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Biology

Une nouvelle approche pour l'analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur Published: March 13, 2014 doi: 10.3791/51103
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

Summary

L'approche décrite comparative, protéomique quantitative vise à obtenir un aperçu de la composition de complexes multiprotéiques dans des conditions différentes et est démontrée en comparant différentes souches génétiquement. Pour l'analyse quantitative des volumes égaux de fractions différentes d'un gradient de densité de saccharose sont mélangés et analysés par spectrométrie de masse.

Abstract

Le protocole mis en place un outil pour l'analyse des complexes multiprotéiques dans la membrane des thylakoïdes, en révélant un aperçu de la composition complexe dans des conditions différentes. Dans ce protocole, l'approche est démontrée en comparant la composition de la protéine complexe responsable de flux d'électrons cyclique (CEF) dans Chlamydomonas reinhardtii, isolé à partir de différentes souches génétiquement. Le procédé comprend l'isolement de membranes thylacoïdes, suivi de leur séparation dans des complexes multiprotéiques par le saccharose centrifugation à gradient de densité, SDS-PAGE, immunodétection et comparative, la spectrométrie de masse quantitative (MS) sur la base de marquage métabolique différentiel (14 N / 15 N) de l' souches analysées. Membranes thylacoïdes solubilisées détergents sont chargés sur des gradients de densité de saccharose à une concentration de chlorophylle égal. Après ultracentrifugation, les gradients sont séparées en fractions, qui sont analysés en masse-spectrometry basé sur le volume égal. Cette approche permet l'étude de la composition dans les fractions de gradient, les analyser le comportement de migration des protéines différentes, notamment en se concentrant sur ANR1, CAS, et PGRL1. De plus, cette méthode est démontrée en confirmant les résultats immuno et, en outre, en soutenant les conclusions des études précédentes (l'identification et la migration de PSI-dépendante des protéines qui ont été précédemment décrits comme faisant partie de la FEC-supercomplexe comme PGRL1, FNR, et cyt f). Notamment, cette approche est applicable à traiter un large éventail de questions pour lesquelles ce protocole peut être adopté et utilisé par exemple pour des analyses comparatives de composition complexe multiprotéique isolé des conditions environnementales distinctes.

Introduction

processus de photosynthèse dans les membranes des thylakoïdes de plantes et d'algues peuvent fonctionner en mode linéaire et cyclique. Au cours de l'écoulement linéaire d'électrons (LEF) de photosystème I (PSI), photosystème II (PSII) et le cytochrome b 6 / f finalement transférer des électrons de l'eau à NADP + 1, conduisant à la génération de NADPH et ATP 2. En revanche, le flux d'électrons cyclique (CEC), qui est connu pour être induit dans des conditions d'environnement variées telles que des conditions d'état 2 3 et anaérobies 4, les résultats de la re-réduction de l'ISP oxydé par l'injection d'électrons dans la chaîne de transport d'électrons. Ce processus peut avoir lieu soit sur ​​le côté du stroma de la cytochrome b 6 / f complexe 1 ou à la piscine de plastoquinone 5 et génère de l'ATP, mais pas de la NADPH 2.

L'objectif du protocole est de démontrer présenté une spectrométrie de masse (MS) sur la base de méthode pour l'analyse comparative, quantitative des complexes multiprotéiques dans les membranes des thylakoïdes de Chlamydomonas reinhardtii de mieux comprendre la composition de ces complexes dans des conditions différentes (illustrés en comparant différentes souches génétiquement). Cette approche a été appliquée dans une publication de Terashima et al., En 2012 montrant une Ca 2 + régulation dépendant de CEF dans C. reinhardtii médiée par un complexe multiprotéique comprenant les protéines CAS, ANR1, et PGRL1 6. La procédure sera expliquée par analyse comparative de la composition de la CEC-supercomplexe dans deux souches génétiquement différentes, profitant ainsi de l'étiquetage une des deux souches avec de l'azote lourd (15 N). Brièvement, le protocole comprend la préparation de membranes thylacoïdes, suivie d'une solubilisation du détergent et le fractionnement de complexes photosynthétiques dans un gradient de densité de saccharose. Après fractionnement du gradient, choisi fractions de deux souches sont mélangées à base de volume égal, séparées par SDS-PAGE suivie d'une digestion in-gel et l'analyse quantitative subséquente de la sclérose en plaques.

Comme mentionné ci-dessus, CEF est induite dans différentes conditions environnementales et une publication à partir de 2010 démontre l'isolement d'un CEF-supercomplexe fonctionnelle de l'état 2 cellules verrouillées de C. reinhardtii 7, qui a été réalisée par des membranes de séparation thylacoïdiennes solubilisées sur un gradient de densité de sucrose pendant ultracentrifugation. Différent de Iwai et al. 7, le protocole présenté décrit l'isolement de la CEC-supercomplexe cultivé en anaérobiose à partir de C. cultures reinhardtii en suivant une procédure alternative. Celui-ci comprend des changements dans le protocole d'isolement thylacoïdes ainsi que les différences concernant l'étape de solubilisation et la séparation des complexes protéiques par ultracentrifugation. Dans le présent protocole, les membranes des thylakoïdessont isolées en appliquant le mode opératoire publié par Chua et Bennoun 8, tandis que les tampons utilisés pour la préparation des thylakoïdes par Iwai et al. contenue 25 Mes mM, 0,33 M de saccharose, 5 mM de MgCl2, NaCl 1,5 mM (pH 6,5) comme décrit 9. La solubilisation a été effectuée avec de 0,7 à 0,8% de détergent (n-tridécyl-β-D-maltoside) pendant 30 min sur de la glace dans le cas d'Iwai et collaborateurs, tandis que la méthode de solubilisation décrit ici repose sur l'utilisation de 0,9% de détergent (n -dodécyl-β-D-maltoside (β-DM)) et est effectuée pour seulement 20 min sur la glace. Les deux groupes ont utilisé 0,8 mg de chlorophylle par ml pour la solubilisation avec le détergent respectif. Pour la séparation de complexes à partir de membranes photosynthétiques des thylacoïdes solubilisées Iwai et al. Appliqué entre les concentrations de saccharose de 0,1 à 1,3 M, tandis que les auteurs de ce protocole utilise des concentrations allant de 0,4 à 1,3 M. La dernière différence est la vitesse de centrifugation, ce qui est faible par rapport à l'eapublication rlier.

Solubilisation des membranes thylacoïdes avec des détergents non ioniques suivie d'un fractionnement gradient de densité de saccharose a déjà été utilisée dans de nombreuses études, allant des années 1980 jusqu'à aujourd'hui, 7, 9 à 14 et également à l'application de marquage métabolique des protéines est un procédé très répandu dans le domaine de la protéomique. La méthode décrite s'applique à l'étiquetage 15 N métabolique pour l'une des deux souches comparées par la mise en culture en présence d'azote lourd comme seule source d'azote sous la forme de 15 N NH 4 Cl, qui est incorporée dans tous les acides aminés conduisant à une masse décaler en fonction de la séquence d'acides aminés du peptide. Lors de l'analyse d'un mélange de 14 N et 15 N à l'intérieur une MS exécuté, ce changement de masse peut être utilisée pour déterminer l'origine de l'échantillon pour chaque peptide et le peptide parent abondances peuvent être calculées représentant les abondances relatives pour l'correspondentment 15 protéine.

De nombreuses études protéomiques quantitatives sur C. reinhardtii sont disponibles, qui permettent de comparer une quantité définie de protéines pour analyser les changements dans le protéome entre les conditions expérimentales (par exemple, les changements dans le protéome en raison de nutriments 16-19 ou lumière le stress 20,21). Par rapport à ces études, l'approche a présenté des volumes égaux d'échantillons sont combinés et analysés. Cette configuration permet d'étudier le comportement de migration des protéines dans le gradient et en outre à analyser la composition des différents complexes en ce qui concerne les souches étudiées.

Cette méthode sera expliquée en se concentrant principalement sur ​​trois protéines: Le premier candidat est la protéine de capteur calcium CAS chloroplastique-localisé, qui a été montré être impliqué dans le photo-acclimatation en C. reinhardtii 22. Le calcium est considéré comme un signal importantment ion pour les voies qui sont activés en raison de différentes contraintes biotiques et abiotiques conduisant finalement à des changements dans l'expression des gènes et la physiologie des cellules 23 et il a été proposé que les chloroplastes pourraient contribuer à Ca 2 + cellulaire signalisation via la protéine CAS 22,24,25. La seconde protéine est ANR1 (réponse anaérobie 1 6), une protéine qui a été montré être induite dans des conditions anoxiques dans la croissance de C. reinhardtii 26. Notamment, CAS ainsi que ANR1 ont été identifiés comme sous-unités du CEF-supercomplexe et ailleurs, en utilisant des approches de génétique inverse, il a été démontré que les deux protéines contribuent fonctionnellement au CEF in vivo 6, en soutenant leur rôle en tant que sous-unités fonctionnelles de ce complexe protéique. La troisième protéine est la protéine thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), qui a été montré pour être impliqués dans le CECR dans Chlamydomonas 4,27 ainsi que chez Arabidopsis 5,28 et était aussi identified dans le travail de Iwai et al. 7

Cette approche sera présentée en montrant les résultats de deux expériences différentes: type sauvage (WT) versus (vs) une souche ΔPSI 29, présentant une délétion du gène du CCSP, codant pour une sous-unité du photosystème essentiel je, qui fait également partie de la CEF-supercomplexe et WT vs un pgrl1 knock-out souche 4. Pour chacune de ces expériences, la composition quantitative de la CEC-supercomplexe entre un N-15 et une souche 14 N-marqué a été comparé.

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Protocol

Une. La culture de Chlamydomonas

  1. Le C après reinhardtii souches ont été utilisées dans la présente étude: WT cc124, WT CW15-arg7 (paroi cellulaire auxotroph déficiente et l'arginine), une souche mutante ΔPSI 29 et un pgrl1 knock-out souche 4.
  2. Toutes les souches ont été cultivées dans du Tris-Acétate-Phosphate (TAP)-support 30, à 25 ° C avec une intensité de la lumière continue de 20 à 50 uE / m 2 s et en agitant à 120 rpm. La culture de ΔPSI doit être enveloppé avec du papier de soie pour exposition à la lumière de <5 uE / m 2 sec.
  3. Les cultures de souches marquées (ΔPSI et WT cc124, respectivement) contenaient 7,5 mM 15 N NH 4 Cl, alors que les cultures pour les souches non marquées (WT CW15-Arg7 et pgrl1, respectivement) contenaient 7,5 mM 14 N NH 4 Cl. Les cellules ont à se développer pendant au moins quatre generations pour réaliser un étiquetage complet et doivent être conservés à la phase de croissance exponentielle.
  4. Le jour avant le début de l'expérience et compte diluer les cellules à une densité de 1 x 10 6 cellules / ml dans un volume d'au moins 750 ml / souche.

S'il vous plaît noter que les deux types de gradients discontinus de densité de sucrose sont décrites dans le protocole suivant. Les gradients de densité photosystème de saccharose selon Takahashi et al. 9 sont utilisés pour séparer les différents complexes de protéines de photosynthèse de thylakoïdes isolés et solubilisées pendant toute une nuit centrifugation et être préparé la veille (voir protocole n ° 2) et les thylacoïdes gradients de densité de sucrose 8 sont appliquées dans la procédure d'isolement thylakoid (voir protocole n ° 3).

2. Préparation du photosystème saccharose gradients de densité

  1. Pour verser les gradients trois solutions mères sont nécessaires:
    1. 2 M de saccharose
    2. Β-DM 10% en H 2 O
    3. Tricine 0,5 M, pH 8,0 (NaOH)
  2. Grâce à ces actions, préparer les solutions suivantes:
    Concentration: 1,3 M 1,0 M 0,85 M 0,7 M 0,65 M 0,4 M
    2 M de saccharose 13 ml 10 ml 8,5 ml 7 ml 6,5 ml 4 ml
    10%46;-DM 100 pl 100 pl 100 pl 100 pl 100 pl 100 pl
    0,5 M Tricine 200 pl 200 pl 200 pl 200 pl 200 pl 200 pl
    H 2 O 6,7 ml 9,7 ml 11,2 ml 12,7 ml 13,2 ml 15,7 ml
  3. Utiliser des tubes x 89 mm à centrifuger de 14 mm et verser les gradients très lentement, en commençant par la solution la plus élevée de la densité de saccharose de la solution de plus faible densité.
  4. Verser seulement 1 ml chacun pour les solutions 1.3 et 1.0 M et 2 ml pour le reste des solutions.
  5. Laisser gradients pendant une nuit en chambre froide.

3. Anaérobie induction et isolement de Thylakoid membranes 8

  1. Avant de commencer l'isolation des membranes thylacoïdes, induire des conditions anaérobies en faisant barboter de l'argon pendant 4 heures. Le bullage peut être réalisé au moyen d'une pipette de verre dans la mise en culture des flacons sous agitation constante de la culture avec un barreau d'agitation magnétique.
  2. Commencez par l'isolement des membranes thylakoïdes par granulation des cellules pendant 5 min à 2500 xg, remettre en suspension dans un tampon H1 (0,3 M de saccharose, 25 mM HEPES (pH 7,5), MgCl2 5 mM).
    (S'il vous plaît noter que lors du démarrage de l'isolement des échantillons de membranes thylacoïdes should être conservé dans la glace pour éviter la dégradation des protéines, toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 4 ° C et de travailler avec des gants est fortement recommandé pour éviter la contamination de la kératine.)
  3. Cellules à granules pendant 5 min à 2500 xg, remettre en suspension dans un tampon H1.
  4. Rompre les cellules par deux passages à travers un nébuliseur avec une pression d'azote de 1500 hPa (pour les souches sans paroi cellulaire ne faire qu'un seul passage).
  5. Isoler les cellules pour 7 min à 2500 x g.
    (Après cette étape, le surnageant doit être vert clair, sinon, la rupture des cellules n'a pas été couronnée de succès.)
  6. Resuspendre les cellules dans un tampon H2 (0,3 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) et un culot de cellules pendant 10 min à 32 800 x g.
  7. Resuspendre les cellules dans un tampon H3 (1,8 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0)) et homogénéiser culot avec un potter (pas de particules vertes doivent rester à la fin de cette étape de travail).
  8. Préparer thylacoïdiennes gradients de densité de saccharose dans la baignoirees (25 mm x 89 mm) en commençant par le bas avec une couche de 12 ml H3 tampon avec des cellules, verser une couche médiane de 12 ml de tampon de H4 (1,3 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM d'EDTA ( pH 8,0)) et 12 ml de tampon en haut H5 (0,5 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0)). Soyez prudent lorsque l'on verse les gradients et d'éviter le mélange des trois couches.
  9. Équilibre avec tampon H5 et centrifugeuses thylacoïdiennes gradients de densité de sucrose pendant 1 heure à 70 700 x g.
  10. Retirer les bandes de thylacoïdes des thylacoïdes des gradients de densité de saccharose et les diluer avec un volume de tampon approprié H6 (HEPES 5 mM (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0)).
  11. Isoler les cellules à 37 900 g pendant 20 min. Si la pastille n'est pas étanche, de plus un tampon de H6 est nécessaire pour cette étape de centrifugation.
  12. Remettre en suspension dans un tampon thylakoïdes H6 de petit volume et de procéder à la détermination de la concentration en chlorophylle.

4. Détermination de la chlorophylle Concentration 31

  1. La détermination de la quantité de chlorophylle est effectuée avec 80% d'acétone.
  2. Mélanger 995 pi 80% d'acétone et 5 pi de thylakoïdes dans un tampon H6 (dilution 1:200).
  3. Vortex pendant quelques secondes jusqu'à ce que aucun des particules vertes restent puis ralentissent à 14,1 g pendant 5 min.
  4. Prenez le surnageant et mesurer l'extinction à 663,6 et 646,6 nm et 750 nm, respectivement.
  5. Calculer la quantité de chlorophylle selon les formules suivantes:
    1. C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6 à 0,00255 * E 646,6) * facteur de dilution
    2. C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6 à 0,00491 * E 663,6) * facteur de dilution
    3. C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b

5. Chargement de photosystème saccharose gradients de densité

  1. Calculer les montants des thylakoïdes, β-DM et tampon H6 qui sont nécessairespour chaque gradient:
    1. Chaque gradient doit être chargé avec un volume total de 700 ul de 0,8 mg / ml chlorophylle dans β-DM 0,9% (dissoudre β-DM à H 2 O), remplir le volume restant avec du tampon H6.
  2. Pour solubilisation préparer différents prélèvements avec thylakoïdes, β-DM et tampon H6 pour chaque gradient.
  3. Laisser les échantillons pendant 20 minutes sur la glace avec le mélange régulièrement (inversion) toutes les quelques minutes (étape de solubilisation).
  4. Centrifuger à vitesse maximale (14 000 xg) pendant 10 min à 4 ° C.
    (Après centrifugation, le culot doit être petit et blanchâtre tandis que le surnageant est vert foncé.)
  5. Chargez surnageant sur les gradients.
  6. Équilibre avec tampon H6 et tourner à l'aide d'ultracentrifugation à 134 470 xg pendant la nuit (14 h) à 4 ° C.
    (S'il vous plaît noter que la séparation réussie de complexes photosynthétiques utilisant des gradients de densité de saccharose photosystème tel que présenté dans ce protocole n'est atteint que si using thylakoïdes fraîchement isolées, car une prédiction pour la solubilisation et la séparation complexe est difficile à faire lorsque l'on travaille avec les membranes des thylakoïdes qui ont été congelés avant.)

6. Fractionnement de photosystème saccharose gradients de densité

  1. Prenez des photos des gradients.
  2. Percer un trou au fond du tube en utilisant une aiguille et fractionner les gradients dans les tubes 500 ul. En variante, le fractionnement peut également être effectuée en utilisant une plaque à 96 puits (microplaques).
  3. Lors de l'utilisation d'une microplaque, déterminer l'absorbance des différentes fractions de gradient à 675 nm.
    (A ce stade des échantillons peuvent être stockés à -80 ° C pendant quelques semaines.)

7. SDS-PAGE et Immunodétection

(S'il vous plaît noter que seulement pour la comparaison des WT vs ΔPSI une analyse Western blot a été réalisée pour sélectionner les fractions pour MS-analyse ultérieure. Pour l'expérience WT vs pgrl1 fractions ont été choisis au moyen de l'absorbance dans les différentes fractions.)

  1. Séparer 30 ul de chaque fraction de WT et ΔPSI gradient sur ​​un gel de polyacrylamide SDS 13% 32.
  2. Effectuer l'analyse western blot 33 utilisant les anticorps suivants: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, la sous-unité d'psad PSI 32 et le noyau sous-unité D1 PSII. Utiliser tous les anticorps à une dilution de 1:1000 (pour une meilleure technique de détection par chimiluminescence), à ​​l'exception de l'anticorps D1, qui doit être utilisé avec une dilution de 1:10000.
  3. Sur la base des résultats de l'immunodétection, prendre les fractions des pics de ANR1, PGRL1 et PSAD pour WT et ΔPSI (ici fractions 6 et 13, respectivement), mélanger 30 ul de la fraction 6 de WT et ΔPSI et faire la même chose avec la fraction 13 de les deux préparations et les séparent de nouveau sur un gel de polyacrylamide-SDS 13%.
  4. Pour la comparaison quantitative de WT vs pgrl1 prendre la Cfractions EF-supercomplexe tel que déterminé par mesure de l'absorbance dans les différentes fractions du gradient et mélanger 30 ul de deux échantillons, suivie d'une séparation sur un gel SDS de polyacrylamide 13%.
  5. Colorer les bandes de protéines avec une solution de Coomassie (acide phosphoreux à 85%, sulfate d'ammonium 757 mM, 1,2% de bleu brillant de Coomassie, 20% de methanol) pendant 2 h à la température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C.
  6. Pour supprimer la coloration non spécifique, lavez-les plusieurs fois avec le trou DDH 2 O.
  7. Couper les voies en 1 mm morceaux de gel et de procéder à la digestion dans le gel.
    (En variante, des échantillons peuvent être séchés quelques minutes dans une centrifugeuse sous vide et conservés pendant quelques semaines avant de poursuivre la digestion in-gel).

8. Digestion dans le gel (modification de Shevchenko et al. 35)

S'il vous plaît noter pour préparer tous les tampons et les solutions peu avant utilisation et de prendre des bouteilles en verre pour les tampons contenant de l'acétonitrile (ACN). <br /> ATTENTION! Travailler avec ACN pourrait être nuisible; plus d'informations peut être téléchargé à partir de: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

  1. Laver les morceaux de gel avec> 10 volumes de trou DDH 2 O (~ 200 ul) pendant 30 sec.
  2. Incuber les morceaux de gel avec 300 ul de 25 mM de NH 4 HCO 3 pour 15 min avec agitation par secousses, éliminer le liquide.
  3. Incuber les morceaux de gel avec 300 ul de 25 mM de NH 4 HCO 3 dans 50% d'ACN (préparer par mélange ACN et 50 mM de NH 4 HCO 3 dans un rapport de 1:1) pendant 15 min sous agitation, éliminer le liquide.
  4. Si les morceaux de gel sont encore bleu, répéter le NH 4 HCO 3 et NH 4 HCO 3 / ACN lave jusqu'à ce que la majeure partie du Coomassie est enlevé.
    (Bien que la majeure partie de la coloration au bleu de Coomassie doit être retiré, il n'est pas nécessaire de décolorer les morceaux de gel complètement.)
  5. Ajouter 100 pi d'ACN pour déshydrater les morceaux de gel pendant 5 min. Les morceaux de gel devraient réduire unee l'air complètement blanc.
  6. Retirer autant que possible ACN et procéder à digestion par la trypsine. En variante, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pendant quelques semaines.
  7. Ajouter 10-20 pi par groupe de 20 ng / ul de trypsine dans 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (fraîchement diluée), garder les échantillons sur la glace.
  8. Après 30 min, vérifier si tous solution a été absorbée et ajouter davantage de tampon de la trypsine, si nécessaire. Les morceaux de gel doivent être complètement recouvertes avec du tampon de trypsine. Conserver les échantillons sur la glace.
  9. Ajouter des morceaux de gel pendant 90 min sur la glace pour les saturer avec de la trypsine.
    (Étape critique: le rendement en peptides tryptiques augmente considérablement avec l'augmentation des temps d'incubation sur de la glace, probablement en raison de la lente diffusion de l'enzyme dans la matrice de polyacrylamide Il est nécessaire d'avoir un léger excès de solution recouvrant les morceaux de gel pour éviter que les morceaux. tomber à sec pendant la nuit d'incubation.)
  10. Digérer à 37 ° C pendant 4-6 heures. Pour les expériences nécessitantrécupération de peptide maximal, digérer pendant une nuit.
  11. Après digestion spin down tampon condensée.
  12. Tubes ultrasons pendant 5 min à éluer les peptides et centrifuger à nouveau.
  13. Recueillir le surnageant et le transférer dans un nouveau tube.
  14. Procéder à l'extraction de peptide avec 80 pl de / 30% d'acide ACN 1% formique (FA) dans un bain sonique pendant 15 min.
  15. Procéder à l'extraction avec 80 ul de 30% ACN / 1% FA dans un bain sonique pendant 15 min.
  16. Procéder à l'extraction avec 80 ul de 70% ACN / 1% FA dans un bain sonique pendant 15 min.
  17. Centrifuger à nouveau et la piscine surnageant avec l'éluat avant.
    (FA sert pour inactiver la trypsine et d'augmenter la solubilité du peptide.)
  18. Solution de peptide complètement à sec dans une centrifugeuse sous vide.
    (À ce stade échantillons peuvent être conservés pendant quelques semaines à -20 ° C avant de procéder à MS-analyse.)
  19. Resuspendre les peptides à 6 ul de tampon SM (5% d'ACN, 0,1 v / v FA, de l'eau) et le produit de sonication pendant 2-5 min.
  20. Centrifuger les échantillons à maximuvitesse de m pendant 5 minutes pour éliminer la matière particulaire.
  21. Utilisation 4 ul de surnageant pour l'analyse par spectrométrie de masse.

9. MS-Analyse des données avec "Proteomatic"

L'analyse des données a été réalisée avec le logiciel open-source "Proteomatic" (qui peut être téléchargé à http://www.proteomatic.org/), une plate-forme qui permet la production et la réalisation de MS / MS pipelines d'évaluation des données, à l'aide libre et commerciale des logiciels 36. En bref, les paramètres sont décrits ci-dessous et des informations plus détaillées peuvent être trouvées dans 6,26.

  1. Identification et la quantification de MS-données
    L'identification et la quantification de protéines à partir de l'expérimentation par rapport à WT ΔPSI ont été effectuées avec ASSMO (version 2.1.4 37) et qTrace 26, respectivement, comme décrit 6,26. Pour l'analyse MS-données à partir de l'expérience WT vs pgrl1 la canalisation de mise à jour suivant a été utilisé:
    1. En plus de ASSMO 37, les protéines ont été identifiées avec X! Tandem (version 1.2.2013 38). Les deux algorithmes ont été appliqués par la recherche contre une base de données généré par la combinaison de la version JGI Chlamydomonas de base de données de modèle de gène 4.3 avec la version de base de données AUGUSTE 10.2 ainsi que contre une base de données joint du NCBI bases de données BK000554.2 et NC_001638.1.
    2. MS 2 identification de peptides a été effectuée en utilisant une approche cible leurre 39. Un leurre pour chaque protéine a été créée en mélangeant au hasard peptides tryptiques, tout en conservant la redondance des peptides nonproteotypic.
    3. Validation statistique des peptides a été effectuée avec le qvality de logiciel (version 0.3.3 40) en utilisant une probabilité d'erreur postérieur (PEP) de seuil inférieure à 0,01, et les résultats ont été filtrés avec un précurseur de la tolérance de masse de 5 ppm.
    4. Peptides de ASSMO et X! Tandem pistes ont été rejoints et quantifiés avec qTrace 2 exigent l'identification, ajoutez les noms de protéines / informations de groupe et exigent deux peptides sœurs.

Afin de déterminer si les rapports de protéines étaient significativement différents l'un vers l'autre dans les fractions de CEF-supercomplexe mixtes de WT et pgrl1, l'analyse statistique a été effectuée l'application de la SPSS de logiciel (version 21). Les sous-unités du complexe cytochrome b 6 / f ont été testés contre l'autre ainsi que les protéines FNR, FTSH2 et HCF136 contre les sous-unités de l'ISP. Les rapports de chaque compte de balayage par la protéine de quatre répétitions de peptides ont été testés pour la distribution normale avec le test de Shapiro-Wilks. Comme les populations de peptides n'étaient pas normalement distribuées (p <0,001), les statistiques non paramétriques ont été effectuées. Tout d'abord, le test de Kruskal-Wallis a été appliqué l'évaluation d'une divergence significative entre les groupes. Seulement si ce test prédit différence significatives entre les groupes, une analyse a été effectuée pour prédire des différences significatives entre les deux groupes indépendants avec le Mann-Whitney U test.

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Representative Results

L'approche de protéomique quantitative introduit vise à caractériser la composition de complexes multiprotéiques dans les membranes des thylakoïdes démontré par l'analyse comparative des composants CEF-supercomplexe dans génétiquement différente C. reinhardtii souches. La méthode décrite a été appliquée avec succès par Terashima et al. 6 et comprend l'isolement des membranes thylacoïdes de anaérobies grandi cultures, suivis par solubilisation avec un détergent. Par la suite, les échantillons sont chargés sur un gradient de densité de saccharose en fonction de la quantité de chlorophylle égale et complexes sont fractionnés par ultracentrifugation. Pour l'analyse MS-quantitative des volumes égaux de deux fractions de gradient à partir de différentes souches sont mélangés et analysés comparativement (Figure 1). Les résultats présentés incluent la comparaison de la fraction de la FEC-supercomplexe entre WT CW15-arg7 et ΔPSI ainsi que WT cc124 et pgrl1, respectivement.

(Figures 2A et 2B) ont été choisis 6. figure 3 représente les taux de protéines relatives que WT / ΔPSI (14 N / 15 N) pour plusieurs noyau de PSI et protéines LHCI (protéines lumière de récolte de l'ISP a également nommé en tant que protéines Lhca) ainsi que pour des protéines possédant le CEF-supercomplexe. Comme prévu, les protéines de base de PSI ne se trouvent que dans les échantillons WT démontré par des rapports de l'infini dans les deux fractions. Lhca2 et Lhca9 sont enrichis dans le WT, alors que Lhca4 -6 et -8 montrent une réglementation différente dans les deux fractions. Il est important de noter que les protéines LHCI sont synthétisés et accumulés normalement dans le mutant ΔPSI 41. Le comparateur de polypeptide de la PSI-LHCIcomplexe de C. reinhardtii WT avec le complexe LHCI du mutant ΔPSI a révélé que la majorité des Lhca2, -9 et -3 semble être que faiblement lié à LHCI et en outre que la présence du noyau de PSI est nécessaire pour une liaison stable. En revanche, Lhca1, -4, -6, -7, -8 et forment un complexe indépendant de l'ensemble des PSI 14, ce qui pourrait expliquer la différence de la réglementation des Lhca4, -6 et -8 dans la présente expérience.

Pour les protéines d'être affectés par la FEC-supercomplexe, il peut être établi une distinction entre ceux qui sont plus abondants dans la fraction WT 6 et la fraction 13 du mutant ΔPSI, montrant une forte migration de PSI-dépendant affiché par des rapports supérieurs à un pour la fraction 6 et valeurs inférieures à un ou pas détecté dans la fraction 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, VFI, HCF136 et cyt f) et ceux présentant pas une telle forte, mais néanmoins une localisation de PSI-dépendant (FNR, FTSH1, FTSH2, et le CAPC ).

Avec cette expérience Terashima et al. 6 démontré un comportement migratoire PSI-charge pour ANR1 et CAS (Figures 2A-D et la figure 3), les révélant ainsi que de nouvelles protéines de la FEC-supercomplexe, déjà pas identifiés 7. Les résultats de la MS-analyse ont également été confirmés par immunodétection et pris en charge par l'application de la génétique inverse pour confirmer un rôle fonctionnel de ces protéines pour CEF in vivo 6. En outre, cette approche comparative MS-appuie fortement les résultats des études précédentes, en confirmant les protéines qui ont déjà été démontrées à faire partie de la FEC-supercomplexe comme PGRL1, cyt f et FNR 7, ainsi que Lhcbm5 7,9 à montrer une localisation de l'ISP-dépendante du gradient de densité de saccharose, qui est comparable à ANR1 et CAS.

La comparaison des fractions 6 et 13 de anr1 ΔPSI et en utilisant le même approach (voir Figure 6 S8) a démontré une composition similaire de la FEC-supercomplexe dans anr1 et la même tendance pour les protéines ANR1, CAS et PGRL1 comme révélé dans l'expérience WT vs ΔPSI. Notamment, bien que le taux de protéine de ANR1 dans la fraction 6 (anr1 vs ΔPSI) est comparable au ratio de la WT vs expérience ΔPSI, les quantités de CAS et PGRL1 semblent plus élevés dans l'ancienne expérience et peut-être un résultat de la compensation de la régulation à la baisse de ANR1 6.

Par ailleurs, l'enrichissement de ANR1 et CAS dans la fraction de CEF-supercomplexe on pourrait également déduire la migration de PSI-dépendante de plusieurs autres protéines à partir de cette expérience. Ce sont deux métalloprotéases dépendantes de l'ATP FTSH1 et FTSH2 qui jouent un rôle fondamental dans la dégradation de la PSII centre de réaction protéine D1 dans les chloroplastes 42,43, une protéine contenant préfoldine du domaine, la HCF136, qui est un facteur crucial pour la stabilité ou assembment de PSII 44 et la sous-unité γ de l'ATPase. Considérant que, pour l'un plus tard, les rapports entre la fraction 6 et 13 ne montrent pas une telle différence claire, d'autres expériences doivent être menées pour vérifier si les autres protéines peuvent être également des candidats de la FEC-supercomplexe.

Comme une preuve de concept expérience de cette approche comparative, nous avons analysé la composition de la FEC-supercomplexe dans deux souches, qui ont toutes deux PSI, permettant la formation de ce complexe. Les fractions respectives ont été sélectionnés sur la base des mesures d'absorbance des gradients fractionnées. Figures 4A et 4B montrent les résultats de la comparaison quantitative entre WT et une souche knock-out pgrl1. Il convient de souligner que ANR1 et CAS sont pas remarquablement changé entre WT et pgrl1. Fait intéressant, HCF136 semble être enrichi en WT, alors que FTSH2 semble être enrichi en pgrl1. Une si de statistiqueséquent différence pour les deux protéines précitées à tous les ISP sous-unités (y compris les protéines LHCI) a pu être confirmée.

En outre, les cytochrome b 6 f / sous-unités complexes CYT f et PETO se sont avérées significativement différentes de cyt b 6, cyt b 6 / f IV et PETC, respectivement. Notamment, cyt f semble être régulée à la hausse dans pgrl1, tandis que cyt b 6 et cyt b 6 / f IV sont légèrement régulé à la baisse, bien que la régulation de la synthèse de f cyt implique probablement cyt b 6 et cyt b 6 / f IV 45 . Le PETC codée par le noyau, qui est également connu comme la protéine Rieske montre un règlement similaire à cyt b 6 et cyt b 6 / f IV (c'est à dire une régulation dans pgrl1). C'est frappant comme une réduction ou l'absence de la protéine Rieske encore conduire à l'accumulation de l'OTHer cyt b 6 f / sous-unités de ~ 60% du niveau de WT en C. reinhardtii 46. En outre, la régulation à la hausse de PETO dans pgrl1 est important de noter, puisque cette sous-unité faiblement lié a été montré à s'accumuler à des niveaux réduits en C. reinhardtii mutants dépourvus soit cyt b 6, b cyt 6 / f IV PETC ou 47, qui sont moins abondants dans pgrl1 rapport au WT dans la présente expérience.

Figure 1
Figure 1. Du flux de travail expérimental comme représenté pour le WT et ΔPSI. Cellules sont marquées métaboliquement pendant au moins quatre générations, des conditions anaérobies sont induits par bullage d'argon pendant 4 heures et les membranes des thylakoïdes sont isolés par une séparation gradient. L'isolated membranes sont solubilisées à l'aide β-DM, chargé sur un gradient de densité de saccharose (pour les deux souches des quantités égales de la chlorophylle sont appliquées dans cette étape) et centrifugé pendant une nuit. Les fractions de gradient sont recueillies et analysées par SDS-PAGE ainsi que d'immuno-détection pour déterminer la distribution des protéines dans le gradient. Pour identifier les protéines avec une migration de PSI-dépendante, des volumes égaux de la fraction CEF-supercomplexe WT (numéro de fraction 6) et de la fraction N-15 marqué correspondant à partir de la souche ΔPSI ont été mélangés et analysés comparativement. On fait de même avec la fraction de pic de ANR1 dans la souche ΔPSI (numéro de fraction 13). Pour l', MS-approche quantitative comparative, les échantillons de protéines mixtes ont été séparées par SDS-PAGE, bandes de protéines ont été colorées avec une solution de bleu de Coomassie, suivie par la digestion dans le gel avant MS-analyse. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2
Figure 2. ANR1 et CAS migrent vers les régions à faible densité de la souche ΔPSI. A:. Des gradients de densité de saccharose d'WT et ΔPSI thylakoïdes isolés à partir des conditions anaérobies ont été séparés en 20 fractions B: L'immunodétection de ANR1 dans les 20 fractions du gradient de WT et ΔPSI. Bien que cette protéine est localisée dans la région à plus haute densité dans le WT (fraction 6) c'est-décalé vers les régions à faible densité dans la souche ΔPSI (fraction 13) C:. Des gradients de densité de saccharose d'WT et ΔPSI thylakoïdes isolés à partir de conditions anaérobies ont été séparés en 27 fractions D:. Immunodétection de CAS dans les 27 fractions du gradient de WT et ΔPSI. Bien que cette protéine est localisée to la région à plus forte densité dans le WT (avec un pic autour de la fraction 7) c'est-décalé vers les régions à faible densité dans la souche ΔPSI (avec un pic autour de fraction 19). (Ce chiffre a été modifié depuis Terashima et al. 6). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Relative ratios de protéines déterminées dans la fraction 6 et 13 de WT et ΔPSI par spectrométrie de masse quantitative. Fractions 6 et 13 de WT ont été comparées avec les fractions respectives à partir de la souche ΔPSI 15 N-marqué. Les taux de protéines relatifs qui représentent deux répétitions biologiques et trois MS-pistes sont dépeints comme WT / ΔPSI (14N / 15 N) à la fois pour les fractions analysées à l'exception de cyt f, qui n'a été identifiée dans la fraction 6. Cette quantification comparative révèle que ANR1 et CAS montrent une migration de PSI-dépendante du gradient de densité de saccharose (ce chiffre a été modifié depuis Terashima et al. 6). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
Figure 4. Des ratios de protéines relatives déterminées dans la fraction de CEF-supercomplexe de WT et pgrl1 par spectrométrie de masse quantitative. A: saccharose gradients de densité de WT et thylakoïdes de pgrl1 isolés à partir des conditions anaérobies B:. Taux de protéines relatives between la fraction CEF-supercomplexe provenant de quatre répétitions différentes dépeint comme WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). Dans cette expérience ANR1 et CAS sont pas remarquablement changé, tandis que FTSH2 et HCF136 présentent des différences significatives par rapport à tous les ISP sous-unités (p ≤ 0,001 comme indiqué par *** en rouge; HCF136: 1900 <U <58127; FTSH2: 2117 <U <164197). En outre, les cyt b / 6 sous-unités complexes f CYT f et PETO se sont avérés significativement différente de cyt b 6, cyt b 6 / f IV et PETC, respectivement (p ≤ 0,001 comme indiqué par *** en bleu; cyt f : 2684 <U <11535; PETO:. 4700 <U <23663) Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Différentes études protéomiques quantitatives utilisant stable marquage isotopique ont été publiées dans les dernières années. Dans ces expériences, généralement de deux échantillons différents sont comparés, dont un échantillon est marqué avec un isotope stable. Par la suite, des protéines ou des peptides à partir des deux échantillons sont combinés dans un rapport égal, et en outre 48 traitées ensemble. Ces études ont l'intention souvent comparer compartiments définis isolés cellulaires (par exemple, les chloroplastes, les mitochondries, ou les membranes des thylakoïdes) exposés à différentes conditions de stress 26,34,49 pour enquêter sur la hausse ou à la régulation des protéines spécifiques. L'approche décrite comparative, quantitative protéomique a pour but d'analyser la composition des complexes multiprotéiques dans la membrane des thylakoïdes et, en contraste avec les études mentionnées ci-dessus, est basé sur le mélange le même volume d'échantillons après une séparation de densité de saccharose de membranes thylacoïdes chargés à la concentration de chlorophylle égaux devant ultracentrifugationtion. Cette méthode a été effectivement appliqué par Terashima et al. 6 qui a analysé relativement à la composition du CEF-supercomplexe isolé à partir d'un WT et une souche ΔPSI pour identifier des protéines qui migrent PSI-dépendante dans un gradient de densité de saccharose.

La réalisation de cette stratégie est prouvé par le fait que les MS-résultats sont en outre pris en charge par immunodétection. En outre, Terashima et al. Pourrait confirmer les résultats d'études antérieures (c.-à l'identification et PSI-dépendante la migration des protéines déjà décrites comme faisant partie de la FEC-supercomplexe, comme PGRL1, FNR, et cyt f 7). L'identification des ANR1 et CAS en tant que nouveaux composants de la CEF-machines 6 révèle que cette approche est un outil très puissant et efficace. Notamment, le CEF-supercomplexe isolé présenté une activité in vitro, démontrant ainsi la purification réussie d'une fonctiontionnelle complexe multi-6. L'applicabilité de cette approche a également pour deux souches de qui à la fois former un CEF-supercomplexe est démontrée par la comparaison entre WT et pgrl1.

En général, cette méthode peut être utilisée pour étudier des compositions complexes de différentes souches ou de conditions telle que révélée par l'identification de protéines non identifiés auparavant qui sont copurifiés avec la fraction de CEF-supercomplexe (à savoir l'enrichissement de FTSH1, FTSH2, VFI, et HCF136 dans l' fraction de la FEC-supercomplexe). Si ces protéines sont possibles nouveaux candidats de ce complexe et d'améliorer notre compréhension de la réglementation différente de FTHS2, HCF136, ainsi que pour les cyt b 6 f / sous-unités comme l'a révélé par la comparaison de WT et pgrl1, d'autres expériences sont nécessaires.

Outre les avantages décrits de cette approche, il ya rompreal étapes essentielles qui doivent être examinées avec soin lors de l'utilisation de ce protocole: La rupture des cellules avec le nébuliseur est la première étape importante. Si l'ouverture des cellules n'est pas effectuée d'une manière appropriée, le rendement de thylakoïdes isolés sera plutôt faible et pourrait aboutir à une peine de détection de la FEC-supercomplexe après pendant la nuit centrifugation. La perturbation réussie de cellules peut être déduite de la couleur vert clair du surnageant après centrifugation. En revanche, si la pression en cas de perturbation de la cellule est trop élevé, les parties de la supercomplexe pourraient se désintègrent et cofacteurs importants peuvent être perdues. Une autre étape d'influencer le rendement de thylakoïdes est la remise en suspension des cellules avec un potter. Ceci doit être effectué avec soin et à la fin de cette étape que peu de particules devrait rester verte. De plus, pour la préparation de la densité de saccharose gradients de la veille ainsi que pour la solubilisation des complexes membranaires, il est très important d'suivre précisément ce protocole en termes de concentration β-DM, car cela est crucial pour obtenir thylakoïdes entièrement solubilisés 50 et donc aussi pour la purification de la FEC-supercomplexe. L'étape de solubilisation a été effectuée avec succès si un petit culot blanchâtre est observée après l'étape de centrifugation subséquente. Un autre point critique qui devrait être mentionné ici est le temps de sur-nuit ultracentrifugation. Les gradients de densité de saccharose doivent être centrifugés pendant au moins douze heures pour réaliser la séparation complète des complexes photosynthétiques.

Même si le protocole est démontrée en utilisant C. reinhardtii pour l'analyse comparative de la composition CEF-supercomplexe dans deux souches génétiquement différentes, il est facilement adaptable également à un large éventail d'autres questions, telles que les analyses comparatives de composition complexe multiprotéique isolé de l'environnement distinct / expérimentalconditions ou en utilisant d'autres types de fractionnement. Les seules exigences de cette approche sont que l'organisme modèle peut être cultivé dans une culture cellulaire, est capable d'utiliser des complexes d'ammonium comme source d'azote et des protéines peuvent être séparées par des gradients de densité de sucrose, ce qui démontre une grande application de cette méthode. Pour l'application future de cette approche SDS-PAGE fractionnement des mixtes 14 N / 15 N échantillons et subséquente digestion dans le gel pourrait être remplacé par l'application de la préparation des échantillons de filtre assistée par la méthode (FASP). Cette méthode comprend l'application de détergents puissants pour la solubilisation visant à «nettoyer» le protéome avant la digestion et à obtenir des peptides purifiés, prévenir les inconvénients de l'approche en gel digestion qui peut inhiber la récupération de peptide, même si on doit considérer que dans le gel la digestion est décrite pour être robuste à des contaminations qui pourraient interférer avec la digestion 51.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

MH reconnaît le soutien de la «Deutsche Forschungsgemeinschaft» (DFG). Auteur contributions: MH conçu recherche; KT, JS et MT a effectué des recherches et a analysé les données; KT et MH a écrit le papier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetic acid AppliChem A0662 http://www.applichem.com/home/
Acetone AppliChem A2300 http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MS Diagonal 9340 Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions.

https://www.diagonal.de/
Ammonium chloride 15N Cambridge Isotope Laboratories 39466-62-1 http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14N AppliChem A0988 http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate  AppliChem A3583 http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate  AppliChem A3598 http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250 Fisher Scientific 10041653 http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside AppliChem A0819 http://www.applichem.com/home/
EDTA AppliChem A2937 http://www.applichem.com/home/
Formic acid   AppliChem A3858 http://www.applichem.com/home/
HEPES AppliChem A3724 http://www.applichem.com/home/
Magnesium chloride AppliChem A4425 http://www.applichem.com/home/
Methanol AppliChem A2954 http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acid AppliChem A0989 http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate  AppliChem A1042 http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate  AppliChem A1043 http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxide AppliChem A1551 http://www.applichem.com/home/
Sucrose AppliChem A1125 http://www.applichem.com/home/
Tricine AppliChem A3954 http://www.applichem.com/home/
Tris AppliChem A2264 http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer Promega V5111 http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor) Glas-Col http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm)  Beckman Coulter 331372 for preparation of Takahashi style gradients

http://www.beckmancoulter.de/
Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm
 Beckman Coulter 344058 for preparation of thylakoid isolation gradients.

http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP Beckman Coulter http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber Diagonal 449/72 https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml  Fisherbrand 10618242 http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizer Fisherbrand 105252220 http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies  Agrisera http://www.agrisera.com/en/index.html

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Microbiologie Numéro 85 saccharose gradients de densité Chlamydomonas complexes multiprotéiques, thylakoïdes
Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative
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Trompelt, K., Steinbeck, J.,… More

Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (85), e51103, doi:10.3791/51103 (2014).

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