Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität:<em> In-vitro-</em> Zwei-Neuron-Plastizität Assay
Summary
Neuronale Plastizität ist eine zunehmend erkannt, aber unzureichend verstanden Funktion des Magen-Darm (GI-Trakt). Hier im Beispiel der menschlichen Bauchspeicheldrüse, stellen wir einen in vitro-Assay Neuroplastizität für die Untersuchung der neuronalen Plastizität im GI-Trakt sowohl morphologischen und funktionellen Niveau.
Abstract
Neuroplastizität ist ein inhärentes Merkmal des enterischen Nervensystem und Magen-Darm-(GI) Innervation unter pathologischen Bedingungen. Allerdings bleibt die pathophysiologische Rolle der Neuroplastizität in GI-Erkrankungen bekannt. Neuartige experimentelle Modelle, die Simulation und Modulation der Neuroplastizität GI erlauben kann verbesserte Wertschätzung des Beitrags der Neuroplastizität insbesondere GI Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs (PCA) und chronischer Pankreatitis (CP) zu ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Simulation von Bauchspeicheldrüsen neuroplasticity unter in vitro Bedingungen mit neugeborenen Rattenhinterwurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) Neuronen. Diese Dual-Neuron-Ansatz ermöglicht nicht nur die Überwachung der beiden Orgel intrinsische und extrinsische-Neuroplastizität, sondern auch ein wertvolles Werkzeug, um neuronale und gliale Morphologie und Elektrophysiologie zu beurteilen. Darüber hinaus ermöglicht es funktions Modulation der mitgelieferten Mikroumgebungs Inhalte für das Studium ihrer impact auf Neuroplastizität. Einmal eingerichtet, ist die vorliegende Neuroplastizität Assay trägt das Potenzial, für das Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.
Introduction
Veränderungen im Magen-Darm-(GI) Nerven Morphologie und Dichte haben die Aufmerksamkeit der Gastroenterologen und Pathologen für eine lange Zeit gefangen, aber ihre Bedeutung für die Pathophysiologie der GI-Erkrankungen ist unbekannt 03.01. Tatsächlich sind mehrere hoch gemeinsamen GI-Erkrankungen wie Gastritis, Reflux-Ösophagitis, Kolitis, Divertikulitis, Appendizitis und mit erhöhter Innervationsdichte in entzündeten Gewebebereiche 1 zugeordnet. Es wurde jedoch keine echte Aufmerksamkeit bisher auf die Mechanismen und Bedeutung der Neuroplastizität im GI-Trakt bezahlt. Sie morphologisch veränderten GI Nerven unterscheiden sich von normalen GI Nerven, also der Normalzustand des enterischen Nervensystems, in ihrer Funktion? Was sind die Auswirkungen von veränderten Neuropeptid / Neurotransmitter Gehalt in magensaftresistenten Kunststoff Nerven? Hat peripheren Neuroplastizität immer bringen veränderte Signalisierung an das zentrale Nervensystem? Und wo sind die zentralen Projektionen der Kunststoff ExtriNSIC GI Nervenbahnen? Eine lange Reihe von Schlüsselfragen wie leicht, wenn man den Mangel an unserer Kenntnisse über die funktionalen Aspekte der Neuroplastizität GI erzeugt werden.
Die Studie von GI Neuroplastizität bei Funktionsebene erfordert gültige, reproduzierbare und noch leicht anwendbar experimentellen Modellen. In einer Zeit zunehmender Beliebtheit und Akzeptanz von gentechnisch bedingte Mausmodellen (GECoMM), wie in vivo-Einstellungen tragen das Potenzial, bisher unbekannte Facetten der GI Neuroplastizität in einer realistischen Art und Weise ein aufzuklären. Jedoch bleibt die Konstruktion und Produktion von GECoMM teuer, arbeitsintensiv und vor allem zeitaufwendig ist. Darüber hinaus erfordern sie die a-priori-Auswahl des Ziel bedingt in der genetisch veränderten Maus (z. B. transgene Überexpression von Nervenwachstumsfaktor / NGF in enterischen Epithelzellen) moduliert werden. Daher ist für die DESign einer erfolgreichen GECoMM, brauchen die Forscher einige Indikatoren (z. B. früheren experimentellen Daten) einer lohnendes Ziel, das heißt, dass das Molekül von Interesse (hier NGF) zumindest erwartet, dass einige biologisch relevante Auswirkungen auf die GI Nerven auszuüben.
Solche Indikatoren können leicht von in-vitro-Modellen, in denen ausreichende isolierten Zelltypen aus der komplexen Mikroumgebung eines In-vivo-System kann wahlweise in einem hetero Weise 4-7 kokultiviert werden, abgeleitet werden. Die Modulation des molekularen Targets in einer solchen heteroKulturEinstellung beträgt durchschnittlich technisch weniger aufwändig, schneller, und kann daher in der Vorfilterung lohnenswertes Ziel unterstützen zur Überprüfung in in vivo-Studien.
Kürzlich haben wir eine in-vitro-Assay Neuroplastizität, die entworfen wurde, um die erhöhte neuronale Dichte und Hypertrophie der intrapankreatischen ne simulierenRVE im menschlichen Pankreas-Krebs (PCa) und chronischer Pankreatitis (CP) Gewebe. Hier wurden Neuronen aus neugeborenen Ratten dorsalen Wurzelganglien (DRG) und Plexus myentericus (MP) abgeleitet wird, um Gewebeextrakten von chirurgisch entfernten PCa oder CP Geweben Proben belichtet und im Vergleich zu denen in normalen menschlichen Bauchspeicheldrüse (NP) Gewebeextrakte 5 kultiviert. Anstelle von Gewebeextrakten, kann man auch Zelllinie Stände, die Auswirkungen der ausgewählten Zelltypen auf Neuroplastizität zu studieren. Wenn eine standardisierte morphometrische Messungen kombiniert werden, kann der Test gültig präsentiert Neuroplastizität und reproduzierbaren Beurteilung von neuronaler Plastizität in Reaktion auf verschiedene pankreatischen Mikroumgebungen. Insbesondere ermöglicht es die Simulation 1) morphologische Neuroplastizität, dh die Änderungen in der Neuritenwachstum, Verzweigungsmuster und neuronalen Größe und 2) funktionelle Neuroplastizität, dh Veränderungen in der Erregbarkeit von peripheren Neuronen. Darüber hinaus sind nicht nur Peripheriegerät ( </em> Ente), aber auch zentral (zB DRG oder zweiter Ordnung Rücken) Neuronen können in der vorliegenden Assay auf ihre morphologischen und funktionellen Reaktion auf verschiedene Gewebe GI Inhalt bewerten einbezogen werden. In dem vorliegenden Video-Tutorial zeigen wir, das technische Protokoll für die Durchführung dieses Tests und diskutieren seine Vorteile und Schwächen. Darüber hinaus weisen wir auf die Anwendbarkeit der Grundgedanke dieses Assays zum Studium der Neuroplastizität in jedem GI Orgel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll soll die Methodik hinter der in-vitro-Assay Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität, die kürzlich von unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde, um die Mechanismen der Neuroplastizität bei PCa und CP 5 studieren zu veranschaulichen. Das Protokoll beinhaltet einen dreitägigen Prozedur, die leicht angewendet werden können, sobald die Darsteller hat ausreichende Erfahrung bei der Isolierung und Kultur von DRG-und MP-Neuronen gewonnen werden. Darüber hinaus stellt es ein wertvol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle Autoren trugen in Richtung der Etablierung und Validierung des vorgestellten Assay und dem Entwurf des Manuskripts.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
