Summary
ويهدف النهج وصفها النسبية، كمية البروتين في الحصول على نظرة ثاقبة لتكوين المجمعات multiprotein في ظل ظروف مختلفة، ويتجلى من خلال مقارنة سلالات مختلفة وراثيا. للتحليل الكمي يتم خلط كميات متساوية من كسور مختلفة من التدرج كثافة السكروز وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة.
Abstract
يوفر بروتوكول أدخلت أداة لتحليل المجمعات multiprotein في الغشاء الثايلاكويد، من خلال الكشف عن نظرة ثاقبة تكوين معقدة في ظل ظروف مختلفة. في هذا البروتوكول ويتجلى هذا النهج من خلال مقارنة تكوين البروتين المسؤول معقدة للدوري تدفق الإلكترونات (CEF) في كلاميدوموناس reinhardtii، معزولة عن سلالات مختلفة وراثيا. ويتألف الإجراء عزل الأغشية الثايلاكويد، تليها انفصالهما في المجمعات multiprotein بواسطة السكروز الطرد المركزي التدرج الكثافة، SDS-PAGE، مناعي والمقارنة، قياس الطيف الكتلي الكمي (MS) على أساس وضع العلامات الأيضية التفاضلية (14 N / 15 N) من سلالات تحليلها. يتم تحميل الأغشية الثايلاكويد solubilized المنظفات على التدرجات كثافة السكروز في تركيز الكلوروفيل متساوية. بعد تنبيذ فائق، يتم فصل التدرجات إلى كسور، التي يتم تحليلها بواسطة الشامل spectrometراي يعتمد على حجم مساو. هذا النهج يتيح التحقيق في تكوين داخل الكسور التدرج وعلاوة على ذلك لتحليل سلوك الهجرة من البروتينات المختلفة، مع التركيز خصوصا على ANR1، CAS، وPGRL1. علاوة على ذلك، ويتجلى هذا الأسلوب من خلال التأكد من نتائج مع immunoblotting وبالإضافة إلى ذلك بدعم النتائج من الدراسات السابقة (تحديد والهجرة تعتمد على المبادرة من البروتينات التي تم وصفها سابقا لتكون جزءا من CEF-supercomplex مثل PGRL1، FNR، و CYT و). والجدير بالذكر أن هذا النهج ينطبق على معالجة مجموعة واسعة من الأسئلة التي هذا البروتوكول يمكن اعتمادها وعلى سبيل المثال تستخدم لتحليلات مقارنة للتكوين معقدة multiprotein معزولة عن الظروف البيئية المتميزة.
Introduction
ويمكن لعمليات التمثيل الضوئي في الأغشية الثايلاكويد من النباتات والطحالب تعمل في وضع الخطية ودوري. خلال الخطية تدفق الإلكترونات (LEF) الضوئي الأول (PSI)، الضوئي الثاني (PSII) والسيتوكروم ب 6 / و في نهاية المطاف نقل الالكترونات من الماء إلى NADP + 1، مما يؤدي إلى توليد NADPH و ATP 2. في المقابل، دوري تدفق الإلكترونات (CEF)، والذي يعرف ليكون ذلك حافزا تحت ظروف بيئية متنوعة مثل الدولة 2 3 4 شروط واللاهوائية، والنتائج في إعادة الحد من PSI أكسدة عن طريق حقن الإلكترونات مرة أخرى إلى سلسلة نقل الإلكترون. هذه العملية يمكن أن تتم إما في الجانب اللحمية من السيتوكروم ب 6/1 و المعقدة أو في بركة كينون صانعي 5 ويولد ATP، ولكن لا NADPH 2.
الهدف من البروتوكول هو عرض ليبرهن على وجود الطيف الكتلي (MS) على أساس مethod للمقارنة، والتحليل الكمي من المجمعات multiprotein في الأغشية الثايلاكويد من كلاميدوموناس reinhardtii إلى التبصر في تكوين هذه المجمعات في ظل ظروف مختلفة (يتضح من المقارنة بين سلالات مختلفة وراثيا). تم تطبيق هذا النهج في منشور من قبل Terashima وآخرون في عام 2012 مما يدل على كا 2 + التي تعتمد على التنظيم من مركز دراسات الحدود في C. reinhardtii بوساطة مجمع multiprotein بما في ذلك البروتينات CAS، ANR1، وPGRL1 6. وسيتم شرح الإجراء من خلال تحليل مقارن لتكوين CEF-supercomplex في اثنين من سلالات مختلفة وراثيا، وبالتالي الاستفادة من وضع العلامات واحدة من سلالتين مع النيتروجين الثقيلة (15 N). لفترة وجيزة، ويتضمن بروتوكول إعداد الأغشية الثايلاكويد، تليها الانحلالية المنظفات وتجزئة المجمعات الضوئي في التدرج كثافة السكروز. بعد تجزئة التدرج، اختار فاركستعقد من سلالتين مختلطة على أساس حجم مساو، مفصولة SDS-PAGE تليها الهضم في جل واللاحقة تحليل MS الكمي.
كما ذكر أعلاه، هو فعل CEF تحت ظروف بيئية مختلفة ونشر اعتبارا من عام 2010 يدل على عزلة وظيفية CEF-supercomplex من الدولة 2 الخلايا المؤمنة من C. reinhardtii 7، التي كان يؤديها عن طريق فصل الأغشية الثايلاكويد solubilized على التدرج كثافة السكروز خلال تنبيذ فائق. مختلفة من إيواي وآخرون. 7، يصف بروتوكول المعروضة عزلة CEF-supercomplex من اللاهوائية نمت C. الثقافات reinhardtii باتباع إجراء بديل. هذا وتضم التغييرات في بروتوكول العزلة الثايلاكويد فضلا عن الاختلافات بشأن الخطوة الانحلالية وفصل المجمعات البروتين بواسطة تنبيذ فائق. في هذا البروتوكول، والأغشية الثايلاكويديتم عزل بتطبيق الإجراء الذي نشرته تشوا وBennoun 8، في حين أن مخازن تستخدم لإعداد الثايلاكويد بواسطة إيواي وآخرون. تضم 25 ملي مس، 0.33 M السكروز، 5 ملي MgCl 2، 1.5 ملي مول كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.5) كما هو موضح 9. تم إجراء الانحلالية مع المنظفات 0.7-0.8٪ (ن tridecyl-β-D-مالتوزيد) لمدة 30 دقيقة على الجليد في حالة إيواي وزملاء العمل، في حين أن طريقة الإذابة وصفها هنا تعتمد على استخدام المنظفات بنسبة 0.9٪ (ن دوديسيل-β-D-مالتوزيد (β-DM)) ويتم تنفيذ سوى 20 دقيقة على الجليد. تستخدم كلتا المجموعتين 0.8 ملغ من الكلوروفيل لكل مل لإذابة المنظفات مع كل منها. لفصل المجمعات الضوئي من الأغشية الثايلاكويد solubilized إيواي وآخرون. تطبيق تركيزات السكروز بين 0،1-1،3 م، في حين أن واضعي هذا البروتوكول يستخدم بتركيزات تتراوح 0،4-1،3 م الفرق الأخير هو سرعة الطرد المركزي، والذي هو أقل مقارنة إلى عصامنشر rlier.
تم تطبيقه بالفعل الانحلالية الأغشية الثايلاكويد مع المنظفات غير أيوني تليها كثافة السكروز التدرج التجزئة في العديد من الدراسات تتراوح من 1980s وحتى اليوم 7، 9-14، وكذلك تطبيق وضع العلامات الأيضية للبروتينات هو الأسلوب على نطاق واسع في مجال تحليل البروتينات. النهج وصف ينطبق على وضع العلامات 15 N الأيض واحد من اثنين من سلالات مقارنة عن طريق زرع في وجود النيتروجين الثقيل كمصدر للنتروجين وحيد في شكل 15 N NH 4 CL، التي يتم تضمينها في جميع الأحماض الأمينية التي تؤدي الى كتلة التحول تبعا لتسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد. عند تحليل خليط من 14 N و 15 N ضمن واحدة MS تشغيل، ويمكن استخدام هذا التحول الشامل إلى تحديد منشأ العينة لكل الببتيد ببتيد والنسبية يمكن حساب الكميات المتوفرة تمثل فرة نسبية لتتوافقالبروتين 15 جي.
العديد من الدراسات الكمية على تحليل البروتينات C. هي reinhardtii المتاحة، التي تقارن كمية محددة من البروتين لتحليل التغيرات في بروتيوم بين الظروف التجريبية (مثل التغيرات في بروتيوم بسبب المغذيات 16-19 أو ضوء التوتر 20،21). مقارنة مع تلك الدراسات، في نهج مطروحة حاليا يتم الجمع بين أحجام متساوية من العينات وتحليلها. هذا الإعداد يسمح لدراسة سلوك الهجرة من البروتينات داخل التدرج وعلاوة على ذلك لتحليل تكوين مجمعات مختلفة فيما يتعلق سلالات التحقيق.
وسيتم شرح هذه الطريقة من خلال التركيز بشكل رئيسي على ثلاثة بروتينات: المرشح الأول هو البروتين استشعار الكالسيوم CAS-المترجمة بلاستيدات الخضراء، والتي تبين أن تشارك في الصور التأقلم في C. reinhardtii 22 يعتبر الكالسيوم لتكون إشارة مهمةايون جي للمسارات التي يتم تفعيلها نظرا لمختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية الرائدة في النهاية إلى تغيرات في التعبير الجيني والخلايا الفسيولوجيا 23 واقترح أن البلاستيدات الخضراء يمكن أن تسهم في الخلوية كا 2 + إشارات عبر البروتينات CAS 22،24،25. البروتين الثاني هو ANR1 (استجابة اللاهوائية 1 6)، وهو البروتين الذي تبين أن يسببها نقص الأكسجين تحت ظروف النمو في C. reinhardtii 26. ولا سيما، CAS وكذلك ANR1 تم تحديدها باعتبارها مفارز من CEF-supercomplex وعلاوة على ذلك، باستخدام النهج الوراثية العكسية، وقد تبين أن كلا من البروتينات تسهم ظيفيا لمركز دراسات الحدود في الجسم الحي 6، ودعم دورها في مفارز وظيفية من هذا المجمع البروتين. البروتين الثالث هو الثايلاكويد البروتين PGR5 على غرار 1 (PGRL1)، والذي يظهر أن تشارك في CEF في كلاميدوموناس 4،27 وكذلك في نبات الأرابيدوبسيس 5،28 وكان أيضا معرفentified في عمل إيواي وآخرون. 7
وسيقدم هذا النهج من خلال إظهار نتائج تجربتين مختلفتين: wildtype (WT) مقابل (مقابل) سلالة ΔPSI 29، واظهار حذف الجين psab، والترميز لالضوئي ضروري أنا الوحيدات، والتي هي أيضا جزء من CEF-supercomplex وWT مقابل لpgrl1 خروج المغلوب سلالة 4. لكل من هذه التجارب تكوين كمية من CEF-supercomplex بين 15 و N وقد تم مقارنة سلالة N 14 المسمى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة من كلاميدوموناس
- وC. التالية واستخدمت reinhardtii سلالات في هذه الدراسة: WT cc124، WT-cw15 arg7 (جدار الخلية ناقصة وأرجينين عوني التغذي)، وهو ΔPSI سلالة متحولة 29 وpgrl1 خروج المغلوب سلالة 4.
- وقد نمت جميع سلالات في تريس، خلات فوسفات (وات) المتوسطة 30، عند 25 درجة مئوية مع شدة الضوء المستمر من 20-50 μE / م 2 ثانية واهتزاز في 120 دورة في الدقيقة. ينبغي أن تكون ملفوفة ثقافة ΔPSI مع بعض المناديل الورقية لالتعرض للضوء من <5 μE / م 2 ثانية.
- ثقافات السلالات المسمى (ΔPSI وWT cc124، على التوالي) الوارد 7.5 ملي 15 N NH 4 CL، في حين أن الثقافات لسلالات nonlabeled (WT-cw15 arg7 وpgrl1، على التوالي) الوارد 7.5 ملي 14 N NH 4 CL. الخلايا أن تنمو لمدة أربعة على الأقل generatيجب أن تبقى الأيونات لتحقيق وضع العلامات الكاملة وفي مرحلة النمو الأسي.
- في اليوم قبل بدء العد التجربة وتمييع الخلايا إلى كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل في حجم 750 مل على الأقل / السلالة.
يرجى ملاحظة أن نوعين من الكثافة متقطع التدرجات السكروز موصوفة في بروتوكول التالي. التدرجات كثافة الضوئي السكروز وفقا لتاكاهاشي وآخرون. 9 تستخدم للفصل بين مختلف المجمعات البروتين الضوئي من thylakoids معزولة وsolubilized خلال الإفراط في الليل الطرد المركزي، ويجب أن يكون مستعدا في اليوم السابق (انظر بروتوكول 2) والثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز يتم تطبيق 8 في إجراء العزل الثايلاكويد (انظر البروتوكول 3).
2. إعداد الضوئي السكروز التدرجات الكثافة
- للصب التدرجات وهناك حاجة إلى ثلاثة حلول الأوراق المالية:
- 2 M السكروز
- 10٪ β-DM في H 2 O
- 0.5 M Tricine، ودرجة الحموضة 8.0 (هيدروكسيد الصوديوم)
- باستخدام هذه الأسهم، وإعداد الحلول التالية:
التركيز: 1.3 M 1.0 M 0.85 M 0.7 M 0.65 M 0.4 M 2 M السكروز 13 مل 10 مل 8.5 مل 7 مل 6.5 مل 4 مل 10٪46؛-DM 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 0.5 M Tricine 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر H 2 O 6.7 مل 9.7 مل 11.2 مل 12.7 مل 13.2 مل 15.7 مل - استخدام أنابيب 14 ملم X 89 ملم الطرد المركزي وتصب التدرجات ببطء شديد، بدءا من أعلى كثافة حل السكروز إلى انخفاض كثافة حل.
- صب 1 مل فقط لكل من 1.3 و 1.0 M حلول و 2 مل لبقية الحلول.
- ترك بين عشية وضحاها التدرجات في غرفة باردة.
3. اللاهوائية التعريفي وعزل الثايلاكويد الأغشية 8
- قبل البدء مع العزلة الأغشية الثايلاكويد، لحث الظروف اللاهوائية التي كتبها محتدما مع الأرجون لمدة 4 ساعة. لا يمكن أن يؤديها محتدما من خلال ماصة الزجاج في زراعة قوارير مع الخلط المستمر للثقافة مع شريط مغناطيسي.
- تبدأ مع العزلة الأغشية الثايلاكويد بواسطة التكوير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 2،500 x ج، resuspend في H1 العازلة (0.3 M السكروز، 25 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 5 ملي MgCl 2).
(يرجى ملاحظة أنه عند بدءا من عزل عينات الثايلاكويد الأغشية SHأولد أن تبقى على الجليد لتجنب تدهور البروتين، وتتم جميع الخطوات الطرد المركزي بها في 4 درجات مئوية، والعمل مع قفازات ينصح بشدة لتجنب التلوث الكيراتين.) - خلايا بيليه لمدة 5 دقائق عند 2،500 x ج، resuspend في المخزن المؤقت H1.
- كسر الخلايا مع ممرين من خلال البخاخات مع ضغط النيتروجين من 1،500 HPA (لسلالات دون جدار الخلية القيام مرور واحد فقط).
- تدور باستمرار خلايا لمدة 7 دقائق في ز × 2،500.
(بعد هذه الخطوة يجب أن يكون طاف الضوء الأخضر، وإذا لم يكن كذلك، كان الكسر الخليوي غير ناجحة.) - خلايا resuspend في H2 العازلة (0.3 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)) وخلايا بيليه لمدة 10 دقيقة في 32،800 ز س.
- Resuspend الخلايا في المخزن H3 (1.8 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)) والتجانس مع بيليه بوتر (لا ينبغي أن تظل جسيمات الأخضر في نهاية هذه الخطوة العمل).
- إعداد الثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز في الحوضوفاق (25 ملم × 89 ملم) من خلال البدء في الجزء السفلي بطبقة من 12 مل H3 العازلة مع الخلايا، صب طبقة وسطى من 12 مل H4 العازلة (1.3 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA ( ودرجة الحموضة 8.0)) وعلى رأس 12 مل H5 العازلة (0.5 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)). كن حذرا عند صب التدرجات وتجنب خلط من ثلاث طبقات.
- تحقيق التوازن مع H5 العازلة وأجهزة الطرد المركزي الثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز لمدة 1 ساعة في 70700 ز س.
- إزالة العصابات الثايلاكويد من الثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز وتمييع لهم وجود مخزن مؤقت حجم H6 المناسب (5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5) 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)).
- تدور باستمرار خلايا في 37،900 x ج لمدة 20 دقيقة. إذا كان بيليه ليست ضيقة، ويحتاج إلى المزيد من العازلة H6 لهذه الخطوة الطرد المركزي.
- في resuspend thylakoids في منطقة عازلة H6 حجم صغير والمضي قدما بعزم تركيز الكلوروفيل.
4. تحديد تركيز الكلوروفيل 31
- يتم تنفيذ تحديد كمية الكلوروفيل مع 80٪ الأسيتون.
- مزيج 995 ميكرولتر 80٪ الأسيتون و 5 ميكرولتر من thylakoids في المخزن H6 (التخفيف 1:200).
- دوامة لمدة عدة ثوان حتى لا تظل جسيمات الخضراء ثم تدور إلى أسفل في 14.1 x ج لمدة 5 دقائق.
- اتخاذ طاف وقياس الانقراض في 663.6 نانومتر و646.6 و 750 نانومتر، على التوالي.
- حساب كمية الكلوروفيل باستخدام الصيغ التالية:
- C كلوروفيل أ [مغ / مل] = (0.01225 * E 663،6-0،00255 * E 646،6) * عامل التخفيف
- C كلوروفيل ب [مغ / مل] = (0.02031 * E 646،6-0،00491 * E 663.6) * عامل التخفيف
- C كلوروفيل [مغ / مل] = C + C كلوروفيل وكلوروفيل ب
5. تحميل الضوئي السكروز التدرجات الكثافة
- حساب كميات من thylakoids، β-DM وعازلة H6 أن هناك حاجةلكل التدرج:
- يجب أن يتم تحميل كل التدرج مع حجم مجموعه 700 ميكرولتر مع 0.8 ملغ / مل الكلوروفيل في 0.9٪ β-DM (حل β-DM في H 2 O)، وملء حجم المتبقية مع العازلة H6.
- لالانحلالية إعداد مأخوذة مختلفة مع thylakoids، β-DM وعازلة H6 لكل التدرج.
- ترك العينات لمدة 20 دقيقة على الجليد مع خلط بانتظام (قلب) كل بضع دقائق (الخطوة الانحلالية).
- أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة (14،000 XG) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
(بعد الطرد المركزي، ينبغي أن يكون بيليه صغيرة وبيضاء بينما طاف هو الخضراء الداكنة.) - تحميل طاف على التدرجات.
- تحقيق التوازن مع H6 العازلة وتدور باستخدام نابذة فائقة السرعة في XG 134470 ليلة وضحاها (14 ساعة) في 4 درجات مئوية.
(يرجى ملاحظة أن فصل ناجحة المجمعات الضوئي باستخدام التدرجات كثافة الضوئي السكروز كما وردت في هذا البروتوكول ويتحقق فقط عندما النقيبز طازجة معزولة thylakoids، لأن التنبؤ لإذابة وفصل معقدة من الصعب جعل عند العمل مع الأغشية الثايلاكويد التي تم تجميدها من قبل.)
6. من تجزئة الضوئي السكروز التدرجات الكثافة
- التقاط صور للالتدرجات.
- ثقب حفرة في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام إبرة والتدرجات يجزئ في 500 ميكرولتر أنابيب. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن يؤديها تجزئة باستخدام لوحة 96 جيدا (صفيحة ميكروسكوبية).
- عند استخدام صفيحة ميكروسكوبية، وتحديد الامتصاصية من كسور مختلفة في التدرج 675 نانومتر.
(في هذه الخطوة يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع.)
7. SDS-PAGE ومناعي
(يرجى ملاحظة أن فقط للمقارنة WT مقابل ΔPSI تم إجراء تحليل لطخة غربية لتحديد الكسور لاحقة MS-التحليل. للتجربة WT مقابل pgrl1 الابوقد تم اختيار الأعمال التي تقوم بها وسائل الامتصاصية في كسور مختلفة.)
- منفصلة 30 ميكرولتر من كل جزء من WT وΔPSI التدرج على 13٪ SDS بولي أكريلاميد هلام 32.
- إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة 33 التالية: ANR1 (TEF7) 26، PGRL1 34، CAS 6، وPSAD PSI 32 الوحيدات وجوهر PSII الوحيدات D1. استخدام جميع الأجسام المضادة مع التخفيف من 1:1،000 (لتعزيز لمعان كيميائي تقنية الكشف)، باستثناء الأجسام المضادة D1، التي ينبغي استخدامها مع التخفيف من 1:10،000.
- استنادا إلى نتائج مناعي، واتخاذ الكسور ذروة ANR1، PGRL1 وPSAD لWT وΔPSI (هنا الكسور 6 و 13، على التوالي)، ومزيج 30 ميكرولتر من جزء 6 من WT وΔPSI وتفعل الشيء نفسه مع جزء من 13 كلا الاستعدادات وفصلها مرة أخرى على 13٪ هلام SDS بولي أكريلاميد.
- لمقارنة كمية من WT مقابل pgrl1 اتخاذ Cالكسور-EF supercomplex على النحو الذي يحدده قياس الامتصاصية في كسور مختلفة ومتدرجة مزيج 30 ميكرولتر من كل من العينات يليه فصل على 13٪ هلام SDS بولي أكريلاميد.
- وصمة عار على العصابات البروتين مع Coomassie حل (حمض الفوسفور 85٪، كبريتات الأمونيوم 757 ملم، 1.2٪ Coomassie الرائعة الأزرق، 20٪ الميثانول) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية.
- لإزالة تلطيخ غير محددة، ويغسل عدة مرات مع DDH 2 O.
- قطع الممرات في 1 ملم قطعة هلام والمضي قدما في عملية الهضم في هلام.
(بدلا من ذلك، يمكن أن تجفف عينات قليلة في جهاز للطرد المركزي فراغ دقائق وتخزينها لبضعة أسابيع قبل متابعة عملية الهضم في جل.)
8. في جل الهضم (معدلة من شيفشينكو وآخرون 35)
يرجى ملاحظة أن يعد جميع مخازن والحلول قبل فترة وجيزة من استخدام واتخاذ قناني زجاجية للمخازن تحتوي على أسيتونتريل (ACN). <ر /> تنبيه! العمل مع ACN قد تكون ضارة، ويمكن تحميلها من على مزيد من المعلومات: http://www.sciencelab.com/msds.php؟msdsId=9927335 (2013).
- غسل قطعة هلام مع> 10 مجلدا من ده 2 O (~ 200 ميكرولتر) لمدة 30 ثانية.
- احتضان القطع هلام مع 300 ميكرولتر من 25 ملي NH 4 HCO 3 لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز، وإزالة السائل.
- احتضان القطع هلام مع 300 ميكرولتر من 25 ملي NH 4 HCO 3 في 50٪ ACN (إعداد عن طريق خلط ACN و 50 ملي NH 4 HCO 3 في نسبة 1:1) لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز، وإزالة السائل.
- إذا القطع هلام لا تزال زرقاء، كرر NH 4 HCO 3 و 4 NH HCO 3 / ACN يغسل حتى تتم إزالة معظم Coomassie.
(على الرغم من أن الجزء الأكبر من تلطيخ Coomassie يجب إزالة، فإنه ليس من الضروري أن يزيل اللون القطع هلام تماما.) - إضافة 100 ميكرولتر من ACN ليذوى القطع هلام لمدة 5 دقائق. يجب القطع هلام تقليصالثانية تبدو بيضاء تماما.
- إزالة أكبر قدر ممكن ACN والمضي قدما مع التربسين الهضم. بدلا من ذلك، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع.
- إضافة 10-20 ميكرولتر في عصابة من 20 نانوغرام / ميكرولتر التربسين في ACN 10٪ / 25 ملي NH 4 HCO 3 (المخفف الطازج)، والحفاظ على العينات على الجليد.
- بعد 30 دقيقة، ومعرفة ما اذا كان تم استيعاب جميع الحل وإضافة المزيد من العازلة التربسين، إذا لزم الأمر. قطعة هلام ينبغي تغطيتها تماما مع العازلة التربسين. الاحتفاظ بعينات على الجليد.
- ترك قطعة هلام لمدة 90 دقيقة أخرى على الجليد لتشبع لهم التربسين.
(الخطوة الحرجة: العائد من الببتيدات زيتية يزيد بشكل كبير مع زيادة مرات حضانة على الجليد، وربما بسبب انتشار بطيء للانزيم في مصفوفة بولكرلميد ومن الضروري أن يكون هناك زيادة صغيرة من محلول تغطي القطع هلام لتجنب أن القطع. تقع جافة خلال فترة الحضانة بين عشية وضحاها.) - هضم عند 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة. للتجارب التي تتطلبانتعاش الببتيد القصوى، هضم ليلة وضحاها.
- بعد هضم تدور باستمرار عازلة الموجزة.
- أنابيب يصوتن لمدة 5 دقائق إلى أزل الببتيدات وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
- جمع طاف وتحويلها إلى أنبوب جديد.
- أداء استخراج الببتيد مع 80 ميكرولتر من 30٪ ACN / 1٪ حمض الفورميك (FA) في حمام الصوتية لمدة 15 دقيقة.
- أداء استخراج مع 80 ميكرولتر من 30٪ ACN / 1٪ FA في حمام الصوتية لمدة 15 دقيقة.
- أداء استخراج مع 80 ميكرولتر من 70٪ ACN / 1٪ FA في حمام الصوتية لمدة 15 دقيقة.
- الطرد المركزي مرة أخرى وتجمع طاف مع شطافة مسبق.
(FA يعمل على تعطيل التربسين وزيادة الببتيد الذوبان.) - الحل الببتيد جافة تماما في جهاز للطرد المركزي فراغ.
(عند هذه النقطة يمكن تخزين العينات لبضعة أسابيع في -20 درجة مئوية قبل الشروع في MS-التحليل.) - الببتيدات resuspend في 6 ميكرولتر MS العازلة (5٪ ACN، 0.1 ت / ت FA، والمياه) ويصوتن لمدة 2-5 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في عينات كحد اقصىسرعة م لمدة 5 دقائق لإزالة المواد الجسيمية.
- استخدام 4 ميكرولتر من طاف للتحليل الطيفي الشامل.
9. MS-تحليل البيانات مع "Proteomatic"
تم إجراء تحليل البيانات مع برمجيات المصدر المفتوح "Proteomatic" (التي يمكن تحميلها في http://www.proteomatic.org/)، وهي المنصة التي تسمح للتوليد واستكمال MS / MS أنابيب تقييم البيانات، وذلك باستخدام البرمجيات الحرة والتجارية 36. لفترة وجيزة، تم وصفها الإعدادات أدناه ويمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلا في 6،26.
- تحديد وتقدير حجم البيانات MS-
تم القيام به تحديد وتقدير من البروتينات من التجارب WT مقابل ΔPSI مع OMSSA (الإصدار 2.1.4 37) وqTrace 26، على التوالي، كما هو موضح 6،26. لتحليل البيانات MS-من التجربة WT مقابل pgrl1 خط أنابيب المحدث التالية تم استخدامها:- بالإضافة إلى OMSSA 37، تم تحديد البروتينات أيضا مع X! جنبا إلى جنب (الإصدار 2013/02/01 38). تم تطبيق الخوارزميات على حد سواء من خلال البحث مقابل قاعدة بيانات تم إنشاؤها من خلال الجمع بين JGI كلاميدوموناس قاعدة بيانات نموذج الجين الإصدار 4.3 مع إصدار قاعدة بيانات AUGUSTUS 10.2 وكذلك ضد قاعدة بيانات انضم للNCBI قواعد البيانات BK000554.2 وNC_001638.1.
- تم تنفيذ MS 2 تحديد الببتيدات باستخدام نهج المستهدفة شرك 39. تم إنشاء شرك لكل من البروتين عن طريق خلط عشوائيا الببتيدات زيتية مع الحفاظ على التكرار من الببتيدات nonproteotypic.
- تم إجراء التحقق من صحة الإحصائية من الببتيدات مع qvality البرمجيات (الإصدار 0.3.3 40) باستخدام احتمال الخطأ الخلفي (PEP) عتبة تم تصفيتها أقل من 0.01 والنتائج مع التسامح السلائف الشامل من 5 جزء في المليون.
- الببتيدات من OMSSA وX! وانضم أشواط جنبا إلى جنب مع وكميا qTrace
للتحقيق في ما إذا كانت نسب البروتين كانت مختلفة بشكل ملحوظ تجاه بعضهم البعض في الكسور-CEF supercomplex مختلطة من WT وpgrl1، تم إجراء التحليل الإحصائي SPSS تطبيق البرمجيات (الإصدار 21). تم اختبار مفارز السيتوكروم ب 6 / و معقدة ضد بعضها البعض، فضلا عن البروتينات FNR، FTSH2 وHCF136 ضد مفارز PSI. تم اختبار نسب الببتيد من كل تهمة مسح في البروتين من كل أربعة مكررات للتوزيع العادي مع اختبار شابيرو، يلكس. منذ لم توزع السكان عادة الببتيد (ع <0.001)، وقد أجريت الإحصاءات اللامعلمية. أولا، تم تطبيق اختبار كروسكال واليس تقييم اختلاف كبير بين المجموعتين. إلا إذا توقع هذا الاختبار فرق كبيرق بين المجموعات، تم إجراء مزيد من التحليل للتنبؤ فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعتين مستقلة مع اختبار مان ويتني U-.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويهدف النهج الكمي البروتيوميات قدم لوصف تكوين المجمعات multiprotein في الأغشية الثايلاكويد يتبين من تحليل مقارن لمكونات CEF-supercomplex في مختلف وراثيا C. reinhardtii السلالات. وقد تم بنجاح تطبيق الطريقة الموصوفة من قبل Terashima وآخرون. 6 وتضم عزلة الأغشية الثايلاكويد من اللاهوائية نمت الثقافات، تليها المنظفات الانحلالية. بعد ذلك، يتم تحميل العينات على التدرج كثافة السكروز على أساس تساوي كمية الكلوروفيل ومجزأة المجمعات بواسطة تنبيذ فائق. لكمية MS-تحليل يتم خلط كميات متساوية من اثنين الكسور التدرج من سلالات مختلفة وتحليلها نسبيا (الشكل 1). تشمل النتائج المقدمة مقارنة الكسر-CEF supercomplex بين WT-cw15 arg7 وΔPSI وكذلك WT cc124 وpgrl1، على التوالي.
معشوقة = "jove_content"> وبالنسبة للمقارنة بين مكونات CEF-supercomplex بين WT وΔPSI سلالة جزء 6، إيواء CEF-supercomplex في WT وجزء 13، جزء ذروة ANR1 في سلالة ΔPSI، كما يتضح من تحليل طخة مناعية (أرقام 2A و 2B) وقد تم اختيار 6. الشكل 3 يصور نسب البروتين النسبية كما WT / ΔPSI (14 N / 15 N) لعدة PSI الأساسية والبروتينات LHCI (البروتينات الحصاد ضوء PSI ويسمى أيضا البروتينات Lhca) وكذلك لتعيين البروتينات مع CEF-supercomplex. كما هو متوقع، تم العثور على البروتينات الأساسية PSI فقط في عينات WT يتضح من نسب ما لا نهاية في كل من الكسور. يتم إثراء Lhca2 وLhca9 في WT، في حين Lhca4 -6 -8 وتظهر لائحة مختلفة في كل من الكسور. من المهم أن نلاحظ أن البروتينات LHCI تم تجميعها وتراكمت عادة في متحولة ΔPSI 41. المقارنة ببتيد من PSI-LHCIمعقدة من C. كشفت reinhardtii WT مع مجمع LHCI من متحولة ΔPSI أن غالبية Lhca2، -3 -9 ويبدو أن فقط ضعيفة بد أن LHCI وعلاوة على ذلك أن وجود جوهر المبادرة هو ضروري لملزمة مستقرة. في المقابل، Lhca1، -4، -6، -7، و-8 تشكيل مستقلة المعقدة للجمعية PSI 14، والتي يمكن أن تفسر تنظيم مختلف من Lhca4، -6 و -8 في التجربة الحالية.
للبروتينات يجب تعيينه مع CEF-supercomplex، فإنه يمكن التمييز بين تلك التي هي أكثر وفرة في WT جزء 6 وجزء 13 من متحولة ΔPSI، مما يدل على هجرة قوية تعتمد على PSI عرض بنسب أعلى من واحد لجزء 6 و أقل نسب من واحد أو لم يتم الكشف في جزء 13 (Lhcbm5، PGRL1، ANR1، CAS، PFD، HCF136 وCYT و) وتلك التي تظهر يست هذه قوية، ولكن مع ذلك التعريب التي تعتمد على PSI (FNR، FTSH1، FTSH2، وATPC ).
مع هذه التجربة Terashima وآخرون. 6 أظهرت السلوك الهجرة تعتمد على PSI لANR1 وCAS (أرقام 2A-D والشكل 3)، مما يكشف لهم عن البروتينات الرواية من CEF-supercomplex، سابقا لم تحدد 7. وقد أكدت نتائج تحليل MS-أيضا مناعي وبدعم من تطبيق علم الوراثة العكسية لتأكيد دور وظيفي من هذه البروتينات لمركز دراسات الحدود في الجسم الحي 6. وعلاوة على ذلك، وهذا MS-المنهج المقارن تؤيد بقوة من نتائج الدراسات السابقة، من خلال التأكد من البروتينات التي سبق أن أثبتت لتكون جزءا من CEF-supercomplex مثل PGRL1، و CYT وFNR 7، وكذلك لإظهار 7،9 Lhcbm5 والتعريب التي تعتمد على المبادرة في التدرج الكثافة السكروز، وهو مشابه لANR1 والاكاديمية.
المقارنة بين 6 و 13 جزء من anr1 وΔPSI باستخدام نفس approacح (انظر الشكل S8 6) أظهرت تركيبة مماثلة من CEF-supercomplex في anr1 ونفس الاتجاه للبروتينات ANR1، CAS وPGRL1 كما كشفت في التجربة WT مقابل ΔPSI. لا سيما، على الرغم من أن نسبة البروتين في جزء من ANR1 6 (anr1 مقابل ΔPSI) يماثل نسبة WT مقابل التجربة ΔPSI، مبالغ CAS وPGRL1 يبدو أن يكون أعلى في التجربة السابقة، وربما يكون نتيجة ل التعويض عن أسفل تنظيم ANR1 6.
الى جانب ذلك، في إثراء ANR1 والاكاديمية في جزء CEF-supercomplex واحد ويمكن أيضا استنتاج الهجرة تعتمد على المبادرة من عدة بروتينات أخرى من هذه التجربة. هذه هي اثنين metalloproteases ATP-تعتمد FTSH1 وFTSH2 التي تلعب دورا أساسيا في تدهور PSII مركز التفاعل البروتين D1 في البلاستيدات الخضراء 42،43، وهي تحتوي على البروتين prefoldin المجال، وHCF136، وهو عامل حاسم لاستقرار أو assembلاي من PSII 44 و الوحيدات γ من أتباز. في حين لواحد في وقت لاحق، نسب بين 6 و 13 جزء لا تظهر مثل هذا فرق واضح، مزيد من التجارب يجب أن تنفذ للتحقق ما إذا كانت بروتينات أخرى قد تكون أيضا مرشحين من CEF-supercomplex.
كدليل على مفهوم التجربة لهذا المنهج المقارن، قمنا بتحليل تركيبة-CEF supercomplex في سلالتين، اللتين لديهما PSI، مما يتيح تشكيل هذا المجمع. وقد تم اختيار الكسور منها استنادا إلى قياسات الامتصاصية من التدرجات مجزأة. أرقام 4A و 4B تظهر نتائج المقارنة الكمية بين WT وpgrl1 خروج المغلوب السلالة. تجدر الإشارة إلى أن ANR1 والاكاديمية لا تتغير بشكل ملحوظ بين WT وpgrl1. ومن المثير للاهتمام، ويبدو HCF136 لتخصيبه في WT، في حين يبدو FTSH2 لتخصيبه في pgrl1. A الاشتراكية إحصائيايمكن تأكيد الفرق gnificant لكل من البروتينات المذكورة أعلاه لجميع مفارز PSI (بما في ذلك البروتينات LHCI).
وعلاوة على ذلك، فإن السيتوكروم ب 6 / مفارز معقدة و CYT و وعرضت بيتو أن تكون مختلفة إلى حد كبير في CYT ب 6، ب CYT 6 / و الرابع وPETC، على التوالي. والجدير بالذكر أن CYT و يبدو أن يصل تنظم في pgrl1، في حين CYT ب 6 و ب 6 CYT / و الرابع بشكل طفيف أسفل التنظيم، على الرغم من أن تنظيم CYT و التوليف ربما ينطوي CYT ب 6 و ب CYT 6/45 و الرابع . وPETC المشفرة من الأسلحة النووية، والذي يعرف أيضا باسم البروتين Rieske يظهر لائحة مماثلة لCYT ب 6 و ب 6 CYT / و الرابع (أي التنظيم في أسفل pgrl1). هذا هو ضرب كتخفيض أو غياب البروتين Rieske لا يزال يؤدي إلى تراكم الغيرإيه CYT ب 6 / و مفارز إلى ~ 60٪ من مستوى WT في C. reinhardtii 46. بالإضافة إلى ذلك، وتنظيم ما يصل من بيتو في pgrl1 المهم أن نلاحظ، منذ أن تم عرض هذا الوحيدات ملزمة فضفاضة لتتراكم إلى انخفاض المستويات في C. reinhardtii المسوخ تفتقر إما CYT ب 6، ب CYT 6 / و الرابع أو PETC 47، والتي هي أقل وفرة في pgrl1 مقارنة WT في التجربة الحالية.
الشكل 1. سير العمل كما هو مبين التجريبية لWT وΔPSI. وصفت عملية الأيض للخلايا لا يقل عن أربعة أجيال، وبفعل الظروف اللاهوائية التي كتبها الأرجون محتدما لمدة 4 ساعة ويتم عزل الأغشية الثايلاكويد خلال فصل التدرج. في عزلةوsolubilized الأغشية تيد باستخدام β-DM، تحميلها على التدرج كثافة السكروز (لكل من سلالات يتم تطبيق كميات متساوية من الكلوروفيل في هذه الخطوة) وطرد بين عشية وضحاها. يتم جمع الكسور التدرج وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وكذلك مناعي لتحديد توزيع البروتينات داخل التدرج. لتحديد البروتينات مع الهجرة التي تعتمد على المبادرة، أحجام متساوية من WT جزء CEF-supercomplex (جزء رقم 6) والمقابلة 15 جزء N المسمى من سلالة ΔPSI كانت مختلطة وتحليلها نسبيا. وقد فعلت الشيء نفسه مع جزء من ذروة ANR1 في سلالة ΔPSI (جزء رقم 13). ل، الكمي MS-المنهج المقارن، تم فصل عينات البروتين مختلطة بواسطة SDS-PAGE، كانت ملطخة العصابات البروتين مع Coomassie حل الزرقاء، تليها عملية الهضم في جل قبل MS-التحليل. انقر هنا لعرض أكبر معهد العالم العربيجنرال الكتريك.
الشكل 2. ANR1 وCAS الهجرة إلى مناطق أقل كثافة في سلالة ΔPSI. ج: تم فصل التدرجات كثافة السكروز من WT وΔPSI thylakoids معزولة عن الظروف اللاهوائية في 20 الكسور B: مناعي من ANR1 في 20 أجزاء من التدرج من WT وΔPSI. في حين يتم ترجمة هذا البروتين إلى المنطقة ذات الكثافة السكانية العالية في WT (جزء 6) فمن يصل تحولت إلى مناطق أقل كثافة في سلالة ΔPSI (جزء 13) C:. التدرجات كثافة السكروز من WT وΔPSI thylakoids معزولة عن تم فصل الظروف اللاهوائية في 27 الكسور D:. مناعي من المستخلصات في 27 أجزاء من التدرج من WT وΔPSI. في حين يتم ترجمة هذا البروتين رس المنطقة ذات الكثافة السكانية العالية في WT (تبلغ ذروتها حول جزء 7) فمن يصل تحولت إلى مناطق أقل كثافة في سلالة ΔPSI (وتبلغ ذروتها حوالي 19 جزء). (تم تعديل هذا الرقم من Terashima وآخرون. 6). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
وقد تم مقارنة الرقم 3. النسبية نسب البروتين في تحديد نسبة 6 و 13 من WT وΔPSI بواسطة مطياف الكتلة الكمية. الكسور 6 و 13 من WT مع الكسور منها من سلالة ΔPSI 15 N المسمى. وصفت نسب البروتين النسبية التي تمثل اثنين وثلاثة مكررات البيولوجية MS-أشواط كما WT / ΔPSI (14N / 15 N) لكلا تحليل الكسور باستثناء و CYT، التي تم تحديدها فقط في جزء 6. هذا القياس الكمي المقارن يكشف أن ANR1 وCAS تظهر الهجرة تعتمد على PSI في التدرج الكثافة السكروز (تم تعديل هذا الرقم من Terashima وآخرون. 6). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. نسب البروتين النسبية تتحدد في جزء CEF-supercomplex من WT وpgrl1 بواسطة مطياف الكتلة الكمية. ج: التدرجات السكروز كثافة WT وthylakoids pgrl1 معزولة عن الظروف اللاهوائية B: نسب البروتين النسبية بين:ن جزء CEF-supercomplex النابعة من أربعة مكررات مختلفة كما هو مبين WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). في هذه التجربة لا يتم تغيير ANR1 والاكاديمية بشكل ملحوظ، في حين FTSH2 وHCF136 تظهر فروق ذات دلالة إحصائية بالمقارنة مع جميع مفارز PSI (ع ≤ 0.001 كما أشار *** باللون الأحمر؛ HCF136: 1900 <U <58127؛ FTSH2: 2117 <U <164197). بالإضافة إلى ذلك، CYT ب 6 / مفارز معقدة و CYT و وعرضت بيتو أن تكون مختلفة كثيرا عن CYT ب 6، ب CYT 6 / و الرابع وPETC، على التوالي (ع ≤ 0.001 كما أشار *** باللون الأزرق؛ CYT و : 2684 <U <11535؛ بيتو: 4700 <U <23663) اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد نشرت دراسات البروتين الكمي المختلفة باستخدام الوسم النظائر مستقرة في السنوات الأخيرة. في هذه التجارب عادة ما تتم مقارنة اثنين من عينات مختلفة، منها هو المسمى عينة واحدة مع النظائر مستقرة. بعد ذلك يتم الجمع بين البروتينات أو الببتيدات من العينتين في نسبة متساوية ومواصلة تجهيزها معا 48. غالبا ما تنوي هذه الدراسات للمقارنة بين حجرات معزولة محددة الخلوية (مثل البلاستيدات الخضراء، الميتوكوندريا، أو الأغشية الثايلاكويد) تتعرض لظروف الإجهاد المختلفة 26،34،49 للتحقيق في أعلى أو أسفل تنظيم بروتينات معينة. ويهدف النهج وصفها النسبية، كمية البروتين لتحليل تكوين المجمعات multiprotein في الغشاء الثايلاكويد و، على النقيض من الدراسات المذكورة أعلاه، تقوم على خلط نفس الحجم من العينات بعد فصل السكروز كثافة الأغشية الثايلاكويد تحميلها في تركيز الكلوروفيل قبل متساوية ultracentrifugaنشوئها. هذه الطريقة تم تطبيقها على نحو فعال من قبل Terashima وآخرون. 6 الذي حلل نسبيا تكوين CEF-supercomplex معزولة من WT وسلالة ΔPSI لتحديد البروتينات تهاجر PSI-تابع في التدرج كثافة السكروز.
ثبت في تحقيق هذه الاستراتيجية من خلال حقيقة أن MS-نتائج معتمدة مزيدا من مناعي. بالإضافة إلى ذلك، Terashima وآخرون. يمكن تأكيد النتائج من الدراسات السابقة (أي التي تعتمد على تحديد وPSI الهجرة من البروتينات التي سبق وصفها لتكون جزءا من CEF-supercomplex، مثل PGRL1، FNR، وCYT و 7). تحديد ANR1 والاكاديمية بوصفها عناصر الرواية من CEF آلات 6 يكشف هذا النهج كأداة قوية وفعالة جدا. ومن الجدير بالذكر أن مركز دراسات الحدود معزولة-supercomplex عرضت في النشاط المختبر، مما يدل على تنقية ناجحة من وظائفهاtional multiprotein المعقدة 6. انطباق هذا النهج أيضا لسلالتين من كلاهما تشكيل وأظهرت CEF-supercomplex من المقارنة بين WT وpgrl1.
بشكل عام، يمكن استخدام هذا الأسلوب لمسح التراكيب المعقدة في سلالات أو ظروف مختلفة كما يتضح من تحديد البروتينات مجهولون في وقت سابق ان يتم copurified مع الكسر-CEF supercomplex (أي تخصيب FTSH1، FTSH2، PFD، وHCF136 في CEF-supercomplex جزء). إذا كانت هذه البروتينات هي مرشحين جدد ممكن من هذا المجمع وتحسين فهمنا لتنظيم مختلف FTHS2، HCF136، وكذلك لCYT ب 6 / و مفارز كما يتضح من مقارنة WT وpgrl1، مزيد من التجارب ضرورية.
إلى جانب المزايا وصفها لهذا النهج، وهناك سيفرآل الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى النظر بعناية عند العمل مع هذا البروتوكول: إن كسر الخلايا مع البخاخات هي الخطوة الهامة الأولى. إذا فتح الخلايا لا تنفذ بطريقة سليمة، فإن العائد من thylakoids معزولة تكون منخفضة نوعا ما، وربما يؤدي إلى لا يكاد أي الكشف عن CEF-supercomplex بعد أكثر من ليلة الطرد المركزي. تعطل ناجحة من الخلايا يمكن الاستدلال من لون الضوء الأخضر من طاف بعد الطرد المركزي. في المقابل، إذا كان الضغط خلال تمزيق الخلايا عالية جدا، وأجزاء من supercomplex قد تتفكك وقد تضيع العوامل المساعدة الهامة. خطوة أخرى تؤثر على العائد من thylakoids هو إعادة تعليق الخلايا مع بوتر. هذا يجب القيام به بعناية وبنهاية هذه الخطوة ينبغي أن تظل قليلة فقط جزيئات الخضراء. علاوة على ذلك، لإعداد كثافة السكروز التدرجات قبل يوم وكذلك لإذابة المجمعات الغشاء، فمن المهم جدا لتتبع بدقة هذا البروتوكول من حيث تركيز β-DM، لأن هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على thylakoids solubilized تماما 50 وبالتالي أيضا لتنقية CEF-supercomplex. وقد تم تنفيذ الخطوة الانحلالية بنجاح إذا لوحظ، بيليه بيضاء صغيرة بعد خطوة الطرد المركزي لاحقة. آخر نقطة حرجة التي ينبغي ذكرها هنا هو الوقت من الإفراط في الليل تنبيذ فائق. يجب طرد التدرجات كثافة السكروز لمدة اثني عشر ساعة على الأقل لتحقيق فصل كامل من المجمعات الضوئي.
على الرغم من ويتجلى باستخدام بروتوكول C. reinhardtii لتحليل مقارن لتكوين CEF-supercomplex في اثنين من سلالات مختلفة وراثيا، فإنه قابل للتكيف بسهولة أيضا على مجموعة واسعة من الأسئلة الأخرى، مثل التحليلات المقارنة للتكوين معقدة multiprotein معزولة عن متميزة البيئية / تجريبيةشروط أو باستخدام أنواع أخرى من تجزئة. المتطلبات الوحيدة لهذا النهج هي التي يمكن زراعتها في كائن نموذج في خلية ثقافة، هي قادرة على استخدام الأمونيوم كما المجمعات مصدر النيتروجين والبروتين يمكن أن تكون مفصولة التدرجات كثافة السكروز، مما يدل على تطبيق واسع لهذه الطريقة. لتطبيقها في المستقبل لهذا النهج SDS-PAGE تجزئة مختلطة من 14 غ / 15 غ العينات واللاحقة الهضم في هلام يمكن الاستعاضة عن تطبيق بمساعدة مرشح عينة إعداد (FASP) الأسلوب. يتضمن هذا الأسلوب تطبيق المنظفات القوية لالانحلالية التي تهدف إلى "تنظيف" بروتيوم قبل الهضم والببتيدات للحصول على النقاء، ومنع مساوئ النهج الهضم في هلام التي يمكن أن تحول دون انتعاش الببتيد، على الرغم من أن واحدة ينبغي أن نعتبر أن في جل يوصف الهضم أن تكون قوية إلى التلوث التي قد تتداخل مع عملية الهضم 51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.
Acknowledgments
يقر MH بدعم من "جمعية الألمانية للبحوث" (DFG). الكاتب المساهمات: تصميم MH البحوث؛ تنفيذ KT، JS وMT البحوث وتحليل البيانات؛ كتب KT وMH الورقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
