen estar presentes comúnmente en ciertos modelos animales de inflamación intestinal, por ejemplo SAMP / Yit / Fc. Las estenosis representan (semi) las zonas periféricas de la submucosa inflamación crónica, con pérdida de elasticidad intestinal debido al aumento de la fibrosis, que son difíciles de evaluar endoscópicamente para el principiante. Hemos observado en ratones afectados por estenosis endoscópicamente definidos, que no es más la inflamación en segmentos que son proximal a la estenosis, en comparación con los segmentos distales (que pueden ser examinados endoscópicamente), probablemente debido a tránsito intestinal lento. Para fines de investigación, es recomendable hacer un seguimiento de animales histológicamente al final de experimentos para caracterizar mejor la inflamaciónrespuestas proinflamatorias que flanquean las regiones estenosis candidatos.

Sin una formación adecuada y la retroalimentación de expertos, cualquier sistema de puntuación puede tener la variabilidad en un momento dado. Es importante hacer hincapié en que los procedimientos de formación endoscópicos realizados en ratones deben ser controlados por un veterinario entrenado de profesional de la medicina para asegurar: i) la capacitación adecuada de los otros científicos o técnicos, y ii) para asegurar que los animales no son mal diagnosticados o inadvertidamente heridos durante la procedimiento. Consulte con el veterinario a cargo de su centro de investigación animal para el asesoramiento de expertos antes de proceder a aplicar este procedimiento para garantizar las mejores prácticas y el bienestar animal. Es aconsejable controlar rutinariamente el rendimiento de endoscopistas entrenados. Utilice las imágenes que hemos presentado en este documento como guía, aleatoriamente el orden en que se evalúan los animales, y evaluar a todos los animales de una manera ciega. Consulte las definiciones de los parámetros y los criterios de protocolo periódicamente y kEEP ellos en la mano durante la endoscopia y la puntuación Sección 6).

En resumen, como un equipo de gastroenterólogos médicos y veterinarios, se presenta un protocolo estandarizado y un sistema semicuantitativo de puntuación para la evaluación endoscópica de los modelos murinos de colitis y tumores. Estas herramientas de investigación permitirán a los investigadores a realizar endoscopias rutinarias murinos, y permitirán que el personal de investigación en todos los niveles de experiencia para generar medidas reproducibles y comparables de la inflamación intestinal y la formación de tumores a través de los laboratorios y entre las disciplinas. Hemos desarrollado el sistema para producir resultados numéricos significativos con alta validez, y siempre que las capacidades para el seguimiento rápido de los resultados concretos, que pueden ser adaptables para uso interno de los laboratorios individuales. También describe una alternativa de puntuación discriminatoria que tenga en cuenta las diferencias en la susceptibilidad a la enfermedad regional dentro de los dos puntos (véase la sección E, ̵6; sistema de puntuación de colitis endoscópica distal-proximal, el acrónimo D-PECS). El formulario de informe de datos y algunos datos pueden ser utilizados como carteles en las paredes para ayudar a los científicos sin experiencia (Figuras 1, 3, 5, 6). La implementación exitosa de la endoscopia murino depende de familiarizarse con la anatomía normal de la unión mucocutánea en el ano, el recto, el colon, y las vísceras de los alrededores, ya que las diferencias anatómicas en cuenta las diferencias sutiles endoscópicos ^17.

Aunque en la actualidad, incluso las tecnologías endoscópicas más pequeñas, más flexibles y más finas no pueden llegar al colon proximal in vivo, se mueve rápidamente los avances tecnológicos en el campo de la cápsula y la endoscopia sola fibra pueda estar disponible para los ratones en un futuro próximo. El protocolo estandarizado y el sistema de puntuación endoscópica presenta en este documento representan valiosas herramientas para visualizar y evaluar el estado del medio ambiente intestinal murino de animales vivos. Estas herramientas se facilicomparabilidad tate de los resultados entre los papeles y en todas las disciplinas, y tendrá aplicabilidad a las nuevas y emergentes tecnologías endoscópicas murinos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System