Summary
Den beskrevne sammenlignende, kvantitativ proteomikk metode tar sikte på å skaffe innsikt i sammensetningen av multiprotein komplekser under forskjellige betingelser, og er vist ved å sammenligne genetisk forskjellige stammer. For kvantitativ analyse like volum av forskjellige fraksjoner fra et sukrose-densitets-gradient blir blandet og analysert ved massespektrometri.
Abstract
Den introduserte protokollen gir et verktøy for analyse av multiprotein komplekser i thylakoid membranen, ved å avsløre innsikt i komplekse sammensetningen under forskjellige forhold. I denne protokoll tilnærmingen er demonstrert ved å sammenligne sammensetningen av protein-komplekset er ansvarlig for syklisk elektronstrømmen (CEF) i Chlamydomonas reinhardtii, isolert fra genetisk forskjellige stammer. Fremgangsmåten omfatter isolering av thylakoid membraner, etterfulgt av deres separering i multiprotein komplekser med sukrose-densitets-gradient sentrifugering, SDS-PAGE, og immuno-deteksjonssammen, kvantitativ massespektrometri (MS), basert på differensial metabolsk merking (14 N / 15 N) til analysert stammer. Vaskemiddel oppløseliggjorte thylakoid membraner er lastet på sukrose tetthetsgradienter på lik klorofyll konsentrasjon. Etter ultrasentrifugering, blir gradienter separert i fraksjoner, som ble analysert ved masse-spectrometry basert på tilsvarende volum. Denne tilnærmingen gjør etterforskningen av sammensetningen innenfor gradient fraksjoner og dessuten å analysere migrasjon oppførsel av forskjellige proteiner, spesielt med fokus på ANR1, CAS, og PGRL1. Videre er denne metode demonstrert ved å bekrefte resultatene med immunoblotting, og i tillegg ved å støtte resultatene fra tidligere undersøkelser (identifikasjon og PSI avhengige vandring av proteiner som tidligere er beskrevet til å være en del av CEF-supercomplex eksempel PGRL1, FNR, og cyt f). Spesielt, er denne tilnærmingen gjelder å løse et bredt spekter av spørsmål som denne protokollen kan bli vedtatt og f.eks brukes for komparative analyser av multiprotein kompleks sammensetning isolert fra forskjellige miljøforhold.
Introduction
Fotosyntetiske prosesser i thylakoid membraner av planter og alger kan fungere i en lineær og cyklisk modus. Under lineær elektron flyt (LSF) photo I (PSI), photo II (PSII) og cytokrom b 6 / f til slutt overføre elektroner fra vann til NADP + 1, som fører til generering av NADPH og ATP to. I motsetning til dette sykliske elektronstrømmen (CEF), som er kjent for å bli indusert under forskjellige miljøbetingelser som statlige 2 3 og anaerobe betingelser 4, resulterer i en re-reduksjon av oksydert PSI ved å injisere elektroner tilbake inn i elektrontransportkjeden. Denne prosessen kan skje enten ved stromal side av cytokrom-b 6 / f-komplekset 1 eller ved plastoquinone basseng 5 og genererer ATP, men ingen NADPH 2.
Målet med den fremlagte protokoll er å demonstrere en massespektrometri (MS), basert m-metode for den komparative, kvantitativ analyse av multiprotein komplekser i thylakoid membraner av Chlamydomonas reinhardtii å få innsikt i sammensetningen av disse kompleksene under ulike forhold (eksemplifisert ved å sammenligne genetisk ulike stammer). Dette ble gjort i en publikasjon av Terashima et al. I 2012 viser en Ca 2 +-avhengige reguleringen av CEF i C. reinhardtii formidlet av en multiprotein komplekse inkludert proteiner CAS, ANR1, og PGRL1 seks. Fremgangsmåten vil bli forklart med forhold å analysere sammensetningen av CEF-supercomplex i to genetisk forskjellige stammer, for derved å ta fordel av merking av en av de to stammer med tunge nitrogen (15 N). I korthet protokollen innbefatter fremstilling av thylakoid membraner, etterfulgt av vaskemiddel solubilisering og fraksjonering av foto komplekser i en sukrose-densitets-gradient. Etter fraksjonering av graderingen, valgte fracsjoner av to stammer er blandet basert på tilsvarende volum, separert ved SDS-PAGE etterfulgt av in-gel fordøyelse og påfølgende kvantitativ MS analyse.
Som nevnt ovenfor, er CEF indusert under forskjellige miljøbetingelser, og en publikasjon fra 2010 viser isolering av en funksjonell CEF-supercomplex fra tilstand 2 låste celler av C. reinhardtii 7, som ble utført ved separering av solubiliserte membraner thylakoid på en sukrose-densitets-gradient i løpet av ultrasentrifugering. Forskjellig fra Iwai et al. 7, beskriver den presenterte protokollen isolering av CEF-supercomplex fra anaerobisk dyrket C. reinhardtii kulturer ved å følge en alternativ prosedyre. Dette består av endringer i thylakoid isolert protokoll, så vel som forskjeller i forhold til oppløseliggjøring trinn og separasjon av proteinkomplekser ved ultrasentrifugering. I dagens protokoll, thylakoid membranerblir isolert ved anvendelse av fremgangsmåten publisert av Chua og Bennoun 8, mens de buffere som brukes for tilberedning av thylakoid Iwai et al. inneholdt 25 mM Mes, 0,33 M sukrose, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) som beskrevet 9.. Den oppløseliggjøring ble utført med 0,7 til 0,8% vaskemiddel (n-tridecyl-β-D-maltoside) i 30 min på is i tilfelle av Iwai og medarbeidere, mens oppløseliggjøring metoden som er beskrevet her er avhengig av bruk av 0,9% vaskemiddel (n -Dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) og er utført i bare 20 min på is. Begge gruppene brukt 0,8 mg klorofyll pr ml for oppløseliggjøring av respektive vaskemiddel. For separasjon av foto komplekser fra oppløseliggjorte thylakoid membraner Iwai et al. Søkt sukrose konsentrasjoner mellom 0,1 til 1,3 M, mens forfatterne av denne protokollen som brukes konsentrasjoner spenner 0,4 til 1,3 M. Den siste forskjellen er sentrifugehastigheten, noe som er lavere enn til earlier publikasjonen.
Solubilization av thylakoid membraner med ioniske vaskemidler etterfulgt av sukrose tettshetsgradient fraksjone har allerede blitt brukt i en rekke studier som spenner fra 1980-tallet fram til i dag 7, 9-14 og også anvendelsen av metabolsk merking av proteiner er en utbredt metode i proteomikk-feltet. Den beskrevne metode anvender 15 N metabolsk merking for en av de to mot-stammer ved å dyrke den i nærvær av tung nitrogen som eneste nitrogenkilde i form av 15 N NH4Cl, som er innlemmet i alle aminosyrer som fører til en masse skifte avhengig av aminosyre-sekvensen av peptidet. Ved analyse av en blanding av 14 N og 15 N i en MS løper, kan denne masseforskyvning brukes til å bestemme prøve opprinnelse for hvert peptid og relative peptid Forekomsten kan beregnes som representerer relative Forekomsten for den tilsvaring protein 15.
Tallrike kvantitative proteomikk studier på C. reinhardtii er tilgjengelig, som sammenligner en definert mengde protein for å analysere endringer i proteomet mellom eksperimentelle forhold (for eksempel endringer i proteomet grunn av næringsstoff 16-19 eller lett stresset 20,21). Sammenlignet med disse studiene, i dag presenterte tilnærming like volum av prøver samlet og analysert. Dette oppsettet gjør det mulig å studere vandringsadferd av proteiner innen gradienten og dessuten for å analysere sammensetningen av forskjellige komplekser med hensyn til de undersøkte stammer.
Denne metoden vil bli forklart ved hovedsak konsentrere seg om tre proteiner: Den første kandidaten er kloroplast-lokaliserte kalsium sensor protein CAS, noe som viste seg å være involvert i foto akklimatisering i C. reinhardtii 22. Kalsium er ansett å være et viktig signaling ion for trasé som aktiveres på grunn av ulike biotiske og abiotiske påkjenninger endelig fører til endringer i genuttrykk og cellefysiologi 23, og det ble foreslått at kloroplaster kan bidra til å mobil Ca 2 + signaliserer via CAS protein 22,24,25. Det andre protein er ANR1 (anaerob reaksjon 1 6), et protein som ble vist å bli indusert i henhold anoksiske vekstforhold i C. reinhardtii 26. Spesielt, ble CAS samt ANR1 identifisert som subenheter av CEF-supercomplex og dessuten, ved hjelp av revers genetiske tilnærminger, ble det vist at begge proteiner bidrar funksjonelt til CEF in vivo 6, som støtter rollen som funksjonelle subenheter av dette protein kompleks. Den tredje protein er thylakoid protein PGR5-Like 1 (PGRL1), som ble vist å være involvert i CEF i Chlamydomonas 4,27 samt i Arabidopsis 5,28 og var også identified i arbeidet med Iwai et al. 7
Denne fremgangsmåten vil bli presentert ved å vise resultater fra to forskjellige eksperimenter: villtype (WT) versus (vs) en ΔPSI 29 belastning, som oppviser en delesjon av den psab-genet, som koder for en essensiell photosystem I-underenheten, som også er en del av CEF-supercomplex og WT vs en pgrl1 knock-out belastning fire. For hvert av disse eksperimenter den kvantitative sammensetning av CEF-supercomplex mellom en 15 N-, og en 14 N-merkede stamme er blitt sammenlignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Dyrking av Chlamydomonas
- Følgende C. reinhardtii stammer ble brukt i denne studien: WT cc124, WT cw15-arg7 (celle-vegg mangelfull og arginin auxotrof), en ΔPSI mutant belastningen 29 og en pgrl1 knock-out belastning fire.
- Alle stammer ble dyrket i Tris-acetat-fosfat (TAP)-medium 30 ved 25 ° C med en kontinuerlig lysintensitet på 20-50 μE / m 2 sek og rysting ved 120 rpm. Kulturen i ΔPSI bør pakkes med litt papir for lyseksponering av <5 μE / m 2 sek.
- Kulturer av de merkede stammer (ΔPSI og WT cc124, henholdsvis) inneholdt 7,5 mm 15 N NH 4 Cl, mens kulturer for nonlabeled stammer (WT cw15-arg7 og pgrl1, henholdsvis) inneholdt 7,5 mm 14 N NH 4 Cl. Celler har til å vokse i minst fire generationer for å oppnå full merking, og må holdes på eksponentiell vekstfase.
- På dagen før eksperimentet telle og fortynn cellene til en tetthet på 1 x 10 til 6 celler / ml i et volum på minst 750 ml / belastning.
Legg merke til at to typer av diskontinuerlige sukrose tetthetsgradienter er beskrevet i den følgende protokoll. De photosystem sukrose tetthetsgradienter i henhold til Takahashi et al. 9 blir brukt til å skille de forskjellige fotoproteinkomplekser fra isolerte og oppløseliggjorte thylakoids under over-natten sentrifugering og må bli fremstilt dagen før (se protokoll 2) og thylakoid sukrose tetthetsgradienter 8 anvendes i thylakoid isolasjonsmetoden (se protokoll 3).
2. Utarbeidelse av Photo Sukroseestere tetthetsgradienter
- For helle gradienter tre stamløsninger er nødvendig:
- 2 M sukrose
- 10% β-DM i H 2 O
- 0,5 M Tricine, pH 8,0 (NaOH)
- Ved hjelp av disse bestandene, forberede følgende løsninger:
Konsentrasjon: 1,3 M 1,0 M 0,85 M 0,7 M 0,65 M 0,4 M 2 M sukrose 13 ml 10 ml 8,5 ml 7 ml 6,5 ml 4 ml 10%46;-DM 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 0,5 M Tricine 200 mL 200 mL 200 mL 200 mL 200 mL 200 mL H2O 6,7 ml 9,7 ml 11,2 ml 12,7 ml 13,2 ml 15,7 ml - Bruk 14 mm x 89 mm sentrifugerør og hell gradienter svært sakte, og starter med de høyeste sukrose tetthet løsning til lavere tetthet løsning.
- Hell bare ett ml hver for de 1,3 og 1,0 M løsninger og 2 ml for de andre løsninger.
- La gradienter over natten i kjølerommet.
Tre. Anaerob induksjon og Isolering av thylakoid Membraner 8
- Før man starter med isolering av thylakoid membraner, indusere anaerobe forhold ved bobling med argon i 4 timer. Den boblende kan utføres gjennom et glass-pipette i dyrkning kolber med konstant blanding av kulturen med en magnetisk rørestav.
- Begynn med isolering av thylakoid membraner ved å pelletere cellene i 5 min ved 2500 xg, resuspender i H1-buffer (0,3 M sukrose, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2).
(Vær oppmerksom på at når du starter med isolering av thylakoid membraner prøver should holdes på is for å unngå proteinnedbrytning, er alle sentrifugeringsfremgangsmåten utført ved 4 ° C og som arbeider med hansker er sterkt anbefalt å unngå keratin forurensning.) - Pellet cellene for 5 min ved 2500 xg, resuspender i H1 buffer.
- Bryte-celler med to passasjer gjennom en forstøver med et nitrogentrykk på 1500 hPa (for stammer uten cellevegg ikke bare en passasje).
- Spinn ned celler for 7 min ved 2500 x g.
(Etter dette trinnet supernatanten bør være lys grønn, hvis ikke, cellen brudd var ikke vellykket.) - Resuspender celler i H2-buffer (0,3 M sukrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) og pellet-celler i 10 minutter ved 32 800 x g.
- Resuspender celler i H3-buffer (1,8 M sukrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) og homogenisere pellet med en potter (ingen grønne partikler bør forbli ved slutten av denne arbeids trinn).
- Forbered thylakoid sukrose tetthetsgradienter i badekares (25 mm x 89 mm) ved å starte ved bunnen med et lag av 12 ml H3 buffer med celler, helle et midtre lag av 12 ml H4-buffer (1,3 M sukrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA ( pH 8,0)), og på toppen 12 ml H5-buffer (0,5 M sukrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Vær forsiktig når du helle gradienter og unngå blanding av de tre lagene.
- Balansere med H5 buffer og sentrifuger thylakoid sukrose tetthetsgradienter for en time ved 70 700 x g.
- Fjern thylakoid band fra thylakoid sukrose tetthetsgradienter og fortynne dem med et passende volum H6 buffer (5 mM HEPES (pH 7,5) 10 mM EDTA (pH 8,0)).
- Spinn ned celler på 37 900 xg i 20 min. Dersom pelleten ikke er stramt, er mer H6 buffer som kreves for dette sentrifugeringstrinnet.
- Resuspender thylakoids i et lite volum buffer H6 og fortsette med bestemmelse av klorofyllkonsentrasjonen.
4. Bestemmelse av klorofyll Konsentrasjon 31
- Bestemmelsen av klorofyll mengde er utført med 80% aceton.
- Bland 995 mL 80% aceton og 5 mL av thylakoids i H6 buffer (fortynning 1:200).
- Vortex i flere sekunder til ingen grønne partikler forbli og deretter spinne ned på 14,1 xg i 5 min.
- Ta supernatanten og måle utryddelse på 663,6 og 646,6 nm og 750 nm, henholdsvis.
- Beregn klorofyll mengden ved hjelp av følgende formel:
- C CHL en [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6 til 0,00255 * E 646,6) * fortynningsfaktor
- C CHL b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6 til 0,00491 * E 663,6) * fortynningsfaktor
- C CHL [mg / ml] = C CHL en + C CHL b
5. Lasting av Photo Sukroseestere tetthetsgradienter
- Beregn mengder thylakoids, β-DM og H6 buffer som er nødvendigfor hver gradient:
- Hver gradient skal være lastet med et samlet volum på 700 mL med 0,8 mg / ml klorofyll i 0,9% β-DM (oppløse β-DM i H 2 O), fylle de resterende volum med H6 buffer.
- For solubilisering forberede ulike porsjoner med thylakoids, β-DM og H6 buffer for hver gradient.
- La prøvene for 20 min på isen med jevne miksing (invertere) med få minutters mellomrom (solubilization trinn).
- Sentrifuger ved maksimal hastighet (14.000 x g) i 10 min ved 4 ° C.
(Etter sentrifugering, bør pelleten være liten og hvitaktig, mens supernatanten er mørkegrønn.) - Laste supernatanten på graderinger.
- Balansere med H6 buffer og spinne ved hjelp ultrasentrifuge på 134 470 xg over natten (14 timer) ved 4 ° C.
(Vær oppmerksom på at en vellykket separasjon av foto komplekser ved hjelp photo sukrose tetthetsgradienter som presenteres i denne protokollen er kun oppnås når using fersk isolert thylakoids, siden en prediksjon for solubilisering og komplekse separasjon er vanskelig å gjøre når du arbeider med thylakoid membraner som har vært frosset før.)
6. Fraksjonering av Photo Sukroseestere tetthetsgradienter
- Ta bilder av gradienter.
- Punktere et hull i bunnen av røret ved hjelp av en nål og fraksjonerer gradienter i 500 mL rør. Alternativt kan fraksjonering også utføres ved hjelp av en 96-brønns plate (mikroplate).
- Ved bruk av en mikroplate, bestemme absorbansen til de forskjellige graderte fraksjoner ved 675 nm.
(På dette trinnet kan prøvene lagret ved -80 ° C i noen få uker.)
7. SDS-PAGE og immunodeteksjonsprosedyren
(Vær oppmerksom på at kun for sammenligning av WT vs ΔPSI har blitt utført en western blot analyse for å velge de fraksjoner for påfølgende MS-analyse. For eksperimentet WT vs pgrl1 frhandlinger ble utvalgt ved hjelp av absorbansen i de forskjellige fraksjoner.)
- Separate 30 ul av hver fraksjon fra WT og ΔPSI gradient på en 13% SDS polyakrylamid gel 32.
- Utfør western blot analyse 33 ved hjelp av følgende antistoffer: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, PSI subenheten PSAD 32 og PSII kjerne subenheten D1. Bruk alle antistoffer med en 1:1.000 fortynning av (for forbedret kjemiluminescens deteksjon teknikk), med unntak av D1-antistoff, som skal brukes med en fortynning på 1:10.000.
- Basert på resultatene av immunodeteksjonsprosedyren, ta peak fraksjoner av ANR1, PGRL1 og PSAD for WT og ΔPSI (her fraksjoner 6 og 13, henholdsvis), bland 30 pl av fraksjon 6 fra WT og ΔPSI og gjøre det samme med fraksjon 13 fra begge preparater og skille dem igjen på en 13% SDS polyakrylamid gel.
- For kvantitativ sammenligning av WT vs pgrl1 ta CEF-supercomplex fraksjoner som bestemt ved å måle absorbans i de forskjellige graderte fraksjoner og bland 30 ul av begge prøver, etterfulgt av separering på en 13% SDS polyakrylamid gel.
- Flekk proteinbåndene med Coomassie-løsning (85% fosforsyre, 757 mM ammoniumsulfat, 1,2% Coomassie brilliant blue, 20% metanol) i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- For å fjerne uspesifikk farging, vaske flere ganger med DDH 2 O.
- Skjær banene inn en mm gel stykker og fortsette med i-gel fordøyelsen.
(Alternativt kan prøvene tørket noen minutter i et vakuum sentrifuge og lagres for et par uker før du fortsetter med den i-gel fordøyelsen.)
8. I-gel Fordøyelse (Modifisert fra Shevchenko et al. 35)
Vær oppmerksom på å forberede alle buffere og løsninger kort tid før bruk og ta glassflasker for buffere som inneholder acetonitril (ACN). <br /> OBS! Arbeide med ACN kan være skadelig, mer informasjon kan lastes ned fra: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).
- Vask gel stykker med> 10 volumer DDH 2 O (~ 200 ul) i 30 sek.
- Inkuber gel stykker med 300 pl av 25 mM NH 4 HCO 3 til 15 minutter med risting, fjerner væske.
- Inkuber gel stykker med 300 pl av 25 mM NH 4 HCO 3 i 50% ACN (forbereder ved å blande ACN og 50 mM NH 4 HCO 3 i et forhold på 1:1) i 15 minutter med risting, fjerner væske.
- Hvis gel-bitene er fremdeles blå, gjenta NH 4 HCO 3 og 4 NH HCO 3 / ACN vasker inntil det meste av de Coomassie er fjernet.
(Selv om hoveddelen av Coomassie farging skal fjernes, er det ikke nødvendig å destain gel stykker helt.) - Tilsett 100 ul av ACN å dehydratisere gelen stykker for 5 min. Gel brikkene skal krympe ennd ser helt hvit.
- Fjern så mye ACN som mulig og fortsette med trypsin fordøyelsen. Alternativt kan prøvene lagres ved -20 ° C i noen få uker.
- Legg 10-20 mL per band av 20 ng / mL trypsin i 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (fersk utvannet), holde prøvene på is.
- Etter 30 min, sjekk om all oppløsning ble absorbert og tilsett mer trypsin buffer, om nødvendig. Gel brikkene skal være helt dekket med trypsin buffer. Hold prøvene på is.
- La gel stykker i ytterligere 90 minutter på isen for å mette dem med trypsin.
(Kritisk trinn: utbyttet av tryptic peptider øker betraktelig med økende inkubasjonstider på is, sannsynligvis på grunn av langsom diffusjon av enzymet inn i polyakrylamid matriks Det er nødvendig å ha et lite overskudd av oppløsning som dekker gel-bitene for å unngå at stykkene. faller tørr under overnatter inkubasjon.) - Fordøy ved 37 ° C i 4-6 timer. For eksperimenter som krevermaksimal peptid utvinning, fordøye over natten.
- Etter fordøyelsen spinne ned kondensert buffer.
- Sonicate rør i 5 minutter for å eluere peptidene og sentrifuger på nytt.
- Samle supernatanten og overføre den til et nytt rør.
- Utfør peptid ekstraksjon med 80 ul av 30% ACN / 1% maursyre (FA) i et sonisk bad i 15 min.
- Utføre ekstraksjon med 80 ul av 30% ACN / 1% FA i et sonisk bad i 15 min.
- Utføre ekstraksjon med 80 ul av 70% ACN / 1% FA i et sonisk bad i 15 min.
- Sentrifuger igjen og basseng supernatant med tidligere eluatet.
(FA tjener til å inaktivere trypsin og øke peptid løselighet.) - Tørr peptid-løsning helt i en vakuumsentrifuge.
(På dette tidspunkt prøvene kan lagres i noen få uker i -20 ° C før videre med MS-analyse.) - Resuspender peptider i 6 mL MS-buffer (5% ACN, 0,1 v / v FA, vann) og sonicate i 2-5 min.
- Sentrifuger prøvene på maximum hastighet i 5 min for å fjerne partikkelformet materiale.
- Bruk 4 pl av supernatanten for massespektrometrisk analyse.
9. MS-Data Analysis med "Proteomatic"
Dataanalysen ble utført med åpen kildekode "Proteomatic" (som kan lastes ned på http://www.proteomatic.org/), en plattform som tillater generering og gjennomføring av MS / MS data evaluerings rørledninger, ved å bruke gratis og kommersiell programvare 36. Kort fortalt blir innstillingene beskrevet nedenfor, og mer detaljert informasjon finnes i 6,26.
- Identifisering og kvantifisering av MS-data
Identifikasjon og kvantifisering av proteiner fra eksperimenter WT g. ΔPSI ble gjort med OMSSA (versjon 2.1.4 37) og qTrace 26, henholdsvis, som beskrevet 6,26. For MS-analyse av data fra eksperimentet WT g. pgrl1 følgende oppdaterte rørledningen ble anvendt:- I tillegg til OMSSA 37, ble proteinene også identifisert med X! Tandem (versjon 2013.02.01 38). Begge algoritmene ble anvendt ved å søke mot en database generert ved å kombinere JGI Chlamydomonas genet modell database versjon 4.3 med Augustus database versjon 10.2, samt mot en sluttet database med NCBI databaser BK000554.2 og NC_001638.1.
- MS 2 identifikasjon av peptider ble utført ved hjelp av en target-lokke tilnærming 39.. En lokkedue for hvert protein ble opprettet av tilfeldig stokking tryptic peptider og samtidig beholde den redundans av nonproteotypic peptider.
- Statistiske validering av peptidene ble utført med programvaren qvality (versjon 0.3.3 40) ved hjelp av en bakre feilsannsynlighet (PEP) terskel på mindre enn 0,01, og resultatene ble filtrert med en forløper masse toleranse på 5 ppm.
- Peptider fra OMSSA og X! Tandem går var sluttet og kvantifisert med qTrace
For å undersøke om protein ratio signifikant annerledes mot hverandre i mixed CEF-supercomplex fraksjoner fra WT og pgrl1, ble statistisk analyse utført anvende programvaren SPSS (versjon 21). De subenheter av cytokrom-b 6 / f-komplekset, ble testet mot hverandre, så vel som proteiner FNR, FTSH2 og HCF136 mot PSI-subenheter. Peptid prosenter av hver skanning teller per protein av alle fire gjentak ble testet for normalfordeling med Shapiro-Wilks test. Siden peptid populasjoner ikke var normalfordelt (p <0,001), ble parametriske statistikk utført. Først ble Kruskal-Wallis-test anvendt vurdere en signifikant divergens mellom gruppene. Bare hvis denne testen spådd signifikant forskjells mellom gruppene ble videre analyse utføres for å forutsi signifikante forskjeller mellom to uavhengige grupper med Mann-Whitney-U Test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den introduserte kvantitativ proteomikk tilnærming har som mål å karakterisere sammensetningen av multiprotein komplekser i thylakoid membraner demonstrert av den komparative analysen av CEF-supercomplex komponenter i genetisk forskjellig C. reinhardtii stammer. Den beskrevne metoden har med hell blitt brukt av Terashima et al. 6 og omfatter isolering av thylakoid membraner fra anaerobe vokst kulturer, etterfulgt av vaskemiddel solubilization. Deretter blir prøvene påsatt på en sukrose-densitets-gradient basert på lik mengde klorofyll-og-komplekser blir fraksjonert ved ultrasentrifugering. For den kvantitative MS-analyse like volum av to graderte fraksjoner fra forskjellige stammer blandes og forhold analysert (fig. 1). De presenterte resultatene omfatter sammenligning av CEF-supercomplex brøkdel mellom WT cw15-arg7 og ΔPSI samt WT cc124 og pgrl1, henholdsvis.
(figurene 2A og 2B) ble valgt til 6. Figur 3 viser den relative proteinforhold som WT / ΔPSI (14 N / 15 N) for flere PSI kjerne og LHCI proteiner (lette høsting proteiner av PSI også benevnt som Lhca proteiner) samt for proteiner som er tildelt med CEF-supercomplex. Som forventet, er PSI kjernen proteiner bare funnet i WT prøver demonstrert av uendelig forholdstall i begge fraksjoner. Lhca2 og Lhca9 er anriket i WT, mens Lhca4 -6 og -8 vise en annen regulering i begge fraksjoner. Det er viktig å merke seg at LHCI proteiner er syntetisert og akkumulert normalt i ΔPSI mutant 41.. Polypeptidet sammenligning av PSI-LHCIkompleks fra C. reinhardtii WT med LHCI komplekset av ΔPSI mutant viste at størstedelen av Lhca2, -3 og -9 synes å være bare svakt bundet til LHCI og dessuten at nærværet av PSI-kjernen som er nødvendig for en stabil binding. I motsetning til dette Lhca1, -4, -6, -7, -8 og danne et kompleks uavhengig av monteringen av PSI 14, noe som kan forklare de forskjellige regulering av Lhca4, -6 og -8 i foreliggende eksperiment.
For proteiner for å være tilordnet med CEF-supercomplex, kan det skilles mellom de som er mer tallrike i WT fraksjon 6 og fraksjon 13 av den ΔPSI mutant, som viser en sterk PSI-avhengig migrering vises ved forholdstall som er høyere enn en for fraksjon 6 og forholdstall lavere enn ett eller ikke oppdaget i fraksjon 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, PFD, HCF136 og cyt f) og de viser ikke så sterk, men likevel en PSI-avhengige lokalisering (FNR, FTSH1, FTSH2, og ATPC ).
Med dette eksperimentet Terashima et al. 6. viste en PSI avhengig vandringsadferd for ANR1 og CAS (figurene 2A-D og figur 3), for derved å avdekke dem som nye proteiner av CEF-supercomplex, som tidligere ikke er identifisert 7.. Resultatene av MS-analyse ble også bekreftet ved immuno-deteksjons og støttet ved anvendelse av revers genetikk for å bekrefte en funksjonell rolle for disse proteinene for CEF in vivo 6.. Dessuten støtter denne sammenlignende MS-metode sterkt resultatene fra tidligere undersøkelser, ved å bekrefte proteiner som allerede er blitt demonstrert å være en del av CEF-supercomplex eksempel PGRL1, cyt f og FNR 7, samt Lhcbm5 7,9 vise et PSI-avhengig lokalisering i sukrose-densitets-gradient, som er sammenlignbart med ANR1 og CAS.
Sammenligningen av fraksjon 6 og 13 av anr1 og ΔPSI bruker samme approach (se Figur S8 6) viste en lignende sammensetning av CEF-supercomplex i anr1 og den samme trenden for proteinene ANR1, CAS og PGRL1 som åpenbart i forsøket WT vs ΔPSI. Spesielt, selv om proteinandel på ANR1 i fraksjon 6 (anr1 g. ΔPSI) er sammenlignbart med forholdet av WT g. ΔPSI eksperiment, mengden CAS og PGRL1 ser ut til å være høyere i det tidligere eksperiment, og kan være et resultat av kompensere for ned-regulering av ANR1 seks.
Dessuten berikelse av ANR1 og CAS i CEF-supercomplex brøkdel man kunne også utlede PSI-avhengige migrering av flere andre proteiner fra dette eksperimentet. Dette er to ATP-avhengige metalloproteaser FTSH1 og FTSH2 som spiller en fundamental rolle i nedbrytningen av PSII reaksjon sentrum protein D1 i kloroplaster 42,43, en prefoldin-domene som inneholder protein, den HCF136, som er en avgjørende faktor for stabiliteten eller assembly of PSII 44 og γ subenhet av ATPase. Mens for den senere, gjør forholdstall mellom brøk 6 og 13 ikke viser en så klar forskjell, videre forsøk må gjennomføres for å verifisere om de andre proteiner kan også være kandidater av CEF-supercomplex.
Som et bevis på konseptet eksperiment for denne komparativ tilnærming, analyserte vi CEF-supercomplex sammensetning i to stammer, som begge har PSI, slik at dannelsen av dette komplekset. De respektive fraksjoner ble valgt ut på grunnlag av absorbansen målinger av de fraksjonerte gradienter. Figurene 4A og 4B viser resultatene for kvantitativ sammenligning mellom WT og en pgrl1 knock-out belastning. Det bør påpekes at ANR1 og CAS ikke er bemerkelsesverdig endret mellom WT og pgrl1. Interessant, synes HCF136 å bli beriket i WT, mens FTSH2 ser ut til å bli beriket i pgrl1. En statistisk significant forskjell for begge nevnte proteiner til alle PSI-subenheter (inkludert LHCI proteiner) kunne bekreftes.
Videre cytokrom b 6 / f komplekse subenheter Cyt f og PETO ble vist å være betydelig annerledes cyt b 6, cyt b 6 / f IV og PETC, henholdsvis. Spesielt synes cyt f å være oppregulert i pgrl1, mens cyt b 6 og cyt b 6 / f IV er litt nedregulert, selv om reguleringen av cyt f syntese innebærer trolig cyt b 6 og cyt b 6 / f IV 45 . Atom-kodet PETC, som også er kjent som Rieske protein viser en tilsvarende regulering som cyt b 6 og cyt b 6 / f IV (dvs. en ned-regulering i pgrl1). Det er slående som reduksjon eller fravær av Rieske proteinet fremdeles føre til opphopning av OTHeh cyt b 6 / f subenheter til ~ 60% av WT nivå i C. reinhardtii 46. I tillegg er det viktig å merke seg den opp-regulering av PETO i pgrl1, siden dette løst bundet subenheten ble vist å akkumulere til reduserte nivåer i C. reinhardtii mutanter som mangler enten cyt b 6, cyt b 6 / f IV eller PETC 47, som er mindre rik på pgrl1 sammenlignet med WT i foreliggende eksperiment.
Figur 1. Experimental arbeidsflyt som avbildet for WT og ΔPSI. Celler blir metabolsk merket i minst fire generasjoner, er anaerobe forhold indusert av argongjennomspyling i 4 timer og thylakoid membraner blir isolert gjennom gradient separasjon. Den isolated membraner er solubilisert ved hjelp av β-DM, påsatt på en sukrose-densitets-gradient (for begge stammer like mengder av klorofyll er anvendt i dette trinnet) og sentrifugert over natten. Gradienten fraksjonene blir samlet og analysert ved SDS-PAGE, så vel som immuno-deteksjons for å bestemme fordelingen av proteinene i løpet av gradienten. For å identifisere proteiner med et PSI-avhengige migrasjon, like volum av WT CEF-supercomplex fraksjon (fraksjon nummer 6) og det tilsvarende 15 N-merket fraksjon fra ΔPSI stamme ble blandet og forhold analysert. Det samme ble gjort med toppfraksjonen av ANR1 i ΔPSI stamme (fraksjon nummer 13). For den sammenlignende, kvantitativ MS-metode, ble det blandede proteinprøver separert ved hjelp av SDS-PAGE, proteinbånd ble farget med Coomassie blue-løsning, etterfulgt av in-gel fordøyelse før MS-analyse. for å vise større image.
Figur 2. ANR1 og CAS migrere til de lavere tetthet regioner i ΔPSI belastning. A:. Sukroseestere tetthetsgradienter av WT og ΔPSI thylakoids isolert fra anaerobe forhold ble delt inn i 20 fraksjoner B: immunodeteksjonsprosedyren av ANR1 i 20 fraksjoner av gradient fra WT og ΔPSI. Mens dette proteinet er lokalisert til høyere tetthet regionen i WT (brøkdel 6) det er opp-forskjøvet til lavere tetthet regioner i ΔPSI belastning (fraksjon 13) C:. Sukroseestere tetthetsgradienter av WT og ΔPSI thylakoids isolert fra anaerobe forhold ble delt inn i 27 fraksjoner D:. immunodeteksjonsprosedyren av CAS i 27 fraksjoner av gradient fra WT og ΔPSI. Selv om dette proteinet er lokalisert to høyere tetthet regionen i WT (topp rundt brøkdel 7) det er opp-forskjøvet til lavere tetthet regioner i ΔPSI belastning (topp rundt brøkdel 19). (Dette tallet har blitt forandret fra Terashima et al. 6). Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Relativ protein forholdstall bestemmes i fraksjon 6 og 13 fra WT og ΔPSI ved kvantitativ massespektrometri. Fraksjonene 6 og 13 fra WT er sammenlignet med de respektive fraksjoner fra 15 N-merket ΔPSI belastning. De relative protein forholdstall som representerer to biologiske replikater og tre MS-løper er avbildet som WT / ΔPSI (14N / 15 N) for både analyserte fraksjoner, med unntak av cyt f, som først ble funnet i fraksjon 6.. Dette sammen kvantifisering avslører at ANR1 og CAS viser en PSI-avhengige migrasjon i sukrose tettshetsgradient (dette tallet har blitt forandret fra Terashima et al. 6). Klikk her for å se større bilde.
Figur 4 Relativ protein forholdstall fastsatt i CEF-supercomplex brøkdel av WT og pgrl1 av kvantitative massespektrometri.. A: sukrose tetthetsgradienter av WT og pgrl1 thylakoids isolert fra anaerobe forhold B:. Relative protein forholdstall between CEF-supercomplex brøkdel stammer fra fire forskjellige gjentak avbildet som WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). I dette eksperimentet ANR1 og CAS ikke er bemerkelsesverdig endret, mens FTSH2 og HCF136 vise betydelige forskjeller i forhold til alle PSI-subenheter (p ≤ 0.001 som angitt med *** i rødt; HCF136: 1900 <U <58127; FTSH2: 2117 <U <164197). I tillegg er cyt b 6 / f komplekse subenheter Cyt f og PETO ble vist seg å være vesentlig forskjellig fra cyt b 6, cyt b 6 / f IV og PETC, henholdsvis (p ≤ 0.001 som indikert av *** i blått; cyt f : 2684 <U <11535; PETO:. 4700 <U <23663) Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike kvantitative proteomikk studier ved hjelp av stabile isotoper merking er publisert i de siste årene. I disse eksperimentene vanligvis to forskjellige prøver sammenlignes, hvorav en prøve merkes med en stabil isotop. Deretter proteiner eller peptider fra de to prøver er kombinert i et likt forhold, og viderebehandles sammen 48. Slike studier ofte har tenkt å sammenligne definerte isolerte cellene (f.eks kloroplaster, mitokondrier, eller thylakoid membraner) eksponert for ulike stressforhold 26,34,49 å undersøke opp-eller nedregulering av spesifikke proteiner. Den beskrevne sammenlignende, kvantitativ proteomikk metode tar sikte på å analysere sammensetningen av multiprotein komplekser i thylakoid membranen og, i motsetning til de tidligere nevnte studier, er basert på blanding av det samme volumet av prøvene etter at sukrose-densitets-separasjon av thylakoid membraner som er lagt på tilsvarklorofyllkonsentrasjon før ultracentrifugasjon. Denne metoden ble effektivt anvendt ved Terashima et al. 6. som forhold analysert sammensetningen av CEF-supercomplex isolert fra et WT og en ΔPSI belastning for å identifisere proteiner som migrerer PSI avhengig i en sukrose-densitets-gradient.
Oppnåelse av denne strategien er påvist ved det faktum at MS-resultatene er videre støttet av immuno-deteksjons. I tillegg Terashima et al. Kunne bekrefte funnene fra tidligere studier (dvs. identifisering og PSI avhengige vandring av proteiner som allerede er beskrevet til å være en del av CEF-supercomplex, slik som PGRL1, FNR, og cyt f 7). Identifiseringen av ANR1 og CAS som nye komponenter i CEF-maskiner seks avslører denne tilnærmingen som en meget kraftig og effektivt verktøy. Spesielt, den isolerte CEF-supercomplex oppviste in vitro-aktivitet, for derved å demonstrere vellykket rensing av et funkNASJONAL multiprotein kompleks seks. Anvendeligheten av denne tilnærmingen også for to stammer av som begge danner en CEF-supercomplex er demonstrert av sammenligningen mellom WT og pgrl1.
Generelt, kan denne metoden brukes til å kartlegge komplekse komposisjoner i ulike stammer eller forhold som åpenbart av identifisering av tidligere uidentifiserte proteiner som er copurified med CEF-supercomplex fraksjon (dvs. berikelse av FTSH1, FTSH2, PFD, og HCF136 i CEF-supercomplex fraksjon). Hvorvidt disse proteinene er mulige nye kandidater for dette komplekset og for å forbedre forståelsen for den annen regulering av FTHS2, HCF136, så vel som for cyt b 6 / f-subenheter som vist ved sammenligning av WT og pgrl1, videre forsøk er nødvendig.
I tillegg til de beskrevne fordeler ved denne tilnærmingen er det bryteal kritiske tiltak som må vurderes nøye når du arbeider med denne protokollen: Å bryte av celler med forstøveren er det første viktige skrittet. Hvis åpningen av cellene ikke blir utført på en skikkelig måte, vil utbyttet av isolerte thylakoids være ganske lavt, og kan resultere i nesten ingen påvisning av CEF-supercomplex etter over-natten sentrifugering. Den vellykkede avbrudd av celler kan utledes fra det lysegrønne fargen supernatanten etter sentrifugering. I kontrast, dersom trykket i løpet av celle-nedbrytning er for høy, kan deler av supercomplex oppløsning og viktige kofaktorer kan gå tapt. Et annet skritt påvirke utbyttet av thylakoids er både oppvirvling av celler med en keramiker. Dette må utføres omhyggelig, og ved slutten av dette trinn bare få grønne partiklene skal forbli. Videre, for fremstilling av sukrose tetthetsgradienter dagen før så vel som for oppløseliggjøring av membran-komplekser, er det svært viktig ånettopp følge denne protokollen i form av β-DM konsentrasjon, siden dette er avgjørende for å få fullt oppløseliggjorte thylakoids 50 og dermed også for rensing av CEF-supercomplex. Den oppløseliggjøring trinn har blitt utført dersom en liten, hvitaktig pellet blir observert etter den etterfølgende sentrifugeringstrinnet. Et annet viktig punkt som må nevnes her er tidspunktet for over-natten-ultrasentrifugering. De sukrose tetthetsgradienter bør sentrifugeres for minst tolv timer for å oppnå fullstendig separasjon av de foto komplekser.
Selv om protokollen er demonstrert ved hjelp av C. reinhardtii for den komparative analysen av CEF-supercomplex sammensetning i to genetisk forskjellige stammer, er det lett å tilpasse også til et bredt spekter av andre spørsmål, for eksempel sammenlignende analyser av multiprotein kompleks sammensetning isolert fra distinkt miljø / eksperimentellbetingelser eller ved hjelp av andre typer fraksjonering. De eneste krav ved denne tilnærmingen er at modellorganisme kan dyrkes i cellekultur, er i stand til å bruke ammonium som nitrogenkilde og proteinkomplekser kan bli separert ved sukrose tetthetsgradienter, viser en bred anvendelse av denne metoden. For fremtidig anvendelse av denne tilnærmingen SDS-PAGE fraksjonering av de blandede 14 N / 15 N prøver og etterfølgende in-gel fordøyelse kan bli erstattet ved å anvende filter-hjulpet prøve (FASP)-metoden preparat. Denne metoden omfatter anvendelsen av sterke vaskemidler for solubilisering sikte på å "rense opp" proteomet før fordøyelse og for å oppnå rensede peptider, forebygge ulempene ved den in-gel fordøyelsen tilnærming som kan hemme peptid utvinning, selv om man må tenke på at in-gel fordøyelse er beskrevet til å være robust i forhold til forurensing som kan forstyrre fordøyelsen 51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
MH erkjenner støtte fra "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Forfatter bidrag: MH designet forskning; KT, JS og MT utført forskning og analysert dataene, KT og MH skrev avisen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
