Summary
De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.
Abstract
De geïntroduceerde protocol voorziet in een instrument voor de analyse van multiprotein complexen in de thylakoidmembraan, door de onthulling van inzichten in complexe samenstelling onder verschillende omstandigheden. In dit protocol de benadering wordt aangetoond door de samenstelling van het eiwitcomplex belast cyclische elektronenstroom (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, geïsoleerd uit genetisch verschillende stammen. De werkwijze omvat het isoleren van thylakoïdmembranen, gevolgd door fasescheiding in multiprotein complexen sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie, SDS-PAGE, immunodetectie en vergelijkende, kwantitatieve massaspectrometrie (MS) op basis van differentiële metabolisch merken (14 N / 15 N) van de geanalyseerde stammen. Reinigingsmiddel oplosbaar thylakoidmembranen worden geladen op sucrose dichtheidsgradiënten op gelijke concentratie chlorofyl. Na ultracentrifugeren worden de gradiënten gescheiden in fracties, die worden geanalyseerd door massa-spectrometry op basis van gelijk volume. Deze aanpak maakt het onderzoek naar de samenstelling binnen de gradiënt fracties en bovendien om de migratie gedrag van verschillende eiwitten te analyseren, in het bijzonder gericht op ANR1, CAS, en PGRL1. Bovendien is deze werkwijze blijkt uit de resultaten bevestigen met immunoblotting alsmede door ondersteuning van de bevindingen uit eerdere studies (identificatie en PSI-afhankelijke migratie van proteïnen die eerder beschreven deel van de CEF-supercomplex zoals PGRL1, FNR, en CYT f). Met name deze aanpak is toepasbaar op een breed scala aan vragen waarop dit protocol kan worden vastgesteld en bijvoorbeeld gebruikt voor vergelijkende analyses van multi-eiwitcomplex samenstelling geïsoleerd uit verschillende milieu-omstandigheden te pakken.
Introduction
Fotosynthetische processen thylakoidmembranen planten en algen kan functioneren in een lineaire en cyclische modus. Tijdens lineaire elektronenstroom (LEF) fotosysteem I (PSI), fotosysteem II (PSII) en cytochroom b 6 / f uiteindelijk elektronen overdragen van water NADP + 1, leidt tot de generatie van NADPH en ATP 2. Daarentegen cyclische elektronenstroom (CEF), bekend onder verschillende milieuomstandigheden achtige toestand 2 en 3 anaërobe omstandigheden 4, bepaalt het re-reductie van geoxideerd SIP door het injecteren van elektronen terug in de elektronen transportketen wordt geïnduceerd. Dit proces kan zowel in de stroma van het cytochroom b 6 / f complex 1 of de plastoquinone zwembad 5 genereert en ATP, maar geen NADPH 2.
Het doel van het huidige protocol is een massaspectrometrie (MS) gebaseerd m aantonenMETHODE voor de vergelijkende, kwantitatieve analyse van multiprotein complexen thylakoidmembranen van Chlamydomonas reinhardtii inzicht in de samenstelling van deze complexen krijgen onder verschillende omstandigheden (zoals geïllustreerd door vergelijking van genetisch verschillende stammen). Deze benadering werd toegepast in een publicatie van Terashima et al.. In 2012 met een Ca2 +-afhankelijke regulering van CEF in C. reinhardtii gemedieerd door een multi-eiwitcomplex waaronder de eiwitten CAS, ANR1 en PGRL1 6. De procedure wordt toegelicht door relatief analyse van de samenstelling van de CEF-supercomplex twee genetisch verschillende stammen, waardoor maken van etikettering een van de twee stammen met zware stikstof (15 N). In het kort, het protocol omvat de voorbereiding van thylakoïdmembranen, gevolgd door detergens en fractionering van fotosynthetische complexen in een sucrosegradiënt dichtheid. Na fractionering van de gradiënt, geselecteerd fracties van twee stammen worden gemengd op basis van gelijke omvang, door SDS-PAGE gevolgd door in-gel-digestie en daaropvolgende kwantitatieve MS analyse.
Zoals hierboven vermeld, wordt CEF geïnduceerd onder verschillende omgevingsomstandigheden en een publicatie uit 2010 toont de isolatie van een functionele CEF-supercomplex van staat 2 vergrendelde cellen van C. reinhardtii 7, die werd uitgevoerd door het scheiden van opgeloste thylakoidmembranen op een sucrose dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie bij. Verschillend van Iwai et al.. 7, de gepresenteerde protocol beschrijft de isolatie van de CEF-supercomplex van anaërobe gegroeid C. reinhardtii culturen door het volgen van een alternatieve procedure. Dit omvat veranderingen in de thylakoid isolatieprotocol en verschillen betreffende de solubilisatiestap en de scheiding van eiwitcomplexen door ultracentrifugatie. In het huidige protocol, thylakoïdmembranenworden geïsoleerd door toepassing van de procedure gepubliceerd door Chua en Bennoun 8, terwijl de buffers gebruikt thylakoid voorbereiding door Iwai et al.. bevatte 25 mM Mes, 0,33 M sucrose, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) zoals beschreven 9. De solubilisatie werd uitgevoerd met 0.7-0.8% detergens (n-tridecyl-β-D-maltoside) gedurende 30 min op ijs bij Iwai en medewerkers, terwijl het oplosbaar hier beschreven methode is gebaseerd op het gebruik van 0,9% detergens (n -Dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) en is uitgevoerd voor slechts 20 minuten op ijs. Beide groepen die 0,8 mg chlorofyl per ml voor de solubilisatie van de respectievelijke wasmiddel. Voor de scheiding van fotosynthetische complexen van opgeloste thylakoidmembranen Iwai et al.. Toegepast sucrose concentraties van 0,1-1,3 M, terwijl de auteurs van dit protocol gebruikte concentraties variërend 0,4-1,3 M. Het laatste verschil is de centrifugeersnelheid, wat lager is dan aan de earlier publicatie.
Oplossen van thylakoidmembranen met ionogene detergentia gevolgd door sucrose dichtheidsgradiënt fractionering reeds toegepast in talloze studies variërend van 1980 tot heden 7, 9-14 en tevens de toepassing van metabolisch merken van eiwitten is een wijdverspreide methode op het proteomics. De beschreven aanpak geldt de 15 N metabolisch merken van een van de twee vergeleken stammen door kweken in de aanwezigheid van zware stikstof als enige stikstofbron in de vorm van 15 N NH4Cl, die is opgenomen in alle aminozuren leidt tot een massale verschuiven afhankelijk van de aminozuursequentie van het peptide. Bij het analyseren van een mengsel van 14 N en 15 N binnen een MS draaien, kan deze massa verschuiving worden gebruikt om het monster herkomst te bepalen voor elk peptide en peptide relatieve abundanties kan worden berekend die relatieve abundanties van de overeening eiwit 15.
Talrijke kwantitatieve proteomics studies op C. reinhardtii beschikbaar die een bepaalde hoeveelheid eiwit vergelijken veranderingen in het proteoom tussen experimentele omstandigheden (bijvoorbeeld veranderingen in het proteoom door nutriënten, 16-19 of lichte belasting 20,21) geanalyseerd. Vergeleken bij deze studies de momenteel weergegeven benadering gelijke volumes van monsters worden gecombineerd en geanalyseerd. Deze opstelling laat het migratiegedrag van proteïnen in de gradiënt en bovendien de samenstelling van verschillende complexen met betrekking tot de onderzochte stammen te analyseren.
Deze werkwijze wordt toegelicht door hoofdzakelijk concentreren op drie eiwitten: De eerste kandidaat is de chloroplast gelokaliseerde eiwitten calcium sensor CAS, dat werd aangetoond dat het betrokken foto-acclimatisatie in C. reinhardtii 22. Calcium wordt beschouwd als een belangrijk signaaling ion voor trajecten die worden geactiveerd door verschillende biotische en abiotische stress uiteindelijk leidt tot veranderingen in genexpressie en celfysiologie 23 en er werd voorgesteld dat chloroplasten kunnen bijdragen tot cellulaire Ca 2 +-signalen via de CAS eiwit 22,24,25. Het tweede eiwit is ANR1 (anaërobe reactie 1 6), een eiwit dat werd opgenomen onder anoxische groeiomstandigheden wordt geïnduceerd in C. reinhardtii 26. Met name CAS en ANR1 werden geïdentificeerd als subeenheden van de CEF-supercomplex en bovendien met behulp van omgekeerde genetische technieken werd aangetoond dat beide eiwitten functioneel bijdragen aan CEF in vivo 6, steun voor de rol functionele subeenheden van het eiwitcomplex. Het derde eiwit is het eiwit thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), dat werd aangetoond dat het betrokken in CEF Chlamydomonas 4,27 en 5,28 in Arabidopsis en ook identified in het werk van Iwai et al.. 7
Wildtype (WT) versus (vs) een ΔPSI 29 stam vertoont een deletie van de PSAB gen codeert voor een essentiële fotosysteem I subeenheid, die ook deel uitmaakt van het: Deze benadering wordt door tonen de resultaten van twee experimenten worden gepresenteerd CEF-supercomplex en WT versus een pgrl1 knock-out stam 4. Voor elk van deze experimenten is de kwantitatieve samenstelling van de CEF-supercomplex tussen 15 N en een 14 N-gemerkte stam vergeleken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kweken van Chlamydomonas
- De volgende C. reinhardtii stammen werden gebruikt in de huidige studie: WT cc124, WT cw15-arg7 (celwand deficiënte en arginine auxotroph), een ΔPSI mutante stam 29 en een pgrl1 knock-out stam 4.
- Alle stammen werden gekweekt in Tris-acetaat-fosfaat (TAP)-medium 30 bij 25 ° C met een constante lichtintensiteit van 20-50 uE / m 2 s en schudden bij 120 rpm. De cultuur van ΔPSI moet worden ingepakt met een aantal papieren zakdoekje voor blootstelling aan licht van <5 uE / m 2 sec.
- De culturen van de gelabelde stammen (ΔPSI en WT cc124, respectievelijk) bevatte 7,5 mm 15 N NH 4 Cl, terwijl de culturen voor de nonlabeled stammen (WT cw15-arg7 en pgrl1, respectievelijk) bevatte 7,5 mm 14 N NH 4 Cl. Cellen moeten groeien minstens vier generatorionen volledige vermelding en bereiken moet exponentiële groeifase gehouden.
- Op de dag voordat het experiment tellen en verdun cellen tot een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in een volume van 750 ml / stam.
Merk op dat twee soorten discontinue sucrose dichtheidsgradiënten worden in het volgende protocol. De fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten volgens Takahashi et al.. 9 worden gebruikt om de verschillende fotosynthetische eiwitcomplexen van geïsoleerde en gesolubiliseerde thylakoiden tijdens gedurende de nacht centrifugatie gescheiden en de dag worden voorbereid voor (zie protocol 2) en thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten 8 zijn in de thylakoid isolatie procedure toegepast (zie Protocol nr. 3).
2. Voorbereiding van Fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten
- Voor het gieten van de hellingen drie stock oplossingen nodig:
- 2 M Sucrose
- 10% β-DM in H2O
- 0,5 M Tricine, pH 8,0 (NaOH)
- Met behulp van deze bestanden, de voorbereiding van de volgende oplossingen:
Concentratie: 1.3 M 1,0 M 0.85 M 0.7 M 0.65 M 0.4 M 2 M Sucrose 13 ml 10 ml 8.5 ml 7 ml 6,5 ml 4 ml 10%46,-DM 100 pl 100 pl 100 pl 100 pl 100 pl 100 pl 0,5 M Tricine 200 gl 200 gl 200 gl 200 gl 200 gl 200 gl H2O 6,7 ml 9.7 ml 11.2 ml 12,7 ml 13.2 ml 15.7 ml - Gebruik 14 mm x 89 mm centrifugebuizen en giet de gradiënten zeer langzaam beginnen met de hoogste dichtheid sucrose oplossing een lagere dichtheid oplossing.
- Giet slechts 1 ml elk voor de 1,3 en 1,0 M oplossingen en 2 ml voor de rest van de oplossingen.
- Verlaat gradiënten nacht in de koude kamer.
3. Anaërobe Inductie en isolatie van thylakoïdmembranen 8
- Voordat de isolatie van thylakoïdmembranen induceren anaerobe omstandigheden door doorborrelen met argon 4 uur. Het borrelen kan worden uitgevoerd door een glazen pipet kweken kolven onder constant mengen van de kweek met een magnetische roerstaaf.
- Begin met de isolatie van thylakoïdmembranen door pelleteren van de cellen gedurende 5 minuten bij 2500 xg, resuspendeer in H1 buffer (0,3 M sucrose, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2).
(Let op dat bij het starten met de isolatie van thylakoïdmembranen monsters shOuld worden bewaard op ijs om eiwitafbraak te voorkomen, worden alle centrifugeren stappen uit bij 4 ° C en het werken met handschoenen wordt sterk aanbevolen om keratine besmetting te voorkomen.) - Pellet cellen gedurende 5 minuten bij 2500 xg, resuspendeer in H1 buffer.
- Breken cellen met twee passages door een verstuiver met een stikstofdruk van 1500 hPa (voor stammen zonder celwand doen slechts een passage).
- Spin down cellen gedurende 7 minuten bij 2500 x g.
(Na deze stap wordt het supernatant moet licht groen, indien niet, het breken van de cellen was niet succesvol.) - Resuspendeer cellen in H2 buffer (0,3 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) en pellet cellen gedurende 10 min bij 32.800 x g.
- Resuspendeer cellen in H3 buffer (1,8 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) en homogeniseer pellet met een potter (geen groene deeltjes moeten aan het eind van deze bewerkingsstap blijven).
- Bereid thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten in bades (25 mm x 89 mm) door te beginnen bij de bodem met een laag van 12 ml H3 buffer met cellen, giet een middenlaag van 12 ml H4-buffer (1,3 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA ( pH 8,0)) en bovendien 12 ml H5 buffer (0,5 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Wees voorzichtig bij het gieten van de hellingen en voorkomen dat het mengen van de drie lagen.
- Evenwicht te brengen met H5 buffer en centrifugeer thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten 1 uur bij 70.700 x g.
- Verwijder thylakoid bands uit de thylakoid sucrose dichtheidsgradiënten en verdun ze met een geschikt volume H6 buffer (5 mM HEPES (pH 7,5) 10 mM EDTA (pH 8,0)).
- Spin down cellen bij 37.900 xg gedurende 20 minuten. Indien de pellet niet strak is meer H6 buffer vereist voor deze centrifugatie stap.
- Resuspendeer thylakoiden in een klein volume H6 buffer en ga verder met de bepaling van de concentratie chlorofyl.
4. Bepaling van chlorofylconcentratie 31
- De bepaling van de hoeveelheid chlorofyl wordt uitgevoerd met 80% aceton.
- Meng 995 ul 80% aceton en 5 ul van thylakoiden in H6 buffer (verdunning 1:200).
- Vortex gedurende enkele seconden tot er geen groene deeltjes blijven en dan spin down op 14.1 xg gedurende 5 minuten.
- Neem de bovenstaande vloeistof en meet de extinctie bij 663,6 en 646,6 nm en 750 nm respectievelijk.
- Bereken de hoeveelheid chlorofyl met de volgende formules:
- C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * verdunningsfactor
- C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * verdunningsfactor
- C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b
5. Laden van Fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten
- Bereken de hoeveelheden thylakoiden, β-DM en H6 buffer die nodig zijnVoor elke gradiënt:
- Elke gradiënt moet worden geladen met een totaal volume van 700 pi met 0,8 mg / ml chlorofyl in 0,9% β-DM (oplossen β-DM in H2O), vult het resterende volume H6 buffer.
- Voor het oplosbaar bereiden verschillende fracties met thylakoiden, β-DM en H6 buffer voor elke helling.
- Verlaat monsters gedurende 20 minuten op ijs met regelmatig mengen (omkeren) om de paar minuten (oplosbaarmakingsstap).
- Centrifugeer bij maximale snelheid (14.000 x g) gedurende 10 min bij 4 ° C.
(Na centrifugatie dient de pellet klein en witachtig terwijl de supernatant donkergroene.) - Laad supernatant op de hellingen.
- Schalen met H6 buffer en draaien met ultracentrifuge bij 134.470 xg gedurende de nacht (14 uur) bij 4 ° C.
(Houd er rekening mee dat de succesvolle scheiding van fotosynthetische complexen met behulp van fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten zoals gepresenteerd in dit protocol alleen wordt bereikt wanneer using vers geïsoleerde thylakoiden, omdat een voorspelling voor het oplosbaar en complexe scheiding is moeilijk om bij het werken met thylakoidmembranen die eerder zijn ingevroren te maken.)
6. Fractionering van Fotosysteem sucrose dichtheidsgradiënten
- Neem foto's van de hellingen.
- Doorboren gat in de bodem van de buis met behulp van een naald en fractioneren gradiënten in 500 pl buizen. Alternatief kan de fractionering worden uitgevoerd met een 96-putjesplaat (microtiterplaat).
- Bij gebruik van een microplaat, bepalen absorptie van verschillende gradiënt fracties bij 675 nm.
(Bij deze stap monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele weken.)
7. SDS-PAGE en Immunodetectie
(Let op: alleen voor de vergelijking van WT versus ΔPSI een western blot analyse is uitgevoerd om de fracties voor de volgende MS-analyse te selecteren. Voor het experiment WT vs pgrl1 fracties werden gekozen na de absorptie in de verschillende fracties.)
- Afzonderlijke 30 pi van elke fractie uit WT en ΔPSI gradiënt op een 13% SDS polyacrylamidegel 32.
- Voer western blot analyse 33 met de volgende antilichamen: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, de PSI subunit PSAD 32 en de PSII kern subunit D1. Gebruik alle antilichamen met een verdunning van 1:1.000 (voor verbeterde chemiluminescentie detectietechniek), behalve de D1 antilichaam, die moet worden gebruikt met een verdunning van 1:10.000.
- Op basis van de resultaten van de immunodetectie, neem de piekfracties van ANR1, PGRL1 en PSAD voor WT en ΔPSI (hier fracties 6 en 13, respectievelijk), meng 30 ul van fractie 6 van WT en ΔPSI en doe hetzelfde met fractie 13 uit zowel preparaten en scheiden ze weer op een 13% SDS-polyacrylamide gel.
- Voor de kwantitatieve vergelijking van WT versus pgrl1 nemen de CEF-supercomplex fracties bepaald door de absorptie in de verschillende gradiëntfracties en meng 30 pl van beide monsters, gevolgd door scheiding op een 13% SDS polyacrylamidegel.
- Vlekken de eiwitbanden met Coomassie-oplossing (85% fosforzuur, 757 mM ammoniumsulfaat, 1,2% Coomassie brilliant blue, 20% methanol) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Om niet-specifieke kleuring te verwijderen, wassen meerdere malen met DDH 2 O.
- Snijd de rijstroken in 1 mm gel stukken en ga verder met de in-gel spijsvertering.
(Als alternatief, monsters kunnen worden gedroogd een paar minuten in een vacuüm centrifuge en opgeslagen voor een paar weken voordat u verder gaat met de in-gel spijsvertering.)
8. In-gel Spijsvertering (Gewijzigd van Shevchenko et al.. 35)
Let op om alle buffers en oplossingen kort voor gebruik bereiden en te nemen glazen flessen voor buffers met acetonitril (ACN). <br /> LET OP! Werken met ACN kan schadelijk zijn; meer informatie kan worden gedownload van: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).
- Was gelstukken met> 10 volumina DDH 2 O (-200 pl) gedurende 30 sec.
- Incubeer de gelstukken met 300 pi 25 mM NH 4 HCO 3 gedurende 15 minuten onder schudden, verwijdert vloeistof.
- Incubeer de gelstukken met 300 pi 25 mM NH 4 HCO 3 in 50% ACN (bereid door ACN en 50 mM NH 4 HCO 3 in een verhouding van 1:1) gedurende 15 minuten onder schudden, verwijdert vloeistof.
- Als de gel stukken zijn nog steeds blauw, herhaal dan de NH 4 HCO 3 en NH 4 HCO 3 / ACN wast tot de meeste van de Coomassie wordt verwijderd.
(Hoewel het grootste deel van Coomassie kleuring moet worden verwijderd, is het niet nodig de gelstukken volledig destain.) - Voeg 100 ul van ACN aan de gel stukken gedurende 5 minuten uitdrogen. De gel stukken moeten krimpennd kijken helemaal wit.
- Verwijder zoveel ACN mogelijk en ga verder met trypsine spijsvertering. Als alternatief kunnen monsters worden bewaard bij -20 ° C gedurende enkele weken.
- Voeg 10-20 ul per band van 20 ng / ul trypsine in 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (vers verdund), blijven monsters op ijs.
- Na 30 min, controleren of alle oplossing werd geabsorbeerd en voeg meer trypsine buffer, indien nodig. Gel stukken moet volledig bedekt met trypsine buffer. Blijf monsters op ijs.
- Verlaat gel stukken voor nog eens 90 minuten op ijs te verzadigen met trypsine.
(Kritische stap: De opbrengst van tryptische peptiden aanzienlijk toe met toenemende incubatietijden op ijs, waarschijnlijk door langzame diffusie van het enzym in de matrix polyacrylamide Er moet een kleine overmaat oplossing te hebben die de gelstukken te voorkomen dat de stukken. vallen droog tijdens de nachtelijke incubatie.) - Digest bij 37 ° C gedurende 4-6 uur. Voor experimenten diemaximale peptide herstel, verteren 's nachts.
- Na vertering spin down verkorte buffer.
- Sonificeer buizen gedurende 5 min naar peptiden en centrifugeer weer elueren.
- Verzamel supernatant en overbrengen naar een nieuwe buis.
- Voer peptide extractie met 80 ul van 30% ACN / 1% mierenzuur (FA) in een sonische bad gedurende 15 minuten.
- Voer extractie met 80 ul van 30% ACN / 1% FA in een sonisch bad gedurende 15 minuten.
- Voer extractie met 80 ul van 70% ACN / 1% FA in een sonisch bad gedurende 15 minuten.
- Centrifuge weer en het zwembad supernatant met voorafgaande eluaat.
(FA dient om trypsine te inactiveren en verhoging peptide oplosbaarheid.) - Droge peptide oplossing volledig in een vacuüm centrifuge.
(Op dit punt monsters kunnen worden bewaard gedurende enkele weken -20 ° C alvorens MS-analyse.) - Hersuspenderen peptiden in 6 pl MS buffer (5% ACN, 0,1 v / v FA, water) en ultrasone trillingen gedurende 2-5 minuten.
- Centrifugeer monsters op maximum snelheid gedurende 5 min aan fijn materiaal te verwijderen.
- Gebruik 4 pl supernatant voor massaspectrometrische analyse.
9. MS-Data Analysis met "Proteomatic"
De data-analyse werd uitgevoerd met de open-source software "Proteomatic" (die http://www.proteomatic.org/ kan worden gedownload), een platform waarmee de generatie en de voltooiing van de MS / MS data evaluatie pijpleidingen, door gebruik te maken gratis en commerciële software 36. In het kort worden de instellingen die hieronder worden beschreven en meer gedetailleerde informatie kan worden gevonden in 6,26.
- Identificatie en kwantificering van MS-gegevens
Identificatie en kwantificering van eiwitten van de experimenten WT versus ΔPSI werden gedaan met OMSSA (versie 2.1.4 37) en qTrace 26 respectievelijk beschreven 6,26. Voor de MS-analyse van gegevens uit het experiment WT vs pgrl1 de volgende bijgewerkte pijpleiding werd gebruikt:- Naast OMSSA 37 werden eiwitten ook geïdentificeerd met X! Tandem (versie 2013/02/01 38). Beide algoritmes werden door te zoeken tegen een database gegenereerd door het combineren van de JGI Chlamydomonas gen modeldatabase versie 4.3 met de AUGUSTUS databaseversie 10,2 alsook tegen een gezamenlijke database van de NCBI toegepaste databases BK000554.2 en NC_001638.1.
- MS 2 identificatie van peptiden werd uitgevoerd met behulp van een doel-decoy benadering 39. Een valstrik voor elk eiwit is gemaakt door willekeurig schuifelen tryptische peptiden met behoud van de redundantie van nonproteotypic peptiden.
- Statistische validatie van de peptiden werd uitgevoerd met de software qvality (versie 0.3.3 40) met een achterste foutkans (PEP) drempel van minder dan 0,01 en de resultaten werden gefiltreerd met een precursor massatolerantie van 5 dpm.
- Peptiden uit OMSSA en X! Tandem runs werden samengevoegd en gekwantificeerd met qTrace
Om te onderzoeken of proteïne verhoudingen significant verschillend ten opzichte van elkaar in de gemengde CEF-supercomplex fracties van WT en pgrl1, werd statistische analyse uitgevoerd toepassing van SPSS software (versie 21). De subeenheden van het cytochroom b 6 / f complex getest tegen elkaar en de eiwitten FNR, FTSH2 en HCF136 tegen de PSI subeenheden. De peptide verhoudingen van elke scan telling per eiwit van alle vier herhalingen werden getest op een normale verdeling met de Shapiro-Wilks test. Aangezien het peptide populaties niet normaal verdeeld (p <0,001), werden niet-parametrische statistieken uitgevoerd. Eerst werd de Kruskal-Wallis-test toegepast beoordeling van een aanzienlijke afwijking tussen groepen. Alleen als deze test voorspelde significant verschils tussen groepen werd verder onderzoek uitgevoerd om significante verschillen tussen twee onafhankelijke groepen voorspellen met de Mann-Whitney U-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De geïntroduceerde kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op de samenstelling van multiprotein complexen karakteriseren thylakoidmembranen blijkt uit de vergelijkende analyse van CEF-supercomplex componenten in genetisch verschillende C. reinhardtii stammen. De beschreven methode is met succes door Terashima et al.. 6 is toegepast en omvat de isolatie van thylakoïdmembranen van anaërobe gegroeid culturen, gevolgd door reinigingsmiddel oplosbaar. Vervolgens worden de monsters geladen op een sucrose dichtheid op basis van gelijke chlorofyl bedrag en complexen worden gefractioneerd door ultracentrifugatie. Voor de kwantitatieve MS-analyse gelijke volumes van twee gradiënt fracties van verschillende stammen worden gemengd en relatief geanalyseerd (Figuur 1). De gepresenteerde resultaten zijn de vergelijking van de CEF-supercomplex fractie tussen WT cw15-arg7 en ΔPSI evenals WT cc124 en pgrl1, respectievelijk.
(Figuren 2A en 2B) werden gekozen 6. Figuur 3 geeft de relatieve verhoudingen eiwit als WT / ΔPSI (14 N / 15 N) meerdere SIP kern en LHCI eiwitten (light harvesting eiwitten PSI ook genoemd Lhca eiwitten) en voor eiwitten toegewezen met de CEF-supercomplex. Zoals verwacht, zijn PSI kernproteïnen alleen te vinden in WT monsters aangetoond door oneindig verhoudingen in beide fracties. Lhca2 en Lhca9 worden verrijkt in de WT, terwijl Lhca4 -6 en -8 een andere regeling in beide fracties tonen. Het is belangrijk op te merken dat LHCI eiwitten worden gesynthetiseerd en gewoonlijk verzameld in de ΔPSI mutant 41. Het polypeptide vergelijking van de PSI-LHCIcomplex van C. reinhardtii WT met LHCI complex van de ΔPSI mutant bleek dat de meerderheid van Lhca2, -3 en -9 lijkt slechts zwak gebonden LHCI en bovendien dat de aanwezigheid van de PSI kern is noodzakelijk voor een stabiele binding. In tegenstelling, Lhca1, -4, -6, -7 en -8 vormen een complex onafhankelijk van de assemblage van PSI 14, die de verschillende regulering van Lhca4, -6 en -8 in het huidige experiment zou kunnen verklaren.
Voor eiwitten worden toegewezen aan de CEF-supercomplex kan worden onderscheiden die overvloediger in WT fractie 6 en fractie 13 van de ΔPSI mutant, die een sterke PSI-afhankelijke migratie weergegeven verhoudingen hoger dan een voor fractie 6 en ratio's lager dan een of niet gedetecteerd in fractie 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, PFD, HCF136 en cyt f) en die toont niet zo'n sterke, maar toch een PSI-afhankelijke lokalisatie (FNR, FTSH1, FTSH2 en ATPC ).
Met dit experiment Terashima et al.. 6 toonde een SIP-afhankelijke migratiegedrag voor ANR1 en CAS (Figuren 2A-D en fig. 3), waardoor ze onthullen als nieuwe eiwitten van de CEF-supercomplex eerder niet geïdentificeerde 7. De bevindingen van de MS-analyse werden ook bevestigd door immunodetectie en ondersteund door de toepassing van reverse genetics aan een functionele rol van deze eiwitten voor CEF in vivo 6 bevestigen. Bovendien, deze vergelijkende MS-benadering ondersteunt sterk de resultaten van eerdere studies, door te controleren eiwitten reeds aangetoond deel van de CEF-supercomplex zoals PGRL1, cyt f FNR en 7, alsmede Lhcbm5 7,9 te laten zien PSI-afhankelijke lokalisatie in de sucrose dichtheidsgradiënt, vergelijkbaar met ANR1 en CAS.
De vergelijking van de fractie 6 en 13 van anr1 en ΔPSI met dezelfde approach (zie figuur S8 6) toonde een vergelijkbare samenstelling van de CEF-supercomplex in anr1 en dezelfde trend voor de eiwitten ANR1, CAS en PGRL1 zoals geopenbaard in het experiment WT vs ΔPSI. Met name, hoewel de eiwitverhouding van ANR1 in fractie 6 (anr1 vs ΔPSI) is vergelijkbaar met de verhouding van de WT versus ΔPSI experiment werd de hoeveelheid CAS en PGRL1 lijken hoger in de voormalige experiment en kan een gevolg zijn van compensatie van de down-regulatie van ANR1 6.
Trouwens, de verrijking van ANR1 en CAS in de CEF-supercomplex fractie zou men ook kunnen afleiden van de PSI-afhankelijke migratie van verschillende andere eiwitten uit dit experiment. Dit zijn twee ATP-afhankelijke metalloproteases FTSH1 en FTSH2 dat een fundamentele rol in de afbraak van de PSII reactiecentrum eiwit D1 in chloroplasten spelen 42,43, een prefoldin-domein met eiwit, de HCF136, dat is een cruciale factor voor de stabiliteit of assembly van PSII 44 en de γ-subeenheid van de ATPase. Dat het meer een, de verhouding tussen fractie 6 en 13 niet zulk een verschil vertonen verdere experimenten moeten worden uitgevoerd om na te gaan of de andere eiwitten ook kandidaten van CEF-supercomplex kunnen zijn.
Als een proof of concept experiment voor deze vergelijkende benadering, analyseerden we de CEF-supercomplex compositie in twee stammen, die beide PSI, waardoor de vorming van dit complex. De desbetreffende fracties werden geselecteerd op basis van de absorptiemetingen van de gefractioneerde gradiënten. Figuren 4A en 4B tonen de resultaten voor de kwantitatieve vergelijking tussen WT en pgrl1 knock-out stam. Hierbij moet worden opgemerkt dat ANR1 en CAS zijn niet opmerkelijk veranderd tussen WT en pgrl1. Interessant HCF136 lijkt verrijkt in de WT, terwijl FTSH2 lijkt verrijkt pgrl1. Een statistisch significant verschil beide voornoemde eiwitten aan alle PSI-subeenheden (inclusief LHCI eiwitten) kan worden bevestigd.
Bovendien, het cytochroom b 6 / f complex subeenheden cyt f en PETO werden significant verschillend respectievelijk cyt b 6, cyt b 6 / f IV en PETC, zijn. Met name cyt f lijkt te zijn up-gereguleerd in pgrl1, terwijl cyt b 6 en cyt b 6 / f IV zijn iets down-gereguleerd, hoewel de regeling van cyt f synthese zijn waarschijnlijk cyt b 6 en cyt b 6 / f IV 45 . De nucleaire-gecodeerde PETC, die ook bekend staat als Rieske eiwit toont een soortgelijke regeling als cyt b 6 en cyt b 6 / f IV (dwz een down-regulatie in pgrl1). Dit is opvallend als een verlaging of afwezigheid van het eiwit Rieske nog leiden tot de ophoping van de other cyt b 6 / f subeenheden tot ~ 60% van de WT-niveau in C. reinhardtii 46. Bovendien, de up-regulatie van PETO in pgrl1 op gewezen, aangezien losjes gebonden subeenheid bleek te accumuleren tot een vermindering in C. reinhardtii mutanten die hetzij cyt b 6, cyt b 6 / f IV of PETC 47, die minder overvloedig in pgrl1 vergelijking met WT in dit experiment zijn.
Figuur 1. Experimentele workflow weergegeven voor de WT en ΔPSI. Cellen metabolisch gelabeld gedurende ten minste vier generaties worden anaërobe omstandigheden geïnduceerd door argon borrelen gedurende 4 uur en thylakoidmembranen worden geïsoleerd door gradiëntscheiding. Het Isolated membranen werd opgelost met β-DM, geladen op een sucrose dichtheidsgradiënt (beide stammen gelijke hoeveelheden chlorofyl in deze stap worden toegepast) en een nacht gecentrifugeerd. De gradiënt fracties worden verzameld en geanalyseerd door SDS-PAGE en immunodetectie de verdeling van eiwitten te bepalen binnen de gradiënt. Om eiwitten te identificeren met een PSI-afhankelijke migratie, gelijke volumes van de WT CEF-supercomplex fractie (fractie nummer 6) en de bijbehorende 15N-gemerkte fractie uit de ΔPSI stam werden gemengd en relatief geanalyseerd. Hetzelfde werd gedaan met de piek fractie van ANR1 in de ΔPSI stam (fractie nummer 13). Voor de vergelijkende, kwantitatieve MS-benadering werden de gemengde eiwitmonsters door SDS-PAGE, eiwitbanden werden gekleurd met Coomassie-blauw-oplossing, gevolgd door in-gel digestie voor MS-analyse. Klik hier om een grotere ima bekijkenge.
Figuur 2. ANR1 en CAS migreren naar de lagere dichtheid gebieden in de ΔPSI stam. A:. Sucrose dichtheidsgradiënten van WT en ΔPSI thylakoiden geïsoleerd van anaërobe omstandigheden werden gescheiden in 20 fracties B: Immunodetectie van ANR1 in de 20 fracties van de gradiënt van WT en ΔPSI. Hoewel dit eiwit is gelokaliseerd in het gebied met hogere dichtheid in de WT (fractie 6) het is verschoven naar de lagere dichtheid gebieden in de ΔPSI stam (fractie 13) C:. Sucrose dichtheidsgradiënten WT en ΔPSI thylakoiden geïsoleerd uit anaërobe omstandigheden werden gescheiden in 27 fracties D:. Immunodetectie van CAS in de 27 fracties van de gradiënt van WT en ΔPSI. Hoewel dit eiwit gelokaliseerd to de regio een hogere dichtheid in de WT (piek rond fractie 7) het is verschoven naar de lagere dichtheid regio's in de ΔPSI stam (piek rond fractie 19). (Dit cijfer is aangepast Terashima et al.. 6). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Relatieve proteïneverhoudingen bepaald in fractie 6 en 13 van WT en ΔPSI door kwantitatieve massaspectrometrie. Fracties 6 en 13 van WT werden vergeleken met de respectieve fracties van de 15 N-gemerkte ΔPSI stam. De relatieve verhoudingen eiwit dat twee biologische herhalingen en drie MS-runs vertegenwoordigen worden afgeschilderd als WT / ΔPSI (14N / 15 N) voor beide onderzochte fracties met uitzondering van cyt f, die alleen geïdentificeerd in fractie 6. Deze vergelijkende kwantificering blijkt dat ANR1 en CAS tonen een PSI-afhankelijke migratie in de sucrose dichtheid (dit cijfer is aangepast Terashima et al.. 6). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Relatieve proteïne verhoudingen bepaald in CEF-supercomplex fractie WT en pgrl1 door kwantitatieve massaspectrometrie. A: Sucrose dichtheidsgradiënten van WT en pgrl1 thylakoiden geïsoleerd van anaërobe omstandigheden B:. Relatieve eiwit verhoudingen between de CEF-supercomplex fractie afkomstig uit vier verschillende herhalingen afgeschilderd als WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). In dit experiment ANR1 en CAS zijn niet opmerkelijk veranderd, terwijl FTSH2 en HCF136 vertonen significante verschillen in vergelijking met alle PSI-subeenheden (p ≤ 0.001 zoals aangegeven door *** in rood; HCF136: 1900 <U <58.127; FTSH2: 2117 <U <164.197). Bovendien, de cyt b 6 / f complex subeenheden cyt f en PETO werden significant verschillend van cyt b 6, cyt b 6 / f IV en PETC (p ≤ 0,001 tot wat wordt aangegeven met *** blauw; CYT f : 2684 <U <11535; PETO:. 4.700 <U <23.663) Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende kwantitatieve proteomics studies met behulp van stabiele isotopen zijn gepubliceerd in de laatste jaren. In deze experimenten gewoonlijk twee verschillende monsters worden vergeleken, waarvan een monster wordt gelabeld met een stabiele isotoop. Daarna eiwitten of peptiden uit beide monsters worden gecombineerd in gelijke ratio en verder samen verwerkt 48. Dergelijke studies vaak van plan om bepaalde geïsoleerde cellulaire compartimenten (bv chloroplasten, mitochondriën, of thylakoidmembranen) blootgesteld aan verschillende stress condities 26,34,49 te onderzoeken vergelijken up-of down-regulatie van specifieke eiwitten. De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomische benadering gericht op de samenstelling van multiprotein complexen te analyseren in de thylakoidmembraan en, in tegenstelling tot de bovengenoemde studies, gebaseerd op het mengen van hetzelfde volume van monsters na scheiding van sucrose dichtheid thylakoidmembranen geladen op gelijke concentratie chlorofyl vóór ultracentrifugatie. Deze werkwijze is effectief door Terashima et al.. 6 die relatief analyseerden de samenstelling van de CEF-supercomplex geïsoleerd uit een WT en ΔPSI stam eiwitten migreren PSI-afhankelijke in een sucrose dichtheidsgradiënt identificeren toegepast.
De verwezenlijking van deze strategie wordt bewezen door het feit dat de MS-resultaten verder worden ondersteund door immunodetectie. Bovendien Terashima et al.. Kunnen de bevindingen bevestigen van vorige studies (de identificatiegegevens en PSI-afhankelijke migratie van reeds beschreven deel van de CEF-supercomplex zoals PGRL1, FNR en cyt f 7, eiwitten). De identificatie van ANR1 en CAS als nieuwe onderdelen van de CEF-machines 6 onthult deze aanpak als een zeer krachtig en efficiënt hulpmiddel. Met name de geïsoleerde CEF-supercomplex tentoongesteld in vitro activiteit, waardoor de succesvolle zuivering van een functie aantonennale multi-eiwitcomplex 6. De toepasbaarheid van deze benadering ook twee stammen waarvan beide vormen een CEF-supercomplex blijkt uit de vergelijking tussen WT en pgrl1.
In het algemeen kan deze werkwijze worden gebruikt om complexe samenstellingen in verschillende stammen of condities enquête zoals blijkt uit de identificatie van eerder geïdentificeerde eiwitten die meegezuiverde de CEF-supercomplex fractie (de verrijking van FTSH1, FTSH2, PFD en HCF136 in de CEF-supercomplex fractie). Of deze eiwitten mogelijk nieuwe kandidaten van dit complex en ons begrip van de regulering van verschillende FTHS2, HCF136 verbeteren, evenals voor de cyt b 6 / f subeenheden zoals blijkt uit de vergelijking van WT en pgrl1 verdere experimenten zijn noodzakelijk.
Naast de beschreven voordelen van deze benadering zijn verbrekenal kritische stappen die moeten zorgvuldig worden overwogen bij het werken met dit protocol: Het breken van cellen met de vernevelaar is de eerste belangrijke stap. Als de opening van de cellen niet in een juiste manier wordt uitgevoerd, zal de opbrengst van geïsoleerde thylakoiden vrij laag zijn en kan leiden tot nauwelijks detectie van de CEF-supercomplex na over-nacht centrifugeren. De succesvolle verstoring van cellen kunnen worden afgeleid uit de lichtgroene kleur van de supernatant na centrifugeren. Als daarentegen de druk tijdens cel verstoring te hoog, delen van de supercomplex kunnen desintegreren en belangrijke cofactoren verloren gaan. Een andere stap beïnvloeden van de opbrengst van thylakoiden is de resuspensie van cellen met een pottenbakker. Dit moet zorgvuldig worden uitgevoerd en aan het einde van deze stap slechts weinig groene deeltjes moeten blijven. Bovendien, voor de bereiding van de sucrose dichtheidsgradiënten de dag vóór en voor de solubilisatie van membraancomplexen, is het zeer belangrijk omJuist dit protocol te volgen wat de β-DM concentratie, aangezien dit van belang volledig oplosbaar thylakoiden verkrijgen 50 en dus ook voor de zuivering van de CEF-supercomplex. De oplosbaarmakingsstap is met succes uitgevoerd als een kleine, witachtige pellet wordt waargenomen na de daaropvolgende centrifugatie stap. Een ander kritisch punt dat hier moet worden vermeld is de tijd van over-nacht ultracentrifuge. De sucrose dichtheidsgradiënten moet gedurende ten minste twaalf uur worden gecentrifugeerd om de volledige scheiding van de fotosynthetische complexen te realiseren.
Hoewel het protocol wordt aangetoond middels C. reinhardtii voor de vergelijkende analyse van de CEF-supercomplex compositie in twee genetisch verschillende stammen, is het eenvoudig aan te passen ook een breed scala van andere vragen, zoals de vergelijkende analyses van multi-eiwitcomplex samenstelling geïsoleerd uit verschillende milieu / experimentalaandoeningen of door andere soorten fractionering. De enige vereisten van deze benadering is dat het model organisme in celkweek worden gekweekt, kan ammonium als stikstofbron en eiwitcomplexen kunnen worden gescheiden door sucrose dichtheidsgradiënten, tonen een brede toepassing van deze methode. Voor toekomstige toepassing van deze benadering SDS-PAGE fractionering van de gemengde 14 N / 15 N samples en vervolgens in-gel digestie kan worden vervangen door het toepassen van het filter gesteunde monstervoorbereiding (FASP) methode. Deze werkwijze omvat de toepassing van reinigingsmiddelen voor solubilisering gericht "schoonmaak" het proteoom voor digestie en gezuiverde peptiden, waardoor de nadelen van de in-gel digestie benadering die peptide herstel remmen, hoewel men dient te bedenken dat in-gel spijsvertering wordt beschreven robuust verontreinigingen die kunnen interfereren met de vertering 51 te zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.
Acknowledgments
MH erkent steun van de "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Auteur bijdragen: MH opgezet onderzoek, KT, JS en MT uitgevoerde onderzoek en de gegevens geanalyseerd, KT en MH schreef de krant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
