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Simulación de páncreas Neuroplasticidad: Published: April 14, 2014 doi: 10.3791/51049
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Summary

Plasticidad neuronal es una característica de la (GI) tracto gastrointestinal cada vez más reconocido, pero insuficientemente entendida. Aquí, en el ejemplo de trastornos pancreáticos humanos, se presenta un ensayo de neuroplasticidad in vitro para el estudio de la plasticidad neuronal en el tracto GI, tanto a nivel morfológico y funcional.

Abstract

La neuroplasticidad es una característica inherente del sistema y gastrointestinal (GI) inervación nervioso entérico en condiciones patológicas. Sin embargo, el papel fisiopatológico de la neuroplasticidad en trastornos GI sigue siendo desconocido. Modelos experimentales novedosas que permiten la simulación y la modulación de la neuroplasticidad GI pueden permitir una mayor apreciación de la contribución de la neuroplasticidad en particular las enfermedades gastrointestinales, como el cáncer de páncreas (CP) y la pancreatitis crónica (PC). Aquí, se presenta un protocolo para la simulación de la neuroplasticidad de páncreas en condiciones in vitro utilizando recién nacido ganglios dorsales de rata raíz (DRG) y el plexo mientérico (MP) neuronas. Este enfoque de doble neurona no sólo permite la monitorización de tanto la neuroplasticidad-órgano intrínseca y extrínseca-, pero también representa una herramienta valiosa para evaluar la morfología neuronal y glial y electrofisiología. Además, permite la modulación funcional de contenidos microambientales suministrados por el estudio de su impact en la neuroplasticidad. Una vez establecido, el presente ensayo neuroplasticidad tiene el potencial de ser aplicable al estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.

Introduction

Las alteraciones en la gastrointestinal (GI) morfología del nervio y la densidad han llamado la atención de los gastroenterólogos y patólogos durante mucho tiempo, pero su relevancia para la fisiopatología de las enfermedades gastrointestinales se desconoce 1-3. De hecho, varios trastornos GI altamente comunes tales como la gastritis, la esofagitis de reflujo, la colitis, diverticulitis y apendicitis se asocian con el aumento de la densidad de inervación en áreas tejido inflamado 1. Sin embargo, hasta ahora no se ha prestado atención real a los mecanismos y significado de la neuroplasticidad en el tracto GI. ¿Los nervios GI morfológicamente alterados difieren de los nervios normales GI, es decir, el estado normal del sistema nervioso entérico, en términos de su función? ¿Cuáles son las implicaciones de la alteración del contenido de neuropéptido / neurotransmisor en los nervios entéricos de plástico? ¿Tiene la neuroplasticidad periférica siempre implica la señalización alterada para el sistema nervioso central? ¿Y dónde están las proyecciones centrales de extri plásticovías neurales GI NSIC? Una larga serie de tales preguntas clave se puede generar fácilmente cuando se mira a la escasez de nuestros conocimientos sobre los aspectos funcionales de la neuroplasticidad GI.

El estudio de la neuroplasticidad GI a nivel funcional requiere modelos experimentales válidos, reproducibles y todavía fácilmente aplicables. En una era de creciente popularidad y la aceptación de modelos de ingeniería genética condicionales de ratón (GECoMM), como en entornos in vivo tienen el potencial para dilucidar aspectos hasta ahora desconocidos de la neuroplasticidad GI de una manera realista 1. Sin embargo, el diseño y la producción de GECoMM sigue siendo costoso, laborioso y, sobre todo, requiere mucho tiempo. Además, requieren la selección a priori del objetivo a ser modulada condicionalmente en el ratón alterado genéticamente (por ejemplo, la sobreexpresión transgénica de factor de crecimiento nervioso / NGF en células epiteliales intestinales). Por lo tanto, para la design de un GECoMM éxito, los investigadores necesitan algunos indicadores (por ejemplo, datos experimentales anteriores) de un objetivo que vale la pena, es decir, que la molécula de interés (en este caso NGF) por lo menos se puede esperar para ejercer algunos efectos biológicamente relevantes sobre los nervios de GI.

Tales indicadores se puede derivar fácilmente de ser adecuada en modelos in vitro en la que los subtipos de células aisladas del complejo microambiente de un sistema in vivo se pueden cocultured selectivamente de una manera heterotípicos 4-7. La modulación de dianas moleculares en un ambiente de cultura tan heterotípica es, en promedio, técnicamente menos complicado, más rápido, y por lo tanto puede ayudar en el filtrado previo de las metas que valgan la pena para la verificación de los estudios in vivo.

Recientemente, presentamos un ensayo in vitro neuroplasticidad en el cual fue diseñado para simular el aumento de la densidad neuronal y la hipertrofia de ne intrapancreáticarves en el cáncer de páncreas humano (PCA) y pancreatitis crónica (PC) tejidos. Aquí, las neuronas derivadas de recién nacido dorsal de rata ganglios de la raíz (DRG) o plexo mientérico (MP) se expusieron a extractos de tejido de CaP resecado quirúrgicamente o CP tejidos muestras y se compararon con las cultivadas en el páncreas humano normal (NP) extractos de tejido 5. En lugar de extractos de tejidos, también se puede utilizar sobrenadantes de líneas celulares para estudiar el impacto de los tipos de células seleccionadas en la neuroplasticidad. Cuando se combina con una medición morfométrica estándar, el ensayo de la neuroplasticidad presentado permite la evaluación válida y reproducible de la plasticidad neuronal en respuesta a diferentes microambientes pancreáticas. Particularmente, se permite la simulación de 1) la neuroplasticidad morfológico, es decir, los cambios en el crecimiento de neuritas, el patrón de ramificación y tamaño neuronal, y 2) la neuroplasticidad funcional, es decir, alteraciones en la excitabilidad de las neuronas periféricas. Por otra parte, no sólo periférica (es decir (por ejemplo DRG o segundo médula orden) las neuronas se pueden incluir en el presente ensayo para evaluar su reacción morfológica y funcional a diferentes contenidos de tejido GI. En el presente video tutorial, se demuestra el protocolo técnico para la realización de este ensayo y se discuten sus ventajas y debilidades. Por otra parte, llamamos la atención sobre la aplicabilidad de la noción básica de este ensayo para el estudio de la neuroplasticidad en cualquier órgano GI.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales con animales en el protocolo siguen las pautas de cuidado de animales de Technische Universität München, Alemania.

1. Medios / Extracto de Preparación

  1. Homogeneización de tejidos
    La calidad de la homogeneización del tejido es fundamental para la posterior detección de alteraciones de plasticidad en las neuronas cultivadas. Aquí, se recomienda un homogeneizador que permite la disociación de tejido sin gran aumento en la temperatura del tejido.
    1. Transferencia de 5 mm x 5 mm x 5 mm cubos de tejido pancreático directamente desde -80 º C en nitrógeno líquido y coloque en una fase sólida en el homogeneizador de tejidos. El homogeneizador ideal sería disociar el tejido lo suficientemente rápido, sin que llegue a descongelar la imagen.
    2. Inmediatamente después de la disociación, resuspender el, homogeneizado de tipo polvo sólido en 300-500 l de 0,1 x de buffer fosfato salino (PBS). En este caso, no utilice ningún buffer de lisis (como RIPA), ya que esto puede lisar las neuronas.
    3. Se centrifuga el homogeneizado durante al menos 15 minutos a la velocidad máxima de su centrífuga de mesa (por ejemplo, 21.130 xg). Recoger el sobrenadante claro que representa el extracto de tejido.
  2. Sobrenadantes línea celular
    1. Deje que las células de interés alcancen al menos el 70 - 80% de confluencia en medio de crecimiento normal.
    2. Por lo general, estos medios contienen los componentes del suero y pueden ejercer efectos incontrolables sobre el crecimiento neuronal. Por lo tanto, después de alcanzar la densidad celular deseada, lávese las células por lo menos 3 veces con PBS grado de cultivo de células y colocarlas en un medio libre de suero (SFM) para un máximo de 48 horas.
      Nota: Aquí, consideran que algunas células (como las células estrelladas pancreáticas) pueden necesitar suero en su medio de crecimiento con el fin de mantener su estado y estructura normal. En tales casos, realizar diluciones seriadas de suero en el medio de la célula de interés con el fin de encontrar el contenido más bajo posible de suero necesaria para funcio célula intactan.
    3. Medir la concentración de proteína del homogeneizado de tejido o sobrenadantes de células a través de ensayo de proteínas de Bradford. Mientras que estos valores varían dependiendo del tejido y tipo celular, para los extractos de tejido pancreático, uno podría esperar un intervalo de concentración entre 5-12 g / l, y para sobrenadantes de líneas celulares entre 3-8 g / l.

2. Extractos alícuotas y sobrenadantes celulares

Dependiendo de la concentración para ser utilizado en el ensayo, la concentración final del extracto sobrenadante o en el medio neuronal debe ser de 100 mg / ml de 5,8.

Nota: Para un ensayo con las neuronas crecen en 500 l de medio en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, se necesita 50 g de proteína de cada extracto o sobrenadante por pocillo. A una concentración de extracto típico de alrededor de 10 g / l, se necesitaría 5 l de extracto / sobrenadante de cada pocillo. En cada setting realizado como triplicado, esto correspondería a 15 l de extracto / sobrenadante. Para tejidos o de células diferentes tipos, realizar diluciones en serie del extracto final o la concentración de sobrenadante y comparar los efectos neurotróficos observadas entre las diferentes concentraciones de extracto / sobrenadante.

3. Aislamiento de Neuronas

Una vez que la recolección de extraer / sobrenadante está terminado, continuar con el aislamiento de las neuronas.

  1. Para las neuronas DRG, recoger el cuello uterino para lumbar DRG de ratas recién nacidas entre el día postnatal (P) 2-12 después de la decapitación y disección estereomicroscópica de DRG (Figura 1A). Con el fin de tener las neuronas DRG suficientes para una placa de 24 pocillos, recoja toda la cervical a lumbar DRG de una rata recién nacido (que equivale a 52 DRG) por plato.
    1. Recorte el periférico (nervios) y las proyecciones centrales (raíces) de DRG a través de micro tijeras.
      Dejando las proyecciones en el lugar impide la trituración y aumenta tque la contaminación del riesgo de la cultura por los fibroblastos.
  2. Para neuronas MP, cortar el mesenterio del intestino delgado y manualmente y tira con cuidado la capa de seromuscular del intestino delgado (para un protocolo detallado en el aislamiento MP, consulte Schäfer et al. 9, Figura 1B). Para MP, recoger el plexo de dos ratas por 24 pozos de la placa.
    Nota: Trate de ser lo más suave posible para evitar roturas en la capa seromuscular ya que impiden el éxito de su separación del intestino delgado.
  3. Recoger el DRG y la capa seromuscular en medio esencial mínimo enfriado con hielo (MEM) suministrado con gentamicina (20 mg en un medio de 500 ml) y metronidazol (2,5 mg en 500 ml de medio).
  4. Tras la recogida de DRG, los incuban en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) suministrado con colagenasa de tipo II durante 20-30 min. Para el aislamiento MP, incubar en colagenasa tipo entre 1-3 horas, dependiendo de la edaddel animal (Figura 1C).
  5. Para MP, recoger las reticulares MP pedazos bajo microscopio estereoscópico y traslado al MEM helada.
  6. Luego se tritura el DRG y MP a través de jeringas con diámetro decreciente.
    Nota: trituración excesiva puede destruir las neuronas, pero menos que las células de la glia.
  7. Una vez que el medio que contiene el DRG o MP se ha convertido en nublado, centrifugar la suspensión a 93,9 xg durante 5 min, se elimina el medio y volver a suspender en medio Neurobasal (suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina y 2% B-27).
  8. Contar el número total de células (es decir, neuronas y células gliales) por medio de un hemocitómetro.
    Nota: El número de células necesarias depende del parámetro de medición. Para la cuantificación de la densidad de neuritas, uno necesita las culturas más densas y por lo tanto un mayor número de células que para la medición del crecimiento de neuritas, el tamaño perikaryonaly el patrón de ramificación de las neuronas individuales. Para mediciones de la densidad de neuritas, utilizar por ejemplo 10.000 células (neuronas glia +) / pocillo o 1500 neuronas / pocillo. Para la morfometría de las neuronas individuales, breve (1 minutos de duración) tripsinación de las células y la siembra de 2.500 células / pocillo o 400 neuronas / así se recomienda. El rendimiento típico de células obtenidas de una rata es de alrededor de 300.000-500.000 células.
  9. Seed las células en cubreobjetos de 13 mm que se han recubierto la noche anterior y arriba los pocillos con medio Neurobasal (suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0.5 mM de L-glutamina y 2% de B-27) (figura 1D).
    Nota: El uso de poli-D-lisina (40 mg / m 2) O-ornitina y laminina cubreobjetos recubiertos (1 mg / ml cada una) recubiertas. Las células se adhieren a poli-D-lisina extremadamente rápido, por lo que es adecuado para experimentos en los que se necesitan muchas células (es decir, medidas de densidad de neuritas). El apego a la laminina es de alguna generaleslo más débil, pero la laminina es un fuerte promotor del crecimiento de neuritas. Por lo tanto, para mediciones en la ramificación neuronal y la longitud de las neuritas, prefieren ornitina / laminina-recubrimiento.
  10. Permitir que las células se adhieren a los pozos durante la noche. Al día siguiente, la preparación de los medios de comunicación de extracto suplementado (a una concentración de extracto / sobrenadante final de 100 g / ml).
  11. Aspirar el medio de siembra, y realizar una, de lavado muy suave opcional con PBS, y luego lentamente pipetear los medios de comunicación extracto / sobrenadante suplementado (Figura 1E).
  12. Deje que las células crezcan durante 48 horas. Aspirar los medios de comunicación y fijar en el 4% paraformaldehido durante inmunotinción (Figura 1F).
  13. Realice doble tinción de inmunofluorescencia usando específica de neuronas (por ejemplo, beta-tubulina III) y específica glia (por ejemplo glial fibriallary proteína ácida / GFAP) marcadores (Figura 1G).
  14. Para la morfometría, use un microscopio de luz invertido equipado con una cámara CCD en combinación with software automatizado que permite la medición de la densidad de axones (véase el cuadro).
  15. La densidad de axones de cultivos neuronales se mide en 4-5 microfotografías representativas a 200 aumentos de 4 regiones diferentes de crecimiento más denso en cada cubreobjetos mediante la superposición de un 50 micras x 50 micras rejilla y contar la densidad de las fibras por metro cuadrado medido en las fibras de intersección. El crecimiento de neuritas, número de ramas por neurona significa, la longitud de la rama media y tamaño perikaryonal se pueden medir de seleccionados al azar 30 neuronas solitarios de cada cubreobjetos mediante el marcado de las neuritas y perikarya (Figura 1H).

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Representative Results

Neuroplasticidad morfológica

En el rango de edad indicado de ratas recién nacidas (P2-12) y las densidades de siembra, MP y DRG neuronas ya construir densas redes neuronales después de 48 horas (Figura 2A). Comparación de la densidad de axones entre las neuronas cultivadas en el CP, CP y sus extractos NP revela una mayor densidad de axones de las neuronas DRG en el CP o extractos del PP que en los extractos NP (Figura 2A) 5. Particularmente preferimos neuronas MP para mediciones en las neuronas individuales, ya que las neuronas MP tienden a disociar más fácilmente de células gliales rodean que las neuronas DRG. Aquí, las neuronas MP cultivadas en extractos de CaP o CP también construyen neuritas más largas y exhiben un patrón de ramificación más complejo que las neuronas MP crecer en medio NP-extracto que contiene (Figura 2B) 5. La ausencia de esta diferencia en la morfología neuronal inducida por NP, CP, y CaP extrae indica un problema técnico en la unassay. En la mayoría de los casos, esto puede ser debido a 1) la mala calidad del extracto preparado debido al largo tiempo de procesamiento o 2) debido al daño a las neuronas que se produjeron durante el proceso de aislamiento.

Estudios funcionales

El ensayo de la neuroplasticidad lleva alta sensibilidad suficiente para detectar inducidos por la presencia o ausencia de ciertas moléculas diana de interés en los extractos o sobrenadantes suplementados alteraciones. Por ejemplo, el bloqueo de la artemina o factor de crecimiento del nervio factor neurotrófico de células CaP (PCC) sobrenadantes mediante la adición de anticuerpos de bloqueo específicos para NGF o por el agotamiento inducido por Dynabead-de los resultados de la artemina en la atenuación de la formación de la red neuronal (Figura 2C) 10. En un estudio reciente, hemos podido demostrar un efecto muy similar para la contribución de la factor neurotrófico neurturina a la neuroplasticidad en CP en comparación simultánea con otros factores neurotróficos tales como NGF, gliales de células de línea-Derived factor neurotrófico (GDNF) o factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) 11.

Glia

El mismo enfoque se puede aplicar también para evaluar la reacción de las células de la glia satélite DRG-asociado o glía entérica al contenido microambientales pancreáticas. De hecho, uno de los efectos más potentes de extractos de tejido ACC a neuroglia asociado-MP DRG-o aumento es prominente en el crecimiento de la glía (Figura 3) 5. Además, este efecto es más pronunciado en el CaP que en CP. Aquí, se debe considerar que la proliferación de células gliales no debe ser juzgado en base a los recuentos de glia absolutos, sino más bien en la proporción relativa de células gliales que neuronas (células gliales-las neuronas-índice) 5. Esto es particularmente importante a considerar ya que el número de células de la glia en estos cultivos es más difícil de controlar debido a la potencia la proliferación de células gliales en oposición a las neuronas.


Figura 1. Esquema del protocolo del ensayo neuroplasticidad in vitro. El presente ensayo hace uso de los recién nacidos ganglios dorsales de rata raíz (DRG) y el plexo mientérico (MP), las neuronas para estudiar el impacto de los extractos de tejidos pancreáticos o sobrenadantes de células en la morfología neuronal y glial. DRG se recogen después de la laminectomía anterior y MP-capa que contiene seromuscular después de la resección y decapado mecánico del intestino delgado (A, B). Después de colagenasa tipo II digestión, las neuronas se sembraron en la densidad sea necesario (véase el texto para más detalles) anuncio cultivado durante 24 h (C, D). A continuación, se añaden el páncreas recién preparada (o de cualquier órgano IG de interés) extractos y sobrenadantes de células en el medio de crecimiento de las neuronas en concentraciones definidas previamente (E).Después de 48 horas, los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4% y doble immunostained contra marcadores neuronales y gliales (F, G). La morfología neuronal, incluyendo la densidad de axones, patrón de ramificación de los nervios y el tamaño perikaryonal se miden por medio de un protocolo de software estandarizado (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Neuroplasticidad inducida por el cáncer de páncreas humano de páncreas (CP) y la pancreatitis crónica (PC). Extractos Humanos tejido pancreático derivan quirúrgicamente de páncreas normal (NP), CP o tejidos con CaP inducir diferencias importantes en la densidad de las neuritas de DRG ne urons (A) y en el patrón de ramificación neuronal de las neuronas MP (B). Aquí, extractos de tejidos de CaP y CP ejercen un destacado efecto neurotrófico sobre las neuronas de DRG y MP. De manera similar a extractos de tejido, también los sobrenadantes de los tipos de células individuales (células de cáncer de páncreas aquí / PCC) también aumentan notablemente la densidad de las neuritas de neuronas DRG (C). Este aumento, sin embargo, es reversible cuando los factores neurotróficos seleccionados tales como artemina (ARTN) o factor de crecimiento nervioso (NGF) se agotan o comandos con estos sobrenadantes. Todas las neuronas inmunotiñeron contra la beta-III-tubulina. Todas las imágenes a un aumento de 100X. Haga click aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Reacción glial a los contenidos microambientales pancreáticas. Extractos de tejidos pancreáticos de CaP o tejidos CP no sólo tienen un efecto neurotrófico, sino también mejorar el crecimiento glial y el recuento de células gliales en los cultivos de DRG o MP. Células gliales inmunotiñeron contra la proteína marcadora glia glial fibrilar ácida (GFAP). Todas las imágenes en una ampliación de 200X. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El presente protocolo tiene por objeto ilustrar la metodología detrás del ensayo de la neuroplasticidad pancreática in vitro que fue desarrollado recientemente por nuestro grupo para estudiar los mecanismos de neuroplasticidad en el CP y CP 5. El protocolo consiste en un procedimiento de tres días que se pueden aplicar fácilmente una vez que el artista intérprete o ejecutante ha adquirido suficiente experiencia en el aislamiento y cultivo de neuronas de DRG y MP. Además, representa una herramienta valiosa para el estudio de la reacción concomitante de entérica y glía asociado-DRG a los componentes microambientales pancreáticas.

En nuestra opinión, una de las características más interesantes de este ensayo es su capacidad para detectar y simular las alteraciones que se producen durante el CaP y CP (es decir, formación de brotes neurales y la hipertrofia) en un entorno simplificado in vitro. De hecho, la aplicación de extractos de tejidos o sobrenadantes de células resultados en los cambios en la morfología neuronal which se puede detectar con suficiente sensibilidad por medio de análisis sistemático morfométrico. Recientemente, también se pudo demostrar que este ensayo también es sensible para detectar las diferencias en el potencial neurotrófico de varias entidades de cáncer en comparación simultánea: Cuando los atributos neurotróficos de líneas celulares de CaP se comparó con las líneas celulares de cánceres colorrectales, líneas de células de CaP significativamente inducida mayores densidades entre neuritas DRG neuronas que las líneas de cáncer colorrectal 8. Incluso en la comparación de rectal vs líneas celulares de cáncer de colon, las líneas celulares de cáncer de colon eran inferiores a las células de cáncer rectal en términos de su potencial neuroplástico 8.

Una de las principales ventajas de este ensayo es su fácil accesibilidad para no sólo morfométricos, sino también los análisis electrofisiológicos. A diferencia de en las neuronas in situ en el tramo preparativos, grabaciones de las neuronas en nuestro ensayo en medios definidos o en unbsence / exceso de presencia de factores definidos técnicamente no son exigentes y puede proporcionar información valiosa sobre el papel de las moléculas seleccionadas en estos microambientes en la actividad neuronal.

Ciertamente, el ensayo se presenta no debe ser considerado para ser exclusivamente restringido al estudio de los problemas relacionados con la neuroplasticidad de páncreas. La neuroplasticidad es una característica prominente de todo el tracto GI bajo condiciones patológicas, tales como neuropatías inflamatorias entéricos 1-3. Se informó de que se asocia con cambios en la morfología y la inervación alterada la actividad neuronal 1-3 Todas estas condiciones. Por lo tanto, es concebible sustituir los extractos de tejido pancreático o líneas celulares por los derivados de los tejidos correspondientes y estudiar su impacto específico sobre las neuronas y la glía de acompañamiento. Nuestros análisis recientes sobre la comparación de tejidos de cáncer de páncreas y colorrectal apoyan esta noción 8. Sin embargo, también es plausible suponiendoe que los componentes de los diferentes microambientes tejidos pueden no inducir alteraciones como sensibles y representativos como se observa habitualmente en los componentes del tejido pancreático. Por lo tanto, se recomienda la evaluación extensa previa de la morfología neuronal inducida por los tejidos "positivos" de control (es decir, los tejidos con hipertrofia neuronal por ejemplo histológicamente demostrado) frente a los tejidos "negativos" de control (es decir, sin evidencia histológica de la hipertrofia de los nervios).

Nuestros análisis anteriores sobre la reacción de la glía en este ensayo se limitan a la determinación de los recuentos de células gliales en diferentes microambientes pancreáticas. Células gliales poseen importancia emergente en neurobiología desde el reconocimiento de su potencial neurogénico y un mayor interés en las corrientes de calcio a lo largo de la membrana glial 12. Por lo tanto, las células de la glía en este ensayo son también de fácil acceso para los nuevos análisis funcionalespor nuevos enfoques. Sin embargo, tales enfoques innovadores adicionales necesitan una validación previa antes de su aplicación para estudios posteriores.

Al igual que cualquier otro ensayo experimental, también el ensayo neuroplasticidad presentado guarda cierta comparabilidad limitada de muestras de tejidos humanos obtenidos de diferentes pacientes sometidos a cirugía. Es imperativo que estos tejidos que se derivan de las regiones mismas de tejido (por ejemplo, la cabeza del páncreas, de la masa principal del tumor) para los análisis confiables 1. Además, incluso cuando se cumple este requisito previo, otras diferencias en el tejido o la biología del tumor no se pueden excluir teniendo en cuenta la gran variación en el patrón de respuesta biológica de diferentes individuos 1. Para eludir estas diferencias de tejido individuales, se recomienda la realización del ensayo con los tejidos obtenidos a partir de tantos pacientes como sea posible, es decir, con al menos de 5 - 10 pacientes diferentes por entidad.

Como aspecto técnico clave, nos gustaría llamar la atención sobre el papel de las sustancias de revestimiento en el crecimiento neuronal. Como también se ha mencionado anteriormente, preferimos poli-D-lisina para las mediciones sobre la densidad de las neuritas, y revestimiento ornitina / laminina para aquellos en el patrón de ramificación / excrecencia neuronal individuo. En nuestras manos, mientras que la medición del crecimiento de neuronal también se puede realizar en poli-D-lisina-cubierta superficies, nos encontramos con que este enfoque tiende a disminuir la sensibilidad del ensayo para las diferencias reales. Por lo tanto, los investigadores aplican este ensayo deben garantizar el uso del material de revestimiento óptimo para su cuestión de interés.

En resumen, creemos que el ensayo de la neuroplasticidad presentado representa una valiosa herramienta para obtener información rápida y reproducible en neuro-morfología y la función neuro-en diferentes microambientes de tejido, como se demuestra en el ejemplo detejido pancreático. La detección sensible a las diferencias en la morfología como la neuro-inducida por contenidos diferentes de tejido pancreático subraya la reproducibilidad in vitro de la neuroplasticidad de páncreas en PCa humana y CP. Los esfuerzos futuros tendrán como objeto la detección preassay optimizada de sobrenadantes aplicadas y extrae de alcanzar los medios de comunicación mejor definido para el estudio de la GI-enfermedad asociada a la neuroplasticidad.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses en conflicto y no divulgación de información financiera.

Acknowledgments

Todos los autores contribuyeron a la creación y validación de la prueba presentada y el proyecto del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1149
Ornithine/laminin Sigma-Aldrich P2533/L4544
13 mm Coverslips Merck For use in 24-well plates
Dismembranator S Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antibody Millipore MAB1637 1:200 concentration
Anti-GFAP-antibody DAKO M0761 1:400 concentration
RIPA buffer + protease inhibitor Any supplier
Neurobasal medium Gibco/Life Sciences 21103-049
B-27 Supplement Gibco/Life Sciences 17504044 Quality of B-27 is known to depend on the lot number
Gentamicin/Metronidazol Any supplier
Minimal essential medium Gibco/Life Sciences 31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Sciences 24020133 Improves collagenase activity when containing Ca/Mg
Collagenase type II Worthington Biochemical CLS-2 Obtain lots with at least 200 U/mg activity
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco/Life Sciences 25200056
4% Paraformaldehyde Any supplier
analySIS docu software Olympus

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References

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Demir, I. E., Tieftrunk, E., Schäfer, K. H., Friess, H., Ceyhan, G. O. Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay. J. Vis. Exp. (86), e51049, doi:10.3791/51049 (2014).

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