Pankreas Nöroplastisite benzetme:<em> In Vitro</em> Dual-nöron Plastisitesi Deneyi
Summary
Nöronal plastisite gastrointestinal (Gİ) sistem giderek tanınan, fakat yeterince anlaşılır bir özelliktir. Burada, insan pankreas bozuklukların örnekte, morfolojik ve fonksiyonel hem düzeyinde GI nöronal plastisite çalışma için, bir in vitro deneyi nöroplastisite mevcut.
Abstract
Nöroplastisite patolojik koşullar altında, enterik sinir sistemi ve gastrointestinal (GI) innervasyonunun içsel bir özelliğidir. Ancak, GI bozuklukları nöroplastisitesi patofizyolojik rolü bilinmemektedir. Simülasyon ve GI nöroplastisitesi modülasyonu sağlayan yeni deneysel modeller gibi pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) olarak özellikle GI hastalıkların nöroplastisitesi katkısının gelişmiş takdir sağlayabilir. Burada, yeni doğan sıçan dorsal kök ganglionlar (DRG) ve myenterik pleksusu (MP) nöronlar kullanılarak in vitro koşullarda pankreas nöroplastisitesi simülasyonu için bir protokol mevcut. Bu çift-nöron yaklaşım hem organ içsel ve dışsal-nöroplastisite izlenmesini sağlar, ama aynı zamanda nöronal ve glial morfolojisi ve elektrofizyoloji değerlendirmek için değerli bir araç temsil değil sadece. Dahası, onların IMPAC eğitim için verilen microenvironmental içeriklerin fonksiyonel modülasyonu sağlarnöroplastisitesi t. Bir kez kurulan, mevcut nöroplastisite tahlil herhangi GI organ nöroplastisitesi çalışmaya uygulanabilir olma potansiyelini taşımaktadır.
Introduction
Gastrointestinal (Gİ) sinir morfolojisi ve yoğunluğu değişiklikler uzun bir süre için gastroenterolog ve patologlar dikkatini çekti, ama GI hastalıkların patofizyolojisi için kendi alaka 1-3 bilinmemektedir. Gerçekte, bu tür gastrit, reflüks yemek borusu iltihabı, kolit, divertikülit ve apandisit gibi birkaç derece yaygın GI hastalıkları, iltihaplı doku alanlarında 1 'de artan innervasyon yoğunluğuyla ilişkilidir. Ancak, gerçek bir ilgi kadar GI de mekanizmaları ve nöroplastisite anlamı ödenmiştir. Morfolojik değişmiş GI sinirler fonksiyon açısından, enterik sinir sisteminin normal devlet, yani normal bir GI sinirler farklı mı? Plastik enterik sinir değişmiş nöropeptid / nörotransmiter içeriği etkileri nelerdir? Periferik nöroplastisite her zaman merkezi sinir sistemi değişmiş sinyalizasyon gerektirmez mi? Ve nerede plastik kurtarmasına merkezi projeksiyonları vardırnsic GI sinir yolları? GI nöroplastisitesi fonksiyonel yönleri üzerinde bilgimizin azlığı bakarken gibi önemli soruların uzun bir dizi kolaylıkla oluşturulabilir.
Fonksiyonel düzeyde GI nöroplastisitesi çalışma, geçerli tekrarlanabilir ve hala kolayca uygulanabilir deneysel modeller gerektiriyor. Artan bir dönemde popülerlik ve bu vivo ortamlarda GDO'lu koşullu fare modelleri (GECoMM), kabulü gerçekçi bir şekilde 1 GI nöroplastisitesi önceden bilinmeyen yönleriyle aydınlatmak potansiyelini taşımaktadır. Ancak, GECoMM tasarım ve üretim, pahalı kalır emek-yoğun ve özellikle, zaman alıcıdır. Bundan başka, koşullu olarak genetik olarak değiştirilmiş fare (bağırsak epitel hücrelerinde sinir büyüme faktörü / NGF örneğin transgenik aşırı ekspresyonu) modüle edilecek hedefin önsel seçimi gerektirir. Bu nedenle, des içinBaşarılı bir GECoMM bir ign, araştırmacılar, bir değerli hedefin bazı göstergeler (örneğin önceki deneysel veri) gerekir (burada NGF) ilgilenilen molekül en az GI sinirler üzerinde bazı biyolojik ilgili etkiler yarattığı bekleniyor olabilir yani.
Bu tip göstergeler kolayca in vivo sistemin karmaşık mikro-izole edilmiş hücre alt tipi seçici bir heterotipik şekilde 4-7 kültüre edilebilir in vitro modellerde yeterli türetilebilir. Bir heterotipik kültür ortamda moleküler hedeflerin modülasyonu, daha hızlı, daha az ortalama teknik zahmetlidir ve bu nedenle in vivo çalışmalarda doğrulanması için değerli hedeflerin ön süzme yardımcı olabilir.
Son zamanlarda, intrapankreatik NE artan sinir yoğunluğu ve hipertrofisi taklit etmek için tasarlanmış bir in vitro deneyi nöroplastisite sunulmaktadırinsan pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) dokuları rves. Burada, yeni doğmuş fare dorsal kök ganglion (DRG) veya miyenterik pleksus (MP) türetilen nöronlar cerrahi olarak kesilmiş dokuları PCa ya da CP örneklerden doku özleri maruz kalmış ve normal insan pankreas (NP), doku ekstreleri 5 kültürlenmiş ile karşılaştırıldı. Bunun yerine, doku özleri, bir de nöroplastisitesi üzerine seçilen hücre türlerinin etkilerini incelemek için hücre hattı, üst fazlar kullanabilir. Standardize morfometrik ölçüm ile kombine edildiğinde, sunulan nöroplastisite tahlil farklı pankreas mikroçevrelerde yanıt nöronal plastisite geçerli ve tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar. Özel olarak, bu sağlayan nevrit dışa büyümesinin, desen ve nöronal dallanma boyutu, ve 2) fonksiyonel nöroplastisite, periferal sinir hücrelerinin uyarılabilirliğinin yani değişikler değişikliklerin, yani 1) morfolojik nöroplastisitesi simülasyon. Ayrıca, çevresel sadece (örn. </em> Bağırsak) değil, aynı zamanda, merkezi (örn. DRG ya da ikinci derece spinal) nöronları farklı GI doku içeriğine morfolojik ve fonksiyonel reaksiyon değerlendirmek için, bu deneyde dahil edilebilir. Mevcut video ders, biz bu testin performans için teknik protokolünü göstermek ve avantajları ve zayıf yönlerini tartışmak. Ayrıca, herhangi bir GI organ nöroplastisitesi çalışmada bu testin temel kavramının uygulanabilirliğine dikkat çekmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol son zamanlarda PCa'nın ve CP 5 nöroplastisitesi mekanizmaları incelemek için bizim grup tarafından geliştirilen in vitro pankreatik nöroplastisite tahlil arkasındaki metodoloji göstermek için tasarlanmıştır. Protokol sanatçı DRG ve MP nöronların izolasyonu ve kültürü yeterli deneyim kazanmıştır sonra kolayca uygulanabilir üç günlük bir prosedür içerir. Ayrıca, pankreas microenvironmental bileşenlere enterik ve DRG ilişkili glia birlikte reaksiyonu i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm yazarlar sunulan analizin kurulması ve doğrulama doğru ve yazının taslak katkıda bulunmuştur.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
