La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio
Summary
Abbiamo sviluppato un modello in vitro che imita un componente importante della risposta infiammatoria acuta durante l'infezione della vescica con uropatogeni Escherichia coli. Il transuroepithelial test di migrazione dei neutrofili consente la valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili umana attraverso vescica epiteli, coltivate su supporti permeabili, in risposta a infezioni batteriche o di sostanze chemoattractant.
Abstract
Il reclutamento di cellule immuni dalla periferia al sito di infiammazione è un passo essenziale nella risposta immunitaria innata in qualsiasi superficie mucosa. Durante l'infezione della vescica urinaria, leucociti polimorfonucleati (PMN; neutrofili) migrano dal sangue e attraversano l'epitelio vescicale. Mancata soluzione infezione in assenza di una risposta neutrofila dimostra l'importanza di PMN in difesa vescica. Per facilitare la colonizzazione dell'epitelio vescicale, uropatogeni Escherichia coli (UPEC), l'agente eziologico della maggior parte delle infezioni delle vie urinarie (IVU), smorzare la risposta infiammatoria acuta utilizzando una varietà di meccanismi parzialmente definiti. Per approfondire l'interazione tra ospite e patogeno batterico, abbiamo sviluppato un modello in vitro di questo aspetto della risposta immunitaria innata di UPEC. Nel transuroepithelial saggio migrazione dei neutrofili, una variazione sul camera di Boyden, epith vescica coltaElial cellule sono coltivate a confluenza sul lato inferiore di un supporto permeabile. PMN sono isolate da sangue venoso umano e vengono applicati al lato basolaterale degli strati di cellule epiteliali della vescica. Migrazione PMN rappresenta la direzione basolaterale-to-apicale fisiologicamente pertinente in seguito a infezione batterica o molecole chemiotattici viene enumerato con un emocitometro. Questo modello può essere utilizzato per analizzare le interazioni tra UPEC e cellule eucariotiche nonché per interrogare i requisiti molecolari per l'attraversamento di vescica epiteli da PMN. Il modello di migrazione dei neutrofili transuroepithelial sarà ulteriormente la nostra comprensione della risposta infiammatoria iniziale UPEC nella vescica.
Introduction
Il movimento delle cellule in tutto il corpo, spesso su lunghe distanze, è necessaria per la crescita e lo sviluppo, la guarigione della ferita, e la risposta immunitaria. La migrazione cellulare è complesso e richiede il coordinamento di molti processi diversi, tra cascate di segnalazione e il riassetto dei componenti del citoscheletro. Le cellule possono muoversi in modo casuale (chemochinesi) così come verso gradienti chimici definiti (chemiotassi). Molte tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione delle cellule in vitro. La più antica e più comune tecnica, la camera di Boyden, costituito da un sistema a due camera verticale quando una sostanza chemiotattico viene posta nella camera inferiore e cellule di interesse vengono inseriti nella camera superiore 1. Il movimento delle cellule attraverso il filtro permeabile, con pori di dimensioni definite, che separa le due camere è monitorato. Altre tecniche sono state sviluppate per studiare la migrazione cellulare, compresa la camera Zigmond 2 e la camera di Dunn3. Questi approcci collettivi hanno dato una visione significativa nel movimento di molti tipi cellulari diversi.
Oltre a interrogare i principi fondamentali della chemochinesi e chemiotassi, saggi a due camere hanno facilitato l'indagine della migrazione cellulare attraverso componenti della matrice extracellulare e di entrambi gli strati di cellule endoteliali ed epiteliali. Un vantaggio dei sistemi a due camere su altre tecniche è che la membrana porosa può essere rivestito con proteine come il collagene o fibrinogeno e migrazione cellulare attraverso una barriera a matrice extracellulare può essere valutata. Inoltre, linee cellulari coltivate possono essere coltivate e differenziati sui supporti permeabili. Per studiare il movimento delle cellule attraverso una barriera endoteliale, cellule endoteliali coltivate vengono seminate e coltivate nel serbatoio superiore dei supporti permeabili. Cellule mobili, come le cellule immunitarie, vengono aggiunti al serbatoio superiore e la migrazione nel serbatoio inferiore di tutti i enbarriera endoteliale in direzione apicale a basolaterale fisiologica viene osservata. Questo modello è stato prezioso per comprendere stravaso di cellule immunitarie dal flusso sanguigno. In contrasto transendoteliale migrazione, il movimento delle cellule attraverso una barriera epiteliale verifica in genere nella direzione basolaterale-to-apicale. Per modellare questi eventi in vitro, i ricercatori seme e crescono cellule epiteliali coltivate sul lato inferiore dei supporti permeabili. Cellule mobili vengono aggiunti al serbatoio superiore e la migrazione attraverso la barriera epiteliale, che rappresenta la direzione basolaterale-to-apicale, viene monitorato. Tali modelli di migrazione transepiteliale hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione delle risposte infiammatorie a superfici mucose, in particolare quelli del polmone e intestino 4,5.
Al contrario, il traffico delle cellule immunitarie attraverso l'epitelio delle vie urinarie ha ricevuto molta meno attenzione. Per promuovere il nostro understanding delle risposte immunitarie innate nel tratto urinario durante l'infezione con uropatogeni Escherichia coli (UPEC), abbiamo sviluppato un test in vitro, la transuroepithelial test di migrazione dei neutrofili, che consente di indagine di leucociti polimorfonucleati (PMN, neutrofili) movimento attraverso una barriera epiteliale della vescica 6 -8. Come con altri modelli a due camere di migrazione transepiteliale, colture di cellule epiteliali umane della vescica sono coltivate sul lato inferiore di un supporto permeabile e formano strati epiteliali confluenti. Neutrofili umani, isolate da sangue venoso, vengono applicati sul lato basolaterale dello strato epiteliale, e migrazione attraverso l'epitelio nella direzione basolaterale-to-apicale fisiologicamente rilevanti viene quantificato in risposta a infezione con diversi ceppi di E. coli o la presenza di molecole chemiotattici. Molta ricerca era concentrata sul movimento dei neutrofili, sia chemochinesi e chemiotassi, in assenza di altri tipi di cellule. Il transuroepithelial neutrofili test di migrazione è vantaggioso in quanto tiene conto di complesse interazioni fra le cellule epiteliali della vescica e le cellule del sistema immunitario durante l'infezione. Questo trattabili modello in vitro ha il potenziale per consentire l'esame approfondito delle risposte immunitarie a superfici uroepithelial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando una linea di cellule epiteliali della vescica colta e preparata isolato PMN umani, abbiamo stabilito un modello in vitro di migrazione dei neutrofili transuroepithelial. Questo modello è stato determinante nel cominciare per analizzare la complessità della risposta immunitaria innata durante l'infezione del tratto urinario (UTI), un'infezione batterica molto comune in genere causata da UPEC 9. Durante l'infezione della vescica o cistite, assunzione di PMN al lume della vescica è…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) concede R01-DK080752 e P50-DK064540. Ringraziamo J. Loughman per il suo impegno nella creazione di questo saggio.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
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