Summary
ציפוי האלקטרודה שונה משפיע על ביצועי הקלטה עצביים דרך שינויים במאפיינים אלקטרוכימיים, כימיים ומכאניים. השוואה של אלקטרודות במבחנה היא פשוטה יחסית, עם זאת השוואה של תגובת in vivo היא מסובכת בדרך כלל על ידי שינויים במרחק אלקטרודה / נוירון ובין בעלי החיים. מאמר זה מספק שיטה חזקה כדי להשוות אלקטרודות הקלטה עצביות.
Abstract
חומרים ועיצובים לשתלים עצביים חדשים הם בדרך כלל נבדקו בנפרד, עם הפגנה של ביצועים, אך ללא התייחסות למאפייני שתל אחרים. זה מונע בחירה רציונלית של שתל מסוים כאופטימלי עבור יישום מסוים והפיתוח של חומרים חדשים המבוססים על הפרמטרים של ביצועים הקריטיים ביותר. מאמר זה עוסק בפיתוח פרוטוקול במבחנה בבדיקת vivo של אלקטרודות הקלטה עצביות. פרמטרים מומלצים לבדיקות אלקטרו ואלקטרו מתועדים עם השלבים העיקריים ובעיות פוטנציאליות שנדונו. שיטה זו מבטלת או מצמצמת את ההשפעה של הרבה שגיאות שיטתיות הווה בin vivo פרדיגמות בדיקות פשוטות יותר, וריאציות במיוחד במרחק אלקטרודה / נוירון ובין מודלים של בעלי החיים. התוצאה היא מתאם חזק בין קריטי במבחנה בתגובות vivo, כגון עכבה וsiיחס gnal לרעש. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם לבדיקת חומרי האלקטרודה אחרים ועיצובים. ניתן להרחיב במבחנה הטכניקות לכל שיטה הרסנית אחרת כדי לקבוע מדדי ביצוע חשובים נוסף. העקרונות המשמשים לגישה הניתוחית במסלול השמיעה יכולים גם להיות שונה כדי אזורים עצביים אחרים או רקמה.
Introduction
שתלים עצביים נמצאים בשימוש יותר ויותר למחקר, שליטה תותבות וטיפול בהפרעות כגון מחלת פרקינסון, אפילפסיה, ו1,2 אובדן חושים. מדידה ו / או שליטה הן כימית והרכב חשמלי של המוח היא הבסיס לכל שתלים העצביים. עם זאת, חשוב לנהל את טיפול רק כאשר הרקמה העצבית נמצאת במצב החריג כדי להפחית את תופעות הלוואי 3. לדוגמא, לגירוי מוחי עמוק לטיפול באפילפסיה צריך לחול רק פולס חשמלי למוח במהלך התקף. תופעות לוואי מסוימים עשויות להיות דיסטוניה, אובדן הזיכרון, בלבול, תפקוד הקוגניטיבי לקוי, הזיות מושרה, דיכאון או אנטי הדיכאון 3,4. במכשירים רבים, מערכת לולאה סגורה לכן יש צורך להקליט את הפעילות חשמלית וכדי לעורר גירוי כאשר מדינה נורמלית הוא זוהה. אלקטרודות הקלטה משמשות גם כדי לשלוט בפרומכשירי sthetic. זה קריטי כדי להקליט את הפעילות העצבית היעד עם היחס הגבוה ביותר אפשרי אות לרעש כדי להשיג מפעילה מדויק ביותר ובקרה של התקן. יחס אות לרעש גדול הוא גם רצוי מאוד עבור יישומי מחקר, כפי שניתן לקבל נתונים אמינים יותר, וכתוצאה מנבדקים נדרשו פחות. זה גם יאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים ומסלולים מעורבים בגירוי והקלטה עצביים.
לאחר שתל עצבי הושם לתוך המוח, תגובה חיסונית מופעלת על 5,6. במהלך זמן התגובה מחולק בדרך כלל לשלבים אקוטיים וכרוניים, כל אחת בהיקף של תהליכים ביולוגיים שונים 7. התגובה החיסונית יכולה להיות השפעה דרמטית על הביצועים של השתל, כגון בידוד של אלקטרודות מהנוירונים היעד ידי אנקפסולציה בצלקת או השפלה כימית גליה של חומרי שתל 8.זה יכול להפחית את יחס אות לרעש של האלקטרודה הקלטה ותפוקת החשמל של האלקטרודה מגרה, ולהוביל לאלקטרודה כישלון 9. בחירה קפדנית של עיצוב שתל וחומרים נחוץ כדי למנוע כישלון לאורך חיי השתל.
רבים חומרים שונים ועיצובים שתל פותחו לאחרונה כדי לשפר את יחס אות לרעש ויציבות שתל להקלטה עצבית. חומרי אלקטרודה כללו פלטינה, אירידיום, טונגסטן, תחמוצת אירידיום, תחמוצת טנטלום, גרפן, צינורות פחמן, מסוממים פולימרים מוליכים, ולאחרונה הידרוג. חומרי מצע שנבדקו כוללים גם סיליקון, תחמוצת סיליקון, סיליקון ניטריד, משי, טפלון, polyimide, וסיליקון. שינויי אלקטרודה שונים גם נחקרו, תוך שימוש בציפויים כגון laminin, neurotrophins, או monolayers עצמי התאספו וטיפולים באמצעות אלקטרוכימיים, פלזמה ושיטות אופטיות. עיצוב שתלים יכול להיות 1 -, 2 - או 3 ממדים עם אלקטרודות בדרך כלל בקצה של חללית בידוד או בשולי שוק חודר אלקטרודות או במערך 2 ממדים לשתלי משטח קליפת המוח. ללא קשר לעיצוב האלקטרודה או חומר, הספרות קודמת יש בדרך כלל הוכיחה את הביצועים של השתל החדש ללא התייחסות למבני שתל אחרים. זה מונע הערכה שיטתית של הנכסים שלהם.
פרוטוקול זה מספק שיטה להשוואה בין חומרי אלקטרודה שונים באמצעות מגוון של שיטות אנליטיות ואלקטרו. הוא מבוסס על מאמר שפורסם לאחרונה אשר לעומת 4 מסוממים שונה ביצוע ציפוי פולימר (polypyrrole (PPy) ופולי-3 ,4-ethylenedioxythiophene (PEDOT) מסומם עם סולפט (SO 4) או sulfonate para-טולואן (נק ')) ו -4 ציפוי שונה בעוביי 10. מאמר זה מצא חומר אחד, PEDOT-נק 'עם זמן בתצהיר 45 שניות,היה לי ספירת היחס וספייק הגבוהה ביותר אות לרעש עם רעש הרקע הקטן ביותר וכי הפרמטרים אלה היו תלויים בעכבת אלקטרודה. PEDOT-נק 'מוצג גם biostability החריף מעולה לעומת הפולימרים מסוממים ניהול האחרים ואלקטרודות אירידיום חשופות. הפרוטוקול מאפשר הפרמטרים הקריטיים שליטה יחס אות לרעש ויציבות שייקבע ומשמש כדי לשפר את הביצועים של האלקטרודות הקלטה עצביות נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת La Trobe (09-28P) וועדות אוניברסיטת RMIT בעלי החיים אתיקה (1315).
1. בדיקת אלקטרודה הכנה וראשונית במבחנה
- הכן את הפתרונות בתצהיר ציפוי האלקטרודה, למשל 10 מ"מ 3,4-ethylenedioxythiophene (EDOT) ו0.1 sulfonate para-טולואן M נתרן (Na 2 נק ') כדי ליצור poly-3 ,4-ethylenedioxythiophene-נק' (PEDOT-נק ').
- חבר את מערך אלקטרודות לpotentiostat.
- הנח בזהירות את מערך אלקטרודות לפתרון בתצהיר ומהדק למקומו.
- הנח אלקטרודה נגדית רשת פלטינה ואלקטרודה השוואתית Ag / AgCl לפתרון בתצהיר ולהתחבר לpotentiostat.
- באמצעות potentiostat, הפקדת הציפויים על גבי אלקטרודות הרצויות. תנאי הפקדת (פוטנציאליים, והשעה נוכחית) משתנים בהתאם לציפוי הרצוי. עבור ציפויי PEDOT-נק ', שורר מיושםntial של V 1 ל15, 30, 45, או 60 שניות כבר בשימוש. ארבע אלקטרודות על המערך צריכה להיות מצופים בציפוי בתצורה מדורגת (איור 1).
- הסר את מערך אלקטרודות מהפתרון בתצהיר ולשטוף בעדינות עם מים deionized.
- חזור על תהליך הציפוי עם חומרים אחרים בהתאם לצורך.
- הכן את הפתרון במבחנה בדיקה (פוספט 0.3 M di-נתרן (Na 2 HPO 4) במי deionized).
- חבר את מערך אלקטרודות לpotentiostat.
- הנח בזהירות את מערך אלקטרודות לפתרון הבדיקות ומהדקים למקומו.
- הנח אלקטרודה נגדית רשת פלטינה ואלקטרודה השוואתית Ag / AgCl לפתרון הבדיקות ולהתחבר לpotentiostat.
- באמצעות potentiostat, לבצע ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימיים רציפה (EIS) (פוטנציאל לקזז 0 V, משרעת 10 mV, הרץ 10-100,000 טווח תדרים) וvoltammetry המחזורית (מחזור 1, טווח פוטנציאל 0.8 ל-0.8 V, קצב סריקת 100 mV / sec) בכל האלקטרודות. אלקטרודות שלא נבדקו נשמרות בפוטנציאל במעגל פתוח וזמן שקט של 1 שניות משמש בין כל בדיקה. כל 32 אלקטרודות נמצאות בקשר עם הפתרון לפגישת בדיקות המלאה של 1 שעה.
- הסר את מערך אלקטרודות מפתרון הבדיקות ולשטוף בעדינות עם מים deionized.
- לבצע כל ניתוח אחר רצוי כגון מיקרוסקופיה אופטית.
- בדיקות חנות במכל מגן יבש כדי למנוע נזק והשפלה של משטחי האלקטרודה.
2. השתלת האלקטרודה
- לשקול את החולדה.
- הזרק urethane (20% w / v במים מזוקקים, 1.3 גרם / ip קילוגרם) עבור ההרדמה nonrecovery.
- ודא תחילת הרדמה על ידי בדיקת רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן. אם ההרדמה לא מספיק, מנות משלימות של urethane צריכה להינתן (IP 0.3 גר '/ קילוגרם).
- החל סיכה העין, ולאחר מכן לגלח את ראשimal.
- מניחים את החיה במצב נוטה על צלחת homeothermic והכנס בדיקה רקטלית (37.5 מעלות צלזיוס).
- הנח אוזן בר אחד לעמדתו הסופית הצפויה כ בתוך המסגרת stereotaxic, ולאחר מכן להתאים את בעלי החיים כדי למקם את האוזן בר בmeatus אקוסטית החיצוני.
- יישר את בר האוזן השני לתוך meatus אקוסטית החיצוני הנגדי. Shift בעלי החיים בברים האוזן כדי להתיישר עם בעל השן.
- בעזרת מלקחיים עכברוש שיניים, לפתוח את הלסת של החיה, להתחבר החותכות העליונות מעל בעל השן ומהדק את האף במקום.
- יצירת חתך בעור של הראש, כ 1 מ"מ בצד הימין של קו האמצע וממקורי 10 מ"מ ל10 הזנב מ"מ של למבדה.
- לחזור בו העור ושריר רוחבי מהחתך כדי לחשוף את הקודקודית ועצמות interparietal שימוש 20% פתרון מי חמצן ופד גזה, לשפשף את פני השטח של העצם החשוף.
- לקדוח חור כ3 מ"מ 2 בעצמות interparietal קרובות למבדה וקו האמצע ככל האפשר וניתקתי את תקע העצם. שימוש בתמיסת מלח סטרילית, שטוף את החור כדי להסיר כל אבק עצם או שברים שעלולות לפגוע באלקטרודה.
- באמצעות מספריים קהה קהים, לנתח מתחת לעורף וליצור חלל. לעטוף את חוט Ag / AgCl בצמר גפן, להרוות אותו עם מלח ולאחר מכן להכניס את האלקטרודה ההתייחסות לתוך החלל.
- עושה חתך במאטר הדורה במישור הסגיטלי באמצעות קצה מחט.
- צרף את מערך אלקטרודות למניפולטור האלקטרודה ולהתאים את עמדתה על הפתיחה עם זווית rostro-הזנב 19 °. באופן ידני להכניס את האלקטרודה כ -2 מ"מ לתוך המוח לכיוון colliculus הנחותים.
- צרף את הרמקול לאוזן בר החלולה השמאל.
- להבטיח את המגבר דולק. לאחר מכן ודא הרדמה חיה לפני איטום תא ההקלטה.
3.בבדיקת vivo
- לספק פרצי רעש לבנים, (רעש גאוס להפיץ, 1-44 kHz; זמן עליית נפילה 10 אלפיות שני) ולנטר את הפעילות בכל אלקטרודה. השיעור המרבי שבו פורץ צריך להיות מועברים הוא פרץ אחד כל 200 אלפיות שניים.
- שימוש בדיסק הקשיח הזעיר הממונע, כנס באיטיות את מערך אלקטרודות עד פעילות מונעת אקוסטית נרשמת על 3 אלקטרודות הדיסטלי ביותר בכל שוק (המספר והמיקום של פעילות הקלטת אלקטרודות עשויים להשתנות עם מיקום האלקטרודה או עיצוב אלקטרודה).
- לבצע את פרוטוקול גירוי אקוסטי באמצעות 300 חזרות של 50 פרצי רעש לבן אלפיות (רעש גאוס להפיץ, 1-44 kHz; 10 זמן עליית נפילה אלפיות שני) עם שיעור החזרה שניות 1 ב70 dB, ולהקליט את פעילות multiunit בכל אלקטרודה ( 24.4 דגימת קילוהרץ קצב).
- לאט לאט להכניס את מערך אלקטרודות 200 μ מ 'נוסף אל תוך המעגל המשולב למצב את כל אלקטרודה בערך באותה העמדה כמו האלקטרודה דיסטלי יותר מהדואר עמדת רישום ראשוני.
- חזור על גירוי אקוסטי ופרוטוקול הקלטה עצבי.
- המשך החדרת מערך אלקטרודות ב200 μ צעדים מ 'וביצוע גירוי אקוסטי ופרוטוקול הקלטה עצבי עד שכל האלקטרודות רשמו את פעילות מונעת אקוסטית מלפחות 3 עמדות (בדרך כלל 8-12 עמדות אלקטרודה כוללת).
- לחזור בו מערך אלקטרודות ב200 μ צעדים מ 'ולהמשיך בביצוע גירוי אקוסטי ופרוטוקול הקלטה עצבי עד עמדת מערך אלקטרודות הראשונית מושגת.
- לחזור בו מערך אלקטרודות בקפידה באופן ידני.
- הזרק מנת יתר של pentobarbitone נתרן (Lethobarb; 200 מ"ג / קילוגרם ip) להרדימו.
- לשטוף בעדינות את מערך האלקטרודה עם מים מזוקקים. לאחר מכן בדיקות חנות במכל מגן יבש כדי למנוע נזק והשפלה של משטחי האלקטרודה.
4. לאחר ההשתלה בvitro בדיקה
- לשטוף בעדינות את מערך האלקטרודה עם מים מזוקקים כדי להסיר כל זיהום.
- חבר את מערך אלקטרודות לpotentiostat.
- הנח בזהירות את מערך אלקטרודות לפתרון הבדיקות ומהדקים למקומו.
- הנח אלקטרודה נגדית רשת פלטינה ואלקטרודה השוואתית Ag / AgCl לפתרון הבדיקות ולהתחבר לpotentiostat.
- באמצעות potentiostat, לבצע ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימיים רציפה (EIS) (פוטנציאל לקזז 0 V, משרעת 10 mV, טווח תדרים 10-100,000 הרץ) וvoltammetry המחזורית (מחזור 1, טווח פוטנציאל 0.8 ל-0.8 V, קצב סריקה 100 mV / sec ) על כל האלקטרודות. אלקטרודות שלא נבדקו נשמרות בפוטנציאל במעגל פתוח וזמן שקט של 1 שניות משמש בין כל בדיקה. כל 32 אלקטרודות נמצאות בקשר עם הפתרון לפגישת בדיקות המלאה של 1 שעה.
- הסר את מערך אלקטרודות מפתרון הבדיקות ולשטוף בעדינות עם מים deionized.
- Pתחרה מערך אלקטרודה לתוך תמיסת ניקוי אנזימטי ל24 שעות.
- הסר את מערך אלקטרודות מהפתרון ולשטוף עם מים מזוקקים.
- חבר את מערך אלקטרודות לpotentiostat.
- הנח בזהירות את מערך אלקטרודות לפתרון הבדיקות ומהדקים למקומו.
- הנח אלקטרודה נגדית רשת פלטינה ואלקטרודה השוואתית Ag / AgCl לפתרון הבדיקות ולהתחבר לpotentiostat.
- באמצעות potentiostat, לבצע ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימיים רציפה (EIS) (פוטנציאל לקזז 0 V, משרעת 10 mV, טווח תדרים 10-100,000 הרץ) וvoltammetry המחזורית (מחזור 1, טווח פוטנציאל 0.8 ל-0.8 V, קצב סריקה 100 mV / sec ) על כל האלקטרודות. אלקטרודות שלא נבדקו נשמרות בפוטנציאל במעגל פתוח וזמן שקט של 1 שניות משמש בין כל בדיקה. כל 32 אלקטרודות נמצאות בקשר עם הפתרון לפגישת בדיקות המלאה של 1 שעה.
- הסר את מערך אלקטרודות מפתרון הבדיקות ולשטוף בעדינות עם מים deionized.
- בדיקות חנות במכל מגן יבש כדי למנוע נזק והשפלה של משטחי האלקטרודה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערך אלקטרודות טיפוסי המשמש לפרוטוקול ניסוי זה מוצג באיור 1. ישנן 32 אלקטרודות אירידיום ב -4 באנקס עם 413 μ מ '2 באזור גיאומטרי נומינלי ומגרש μ מ' 200. כל אלקטרודה שנייה על המערך כבר מצופה באחת מארבעה ציפוי האלקטרודה שונה, שכותרתו 1-4. חומרי הציפוי כבר נבחרו בקפידה על התכונות כימיות, מכאניות ואלקטרו. כפי שהוזכר קודם לכן 10, פעמים בתצהיר מוגברות תגדיל את שטח האלקטרודה ועובי ציפוי, ואילו גדולים יותר להחיל נוכחית או פוטנציאלי עשויים גם להגדיל את השיעור בתצהיר, תגובות מתחרות עלולות להתרחש המשפיעים על תהליך הדחה. הפרוטוקול בתצהיר כבר מותאם בעבר עבור פולימר ניצוח המסוים הזה כדי להבטיח ציפוי לשעתק מושגת ולכן הוא מוגבל לאלקטרודה (כלומר לא התפשט לadjaceהאלקטרודה NT) 10.
לאחר מערך אלקטרודות כבר שונה, סדרה של ניתוחים אופטיים ואלקטרוכימיים צריכה להתבצע. במקרה זה, voltammetry המחזורית (איור 2) וספקטרוסקופיה עכבת אלקטרוכימי (איור 3) כבר נוצלה. פרוטוקול זה משתמש voltammetry המחזורית על פני טווח פוטנציאל גדול, מתחיל בכיוון סריקת רדוקטיבי. אם נדרש צפיפות מטען אלקטרודה, צריכים להפוך את נתוני voltammetric מחזוריים לעלילה נוכחית בזמן וגם את אזורי רדוקטיבי או חמצוני משולבים (איור 2b). העכבה מתקבלת על פני טווח תדרים רחב עם אמפליטודה קטנה ב 0 V. יכולים להיות מיוצגים נתונים העכבה במגוון רחב של פורמטים כולל עכבה (איור 3 א) או שלב לעומת תדר (איור 3 ב) או כג 3 עלילת נייקוויסט (איור ).
מערך אלקטרודות צריך להיות מוכנס באופן ידני ולכן הטיפים השוק הם רק דרך פני השטח במוח. רעש לבן משמש כונן פעילות רבת יחידה תוך הדיסק הקשיח הזעיר מוסיף את המערך לתוך colliculus הנחות (IC) ב200 צעדים μ מ 'באיטיות. תגובת האלקטרודה צריכה להיות במעקב כמו המערך מוכנס, ופעם אחת בערך 3 אלקטרודות התחתונה על כל שוק מציגות פעילות אקוסטית מונעת (איור 4 א), הרעש הלבן יכול להיות כבוי. In vivo פרוטוקול גירוי אקוסטי אז התחייב. נתוני זרם אופייניים ממערך אלקטרודות יציגו עלייה גדולה בRMS מסונכרן עם דופק הרעש על בסיס יציב (איור 5). חשוב למזער את כל הרעש החשמלי ואקוסטי החיצוני כדי לצמצם את הפעילות הבסיסית. בסיומו של פרוטוקול גירוי אקוסטי, מערך האלקטרודה מוכנס וחזר בו ב200 צעדים μ מ '. אקוסטיותפעילות מונעת ustically מיוצגת כהיסטוגרמה peristimulus זמן (PSTH) או זרם הנתונים גולמי בעמדות מערך אלקטרודות שונות בIC מוצג באיורים 4 ו -5.
לאחר החדרת המערך המלאה ותהליך הכחשה, האלקטרודות בעדינות לשטוף והערכה מחדש עם הפרוטוקול במבחנה כדי לקבוע את יציבות הציפוי. ניתן לקבל פרטים נוספים על ההשפעות של עכירות חלבון ממאמר קודם 10.
In vivo הנתונים ניתן לנתח באופן מקיף. פרמטר חיוני אחד להקלטה עצבית הוא יחס אות לרעש (SNR) 10. שתי אלקטרודות מאותו המערך, אחד מצופה ואחד ללא ציפוי, היו בתחילה לא ב( איור 6 א) IC. לאחר 400 החדרת μ מ ', אלקטרודה המצופה מציגה עלייה ביחס האות לרעש בזמן שהאלקטרודה ללא ציפוי דורשת 1,200 החדרה μ מ'.; יחס האות לרעש בשתי אלקטרודות משתנה בנקודות שונות במעגל משולב, אבל לא לבזות לאורך זמן (עמדה). זה מצביע על כך שהתאים עדיין קיימא במהלך הניסוי, וכי ציפוי האלקטרודה יציב בעת שימוש בפרוטוקול זה. הווריאציה בSNR עם עמדה יוחסה לרעש ביולוגי (מספר שונה ואת מיקומם של הנוירונים בקרבת האלקטרודות) 10.
רמות לחץ קול שונות (SPL) יכולות לשמש לגירוי אקוסטי, כל עוד הם מעל סף אקוסטי ולא להחריש בעלי החיים. יחס האות לרעש משתנה עם SPL ולכן צריך להיות (6 ב איור) עולים בקנה אחד. SPL גבוה מומלץ ליצירת תגובה רבת יחידה מונעת גדולה יותר, כמו אזור גדול יותר של IC יהיה מגורה, מה שהופך את מיקום האלקטרודה קל יותר והפחתת הרעש הביולוגי גם בעת מתן מספר גדול יותר של עמדות אלקטרודה לanalys הסטטיסטיהוא.
לוחות ותרשימים:
איור 1. מיקרוסקופ אופטי של מערך אלקטרודות שונה פולימר ניצוח. התוויות (1-4) מייצגות ארבעה ציפויים שונים, המאפשר ניתוח סטטיסטי של כל ציפוי בניסוי יחיד. אלקטרודת ציפוי אחד היא גם כותרתו. בדוגמא זו, 1-4 15, 30, 45, ו60 פעמים בתצהיר שניות של PEDOT-נק '. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. (א) עכבה, (ב) שלב ו (ג) טווח תדירות גבוהה של עלילת נייקוויסט לפולימר ללא ציפוי (מקווקו) וניצוח נציג מצופה אלקטרודות (מוצקות). לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
together.within-יפ-page = "תמיד"> 
. איור 4 היסטוגרמה זמן Peristimulus נמדדת בכל אלקטרודה, בממוצע לכל 300 חזרות ב70 רעש לבן dB בשני עומקים שונים בIC; () 0 מ μ ו (ב) מעמקי כניסה 800 מ μ. כוכביות מציינות את אלקטרודות מצופים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. נתוני הזרמה נמדדים בכל אלקטרודה עם 70 פרצי רעש לבנים dB בשני עומקים שונים בtהוא IC; () 0 מ μ ו (ב) מעמקי כניסה 800 מ μ. כוכביות מציינות את אלקטרודות מצופים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 6. S ignal יחס רעש במהלך החדרה ונסיגה של מערך אלקטרודה לתוך IC. (א) רעש לבן dB 70 בפולימר ללא ציפוי (מקווקו) וניצוח הנציג המצופה אלקטרודות (מוצקות) ו (ב) רמות לחץ קול שונה ( 40-70 dB) באלקטרודה מצופה פולימר ניצוח. לחץ כאן לצפייה במתאר לעצמי גדול יותרדואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה להשוואה בין ציפוי האלקטרודה הקלטה עצבי בתוך חיה אחת. עיצוב אלקטרודה המשמש הוא אידיאלי להשתלה לתוך colliculus נחותים עכברוש (IC), עם ממדים של קנה מידה דומה. וריאציות של אלקטרודה זו כגון מקום רב יותר בין שאנקס ימנעו כל אנקס להיות בחולדה IC באותו הזמן, בעוד שאנקס יותר ומגרש גדול יותר בין האלקטרודות להגביר את הסיכון ששוק הטיפים יבואו במגע עם בסיס הגולגולת במהלך כניסה. המגרש האלקטרודה קטן יותר מגדיל את הסיכון לציפוי מהאחד אלקטרודה פנייה האלקטרודה סמוכה. אזור האלקטרודה ישפיע על תגובת ההקלטה העצבית, ולכן צריך להיות עקבי בניסויים. השטח שנבחר הוא אידיאלי למדידת פעילות יחידה רב, וכתוצאה מכך הנתונים עקביים יותר עם מרחקי האלקטרודה נוירון משתנים. באמצעות 4 אלקטרודות עם אותו הציפוי מאפשר f ניתוח סטטיסטיניתן להשיג ROM בתוך הנתונים של בעלי החיים ומספיק אחד מבעלי החיים 2 עם 2 מערכים שונים אלקטרודה (גודל מדגם 8 עבור כל חומר). ציפוי האלקטרודה יש גם כשל בכל שוק כדי למזער את השגיאה כגון מות נוירון תוך שהוא מחדיר את מערך אלקטרודה במהלך השפעות הניסוי או שדה חשמלי מהשינוי ברוחב שוק מקצה לבסיס. טעות מסוג זה היה נותן תגובה אלקטרו שונה באלקטרודות בקצה של השוק בהשוואה לאלו בבסיס. וריאציות אלקטרוכימיים ואלקטרו אינטר אצווה ממערכי האלקטרודה כבר נמצאו, ולכן מומלץ כי סדרה של ניסויים שבוצעו עם מערכי האלקטרודה מאותה אצווה. מערך אלקטרודות 3D יכול לשמש גם כדי לאסוף נתונים נוספים מחיה אחת, אם כי יש להקפיד על מנת להבטיח אלקטרודות מצופות בעקביות כתחבורה המונית עשויה להיות שונה לאלקטרודות על הקצה לעומת ceשאנקס nter.
בניסויים במבחנה בוצעו בפתרון חיץ nondegassed לייצג טוב יותר בתנאי in vivo. אמנם זה לא קריטי, זה צריך להיות עקבי בניסויים כדי למנוע וריאציות קשורות לירידה בחמצן. הרכב הספציפי של פתרון הבדיקה התבסס על המלצות מNeuroNexus (תקשורת פרטית), אך וריאציות אפשריות, כגון תוספת של אלקטרוליט או התאמת ה-pH. סופו של דבר, נדרש פתרון מוליך מאוד, nonreactive כדי להבטיח התגובה במבחנה הוא נשלטה על ידי אלקטרודה ההתנהגות, אבל זה צריך להיות עקבי בין ניסויים. יש לקבל פרטים נוספים על ביצוע ניתוח אלקטרוכימי ממקורות מתאימים 11. ציפוי האלקטרודה או פרוטוקול voltammetric מחזורי בעת שימוש באלקטרודות אירידיום חייב להיות שנבחר בקפידה, כיישום של פוטנציאל חיובי מאוד לתקופה ארוכהים של זמן יהווה תחמוצת אירידיום ולשנות את מאפייני אלקטרודה. לחלופין, ניתן להשתמש באלקטרודות פלטינה, ומבטלות את האפשרות של היווצרות תחמוצת. קצב הסריקה והטווח פוטנציאלי מתבססים על ספרות קודמת וחייבים להיות עקבי בניסויים, למרות שאף מתאמים בין צפיפות מטען ותגובת הקלטה עצבית נראו 10, פרטים נוספים על הפרמטרים האלה יטופלו בפרסומים עתידיים. כמו כן, חשוב לשמור על הפרמטרים EIS עקביים, אמפליטודות גדולות כמו, פוטנציאל קיזוז שונה ותצורות תא אלקטרוכימי ישנה את תגובת העכבה.
טווח התדרים המשמש לEIS נדון במאמר הקודם 10. עכבת אלקטרודה לשתלים עצביים באופן שגרתי נמדדה רק בקילוהרץ 1. זה עלול לגרום לאובדן של מידע משמעותי. למשל אלקטרודה ללא ציפוי ומצופה עלולה ליצור עכבה דומהערכים בקילוהרץ 1 (איור 3 א). עם זאת בתדרים נמוכים, אלקטרודה המצופה הזה הוא בעל עכבה נמוכה באופן משמעותי. באופן דומה לשלב (איור 3 ב), בקילוהרץ 1 יש אלקטרודות ללא ציפוי ומצופה שלב שונה מאוד, אבל בתדרים נמוכים יותר וגבוהים יותר שהם דומים. הבדל במאפיינים זה מאוד ברור על המגרש נייקוויסט (איור 3c) שבו האלקטרודה ללא ציפוי היא ליניארי ואילו האלקטרודה המצופה בעל חצי מעגל בתדרים גבוהים ותגובה אנכית בתדרים נמוכים.
הגרעין של IC של מודל חיה עכברוש המרכזי נבחר כאתר מתאים להשוואה בין אלקטרודות הקלטה בשל נגישות קלה שלה, גודל גדול יחסית, ועצבוב מונו ישיר באמצעות גרעין השבלול הנגדי. הסדר tonotopic מאפשר גם מיצוב ראשוני קל של החללית והאספקה של תדרי צליל טהורים יכול לשמש כדי לעזור לך עםמיקום בדיקה. במהלך החדרת אלקטרודה לתוך מערך IC, הפעילות העצבית לרעש לבן היא תחת פיקוח. בהתאם לזווית ומיקום מדויק של מערך אלקטרודות, שוק אחד לרוחב עשוי לרשום תגובה מונעת אקוסטית רק באלקטרודה הדיסטלי ביותר בעת השוק הנגדי מציג פעילות ב -3 או 4 אלקטרודות. הדפוס המסוים של פעילות במערך אלקטרודות אינו קריטי, כמו שרק סדרה של תגובות הקלטה על כל אלקטרודה נדרשות עם מרחקי האלקטרודה נוירון שונים. אם הפעילות היא לא ראה על כל 4 שאנקס, מערך אלקטרודות לא יכול להיות בתנוחה הנכונה. במצב זה, המערך צריך להיות חזר באופן מלא, את עמדתה ביחס למבדה וקו האמצע הותאמה במעט, ולאחר מכן להכניס מחדש. אם מספר מיקומים בחיה אחת כבר הושתלו ללא הצלחה, הברים האוזן צריכים להיבדק למיצוב נכון. בדיקה של נתוני הזרם יכולה להצביע על בעיות שנינותשעות אלקטרודה, למשל אלקטרודה אחת באיור 5 מציגה רק רעש גדול לעומת אלקטרודות האחרות, זה היה לייחס למחבר פגום ומסבירה את היעדר התגובה בPSTH (איור 4).
הניתוח שתואר בפרוטוקול זה ניגש colliculus הנחותים תקין עם הרמקול בבר אוזן השמאל. זה בקלות יכול היה להיות שונה כדי לשים את הרמקול בסרגל אוזן ימין ומערך אלקטרודה לתוך IC עזב.
פרוטוקול זה תוכנן לשימוש עם ציפוי האלקטרודה על מערכים זמינים מסחרי אלקטרודה (NeuroNexus). פרוטוקול בדיקה הספציפי הזה לא יכול להיות מתאים עבור תצורות אלקטרודה שונות. לדוגמא, כניסה של מערכי מצע polyimide גמישים והשוואה עם מערכי סגנון יוטה עלולה להיות קשה. גם החומרים חייבים להיות תואמים עם מערכים אלה, כמו חומרים מסוימים או בשיטות הציפוי שלהם עשויים לבזות אתבדיקות. כמה בעיות פוטנציאליות ששיטה בתצהיר ואקום חייבת להבטיח רק אלקטרודות מצופות; ממסים משמשים אסור לפזר או לחרוט מתכת, סיליקון או חוט אג"ח encapsulant; וטמפרטורות עיבוד לא חייבת להיות גבוהות מדי. פרוטוקול זה גם לא לבדוק את הביצועים כרוניים של השתל כפי שמודגם לודוויג ואח'. 12 עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לכלול רבות תצורות אחרות אלקטרודה, סוגי חומר ופרוטוקולי בדיקה. למשל טכניקות אנליטיות אחרות יכולות לשמש לבדיקות במבחנה. שואב האנזימטית יכול להיות שונה לטיפולים אחרים כדי להבין את האלקטרודה עכירות מתרחשות במהלך השתלה חריפה יותר טוב. גם שיטות בתצהיר אחרות יכולות לשמש כדי לשנות את האלקטרודות. עם זאת, תמיד צריכה להיות כלולה אלקטרודות ללא ציפוי כהתייחסות לאלקטרודות הבדיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לתמיכה של המועצה למחקר האוסטרלי באמצעות המרכז למצוינות לElectromaterials מדע.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Programmable Attenuator | TDT | PA5 | Controls the amplitude of the acoustic signal across frequencies |
| Electrostatic speaker driver | TDT | ED1 | Drives the electrostatic speakers (EC1) |
| Coupled electrostatic speaker | TDT | EC1 | Delivers sound to the animal |
| Processing base station | TDT | RZ2 | Records neural activity from electrode array (using PZ2 preamplifier) |
| Preamplifier | TDT | PZ2-256 | 256-channel high impedance preamplifier |
| Multifunction Processor | TDT | RX6 | Used to generate acoustic stimuli |
| Multichannel electrode | NeuroNexus Technologies | A4 × 8–5mm-200-200-413 | 4-shank 32-channel electrode array |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI660B | Deposits electrode coatings and performs cyclic voltammetry and EIS (used with CHI684) |
| Multiplexer | CH Instruments | CHI684 | Switches between electrodes on the potentiostat |
| Disodium phosphate | Fluka | 71644 | Used in the test solution |
| 3,4-Ethylenedioxythiophene (EDOT) | Sigma Aldrich | 483028 | An electrode coating material |
| para-Toluene sulfonate (Na2pTS) | Sigma Aldrich | 152536 | An electrode coating material |
| Urethane | Sigma Aldrich | U2500 | Used to anesthetize the animal |
| Silver/Silver chloride electrode | CH Instruments | CHI111 | Used for testing the electrode in vitro |
| Platinum electrode | CH Instruments | MW4130 | Used for testing the electrode in vitro |
| Motorized microdrive | Sutter Instruments | DR1000 | To control the electrode array position during surgery |
| Enzymatic cleaner | Advanced Medical Optics | Ultrazyme | Cleans the protein off the electrode array after implantation |
| Acoustic enclosure | TMC Ametek | 83-501 | Isolates the animal from acoustic and electrical noise |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | 1430 | Secures and positions the animal |
| Temperature controller | World Precision Instruments | ATC1000 | Controls the animal temperature |
| Bone drill | KaVo Dental | K5Plus | Used to perform the craniectomy |
| Aspirator | Flaem | Suction pro | Used to perform the craniectomy |
References
- Oluigbo, C. O., Rezai, A. R. Addressing Neurological Disorders With Neuromodulation. IEEE Trans. Biomed. Eng. 58, 1907-1917 (2011).
- Shivdasani, M. N., Mauger, S. J., Rathbone, G. D., Paolini, A. G. Inferior Colliculus Responses to Multichannel Microstimulation of the Ventral Cochlear Nucleus: Implications for Auditory Brain Stem Implants. J. Neurophysiol. 99, 1-13 (2008).
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep Brain Stimulation. Ann. Rev. Neurosci. 29, 229 (2006).
- Weaver, F. M., et al. Bilateral Deep Brain Stimulation vs Best Medical Therapy for Patients With Advanced Parkinson Disease. J. Am. Med. Assoc. 301, 63-73 (2009).
- Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays. Exp. Neurol. 195, 115-126 (2005).
- McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J. Neural Eng. 6, (2009).
- Liu, X., et al. Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes. IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).
- Rousche, P. J., Normann, R. A. Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex. J. Neurosci. Methods. 82, 1-15 (1998).
- Williams, J. C., Rennaker, R. L., Kipke, D. R. Long-term neural recording characteristics of wire microelectrode arrays implanted in cerebral cortex. Brain Res. Protoc. 4, 303-313 (1999).
- Harris, A. R., et al. Conducting polymer coated neural recording electrodes. J. Neural Eng. 10, (2013).
- Bard, A. J., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods. , Wiley. (2001).
- Ludwig, K. A., Uram, J. D., Yang, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. Chronic neural recordings using silicon microelectrode arrays electrochemically deposited with a poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) film. J. Neural Eng. 3, 59 (2006).
