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基于15N代谢标记与定量质谱法的多蛋白复合物比较分析新方法

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DOI：

10.3791/51103

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2014年3月13日

 ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

本文内容

摘要

所述的比较性定量蛋白质组学方法旨在深入了解不同条件下多蛋白复合物的组成 ，并通过比较遗传背景不同的菌株来加以示范。在定量分析中，将蔗糖密度梯度离心中不同组分的等体积样品混合后，通过质谱进行分析。

摘要

所介绍的方案为分析类囊体膜中多蛋白复合物提供了工具，可通过揭示不同条件下复合物组成的特征而实现。本方案通过比较负责环式电子传递（CEF）的蛋白复合物在不同条件下的组成，展示了该方法的应用。 莱茵衣藻，从遗传背景不同的菌株中分离得到。该流程包括类囊体膜的分离，随后通过蔗糖密度梯度离心将膜分离为多蛋白复合物，再进行SDS-PAGE、免疫检测以及基于差异代谢标记的比较定量质谱分析（MS）14N/15分析菌株的N）。在叶绿素浓度相等的条件下，将去垢剂溶解的类囊体膜样品加载至蔗糖密度梯度中。经过超速离心后，将梯度分离为多个组分，并按相等体积进行质谱分析。该方法可用于研究各梯度组分中的蛋白组成，同时进一步分析不同蛋白质的迁移行为，尤其关注ANR1、CAS和PGRL1。此外，本方法通过免疫印迹实验验证结果，并支持先前研究的发现（鉴定出此前已被描述为环式电子传递超级复合物（CEF-supercomplex）组分的蛋白质，如PGRL1、FNR和cyt，且其迁移行为依赖于PSI） f值得注意的是，该方法适用于解决一系列广泛的问题，本方案可被采用并应用于这些研究领域 例如 用于比较分析从不同环境条件下分离的多蛋白复合物的组成。

引言

植物和藻类叶绿体类囊体膜中的光合作用过程可在线性模式和循环模式下运行。在线性电子传递（LEF）过程中，光系统I（PSI）和光系统 II (PSII) 和细胞色素 b6/f 最终将电子从水传递给NADP+1，从而生成 NADPH 和 ATP2相比之下，环式电子传递（CEF）已知可在多种环境条件下被诱导，例如状态2 3 和厌氧条件4，通过将电子重新注入电子传递链，导致被氧化的光系统I（PSI）再次被还原。该过程可发生在细胞色素的基质侧 b6/f 复合物1 或在质体醌库5 并生成ATP，但不生成NADPH2.

本方案旨在展示一种基于质谱（MS）的方法，用于对Chlamydomonas reinhardtii叶绿体类囊体膜中的多蛋白复合物进行比较性定量分析，以深入了解这些复合物在不同条件下的组成（以比较遗传背景不同的藻株为例）。该方法曾由Terashima et al.于2012年发表，揭示了在C. reinhardtii中，由CAS、ANR1和PGRL1蛋白组成的多蛋白复合物介导的Ca2+依赖性环式电子传递（CEF）调控机制6。本文将以两种遗传背景不同的藻株中CEF超复合物组成的比较分析为例，说明该实验流程，其中利用重氮同位素（15N）标记其中一种藻株。简而言之，该方案包括类囊体膜的制备，随后使用去垢剂溶解并经蔗糖密度梯度离心对光合复合物进行分级分离。梯度分离后，将两个藻株的相应组分按等体积混合，经SDS-PAGE分离后进行胶内酶解，再进行定量质谱分析。

如上所述，不同环境条件下均可诱导环式电子传递（CEF），2010年的一项研究展示了从状态转变中分离出功能性CEF超复合物的方法 2个锁定的细胞 C. reinhardtii7，该步骤通过在超速离心过程中将溶解的类囊体膜在蔗糖密度梯度中分离而完成。与Iwai不同 等7, 本方案描述了从厌氧培养的细胞中分离CEF超复合物的方法 C. reinhardtii 通过采用另一种方法进行培养。该方法包括对类囊体分离方案的修改，以及在溶解步骤和通过超速离心分离蛋白质复合物方面的差异。在本方案中，类囊体膜的分离采用 Chua 和 Bennoun 所发表的方法8，而用于制备类囊体的缓冲液由Iwai等人使用 等 含有 25 mM Mes、0.33 M 蔗糖、5 mM MgCl2，1.5 mM NaCl（pH 6.5），具体方法如下所述9. 使用0.7-0.8%去垢剂（n-tridecyl-β-D-maltoside）进行溶解处理，持续30分钟 在岩井及其同事的研究中，样品在冰上处理的时间更长，而本文所述的溶解方法则采用0.9%的去垢剂（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（β-DM）），仅需在冰上处理20分钟。两组实验均使用每毫升含0.8 mg叶绿素的样品量进行相应去垢剂的溶解处理。对于从溶解的类囊体膜中分离光合复合物，岩井等人 等 应用蔗糖浓度介于0.1–1.3之间 M，而本方案的作者使用的浓度范围为 0.4–1.3 M。最后一个差异是离心速度，相较于先前的文献报道较低。

使用非离子型去垢剂溶解类囊体膜，随后进行蔗糖密度梯度分离，该方法自20世纪80年代至今已被广泛应用于多项研究中7, 9-14 蛋白质代谢标记技术也是蛋白质组学领域中广泛应用的一种方法。所述方法采用了 15通过在仅含重氮（以重氮形式存在）作为唯一氮源的培养基中培养，对两种比较菌株中的一种进行氮代谢标记 15N NH4Cl，它会掺入所有氨基酸中，导致肽段的质量偏移，偏移程度取决于肽段的氨基酸序列。当分析一种混合物时 14氮和 15在一次质谱运行中，该质量偏移可用于确定每种肽段的样品来源，并可计算肽段的相对丰度，从而代表相应蛋白质的相对丰度15.

大量关于定量蛋白质组学的研究 C. reinhardtii 可获取，用于比较特定量的蛋白质，以分析不同实验条件下蛋白质组的变化（例如 由于营养变化引起的蛋白质组改变16-19 或光胁迫20,21与这些研究相比，本研究采用等体积样品混合后进行分析。该设置不仅能够研究蛋白质在梯度中的迁移行为，还可分析不同菌株中各类复合物的组成。

该方法将主要围绕三种蛋白质进行阐述：第一个候选蛋白是定位于叶绿体的钙感应蛋白CAS，已被证明参与光适应过程 C. reinhardtii22钙被认为是一种重要的信号离子，参与由不同生物和非生物胁迫激活的信号通路，最终导致基因表达和细胞生理状态的改变。23 并且有研究提出叶绿体可能参与细胞Ca2+ 通过CAS蛋白的信号传导22,24,25第二种蛋白是 ANR1（厌氧响应1） 6），一种在无氧生长条件下被证实可被诱导的蛋白质 C. reinhardtii26值得注意的是，CAS 和 ANR1 均被鉴定为 CEF 超级复合物的亚基，并且通过反向遗传学方法证明，这两种蛋白质在功能上均参与 CEF 体内6，支持其作为该蛋白质复合物功能亚基的作用。第三种蛋白是类囊体蛋白PGR5-Like 1（PGRL1），已被证明参与环式电子传递（CEF） 衣藻4,27  以及在 拟南芥5,28  并且也在岩井的工作中被鉴定出来 等7 

本方法将通过展示两个不同实验的结果来呈现：野生型（WT）与ΔPSI29菌株的比较，后者表现为缺失编码光系统I一个必需亚基的psab基因，该亚基也是环式电子传递超级复合物（CEF-supercomplex）的组成部分；以及WT与pgrl1基因敲除菌株4的比较。在每个实验中，均比较了15N标记菌株与14N标记菌株之间CEF-supercomplex的定量组成。

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方案

1. Chlamydomonas 的培养

  1. 本研究中使用的 C. reinhardtii 菌株包括：野生型 cc124、野生型 cw15-arg7（细胞壁缺陷型且为精氨酸营养缺陷型）、ΔPSI 突变株29 以及 pgrl1 基因敲除株4。
  2. 所有菌株均在 Tris-乙酸-磷酸盐（TAP）培养基30中，于 25 °C、持续光照强度为 20–50 µE/m2 sec 条件下，以 120 rpm 振荡培养。ΔPSI 菌株的培养瓶需用若干层纸巾包裹，使其光照强度低于<5 µE/m2 sec。
  3. 标记菌株（ΔPSI 和 WT cc124）的培养物中含有 7.5 mM 15N NH4Cl，而未标记菌株（WT cw15-arg7 和 pgrl1）的培养物中含有 7.5 mM 14N NH4Cl。细胞需至少生长四代以实现完全标记，并始终保持在指数生长期。
  4. 实验开始前一天，将细胞计数并稀释至每毫升 1 × 106 个细胞，每种菌株培养体积至少为 750 ml。

请注意，以下方案中描述了两种不连续的蔗糖密度梯度。光系统蔗糖密度梯度依据Takahashi et al.9的方法，用于在过夜离心过程中分离自分离并溶解的类囊体膜中的不同光合蛋白复合物，需在实验前一天制备（见方案2）；而类囊体蔗糖密度梯度8则应用于类囊体的分离程序中（见方案 3）。

2. 光系统蔗糖密度梯度的制备

  1. 制备梯度时需要三种储备液：
    1. 2 M 蔗糖
    2. 10% β-DM 溶于 H2O
    3. 0.5 M Tricine，pH 8.0（用 NaOH 调节）
  2. 使用上述储备液，配制以下溶液：
    浓度：1.3 M1.0 M0.85 M0.7 M0.65 M0.4 M
    2 M 蔗糖13 ml10 ml8.5 ml7 ml6.5 ml4 ml
    10% β-DM100 µl100 µl100 µl100 µl100 µl100 µl
    0.5 M Tricine200 µl200 µl200 µl200 µl200 µl200 µl
    H2O6.7 ml9.7 ml11.2 ml12.7 ml13.2 ml15.7 ml
  3. 使用 14 mm × 89 mm 离心管，并从最高蔗糖密度溶液开始，缓慢依次倒入较低密度的溶液，以形成梯度。
  4. 1.3 M 和 1.0 M 溶液各倒入 1 ml，其余溶液各倒入 2 ml。
  5. 将梯度在冷室中静置过夜。

3. 厌氧诱导及类囊体膜的分离8

  1. 在开始分离类囊体膜之前，通过通入氩气4小时以建立厌氧条件。可在培养烧瓶中通过玻璃移液管通入氩气，同时使用磁力搅拌子持续搅拌培养物。
  2. 首先通过在2,500 × g离心5分钟沉淀细胞，从而开始类囊体膜的分离，然后将细胞重悬于H1缓冲液（0.3 M蔗糖，25 mM HEPES（pH 7.5），5 mM MgCl₂）中2).
    （请注意，从分离类囊体膜开始，样品应始终保持在冰上以避免蛋白质降解，所有离心步骤均在4 °C下进行，强烈建议佩戴手套操作以避免角蛋白污染。）
  3. 2,500 × g 离心 5 分钟收集细胞，重悬于 H1 缓冲液中。
  4. 使用氮气压力为1,500 hPa的雾化器，将细胞通过两次，以破碎细胞（用于 无细胞壁的菌株仅传代一次。
  5. 以 2,500 × g 离心 7 分钟收集细胞。
    （此步骤后，上清液应呈浅绿色；若不是，则细胞破碎不成功。）
  6. 用 H2 缓冲液（0.3 M 蔗糖，5 mM HEPES（pH 7.5），10 mM EDTA（pH 8.0），在32,800 x g下离心10分钟以收集细胞沉淀。
  7. 用 H3 缓冲液（1.8 M 蔗糖，5 mM HEPES (pH 7.5)，10 mM EDTA (pH 8.0）并使用玻璃匀浆器进行匀浆，直至无绿色颗粒残留（此操作步骤结束时应无可见绿色颗粒）。
  8. 准备 类囊体蔗糖密度梯度 在试管（25 mm × 89 mm）中，先从底部加入含细胞的12 ml H3缓冲液作为底层，再小心倒入12 ml H4缓冲液形成中间层 缓冲液（1.3 M 蔗糖，5 mM HEPES (pH 7.5)，10 mM EDTA (pH 8.0)）上方覆盖12 ml H5缓冲液（0.5 M 蔗糖，5 mM HEPES (pH 7.5)，10 mM EDTA (pH 8.0)）。倾注梯度时需小心，避免三层液体混合。
  9. 用 H5 缓冲液平衡，并在 70,700 × g 条件下离心叶绿体类囊体蔗糖密度梯度 1 小时 x g.
  10. 从叶绿体类囊体蔗糖密度梯度中取出类囊体条带，并用适量体积的H6缓冲液（5 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM EDTA（pH 8.0)).
  11. 在 37,900 × g 下离心 20 分钟以沉淀细胞。如果沉淀不紧密，此离心步骤需要添加更多的 H6 缓冲液。
  12. 用少量 H6 缓冲液重悬类囊体，并进行叶绿素浓度测定。

4. 叶绿素浓度的测定31

  1. 叶绿素含量的测定使用80%丙酮进行。
  2. 将995 µl 80%丙酮与5 µl H6 缓冲液中的类囊体混合（稀释倍数为1:200）。
  3. 涡旋震荡数秒，直至无绿色颗粒残留，然后在14.1 ×g 下离心5分钟。
  4. 取上清液，分别测定663.6 nm和646.6 nm以及750 nm处的吸光度。
  5. 使用以下公式计算叶绿素含量：
    1. CChl a [mg/ml] = (0.01225 × E663.6 – 0.00255 × E646.6) × 稀释倍数
    2. CChl b [mg/ml] = (0.02031 × E646.6 – 0.00491 × E663.6) × 稀释倍数
    3. CChl [mg/ml] = CChl a + CChl b

5. 光系统蔗糖密度梯度的上样

  1. 计算每个梯度所需的类囊体、β-DM 和 H6 缓冲液的用量：
    1. 每个梯度的上样总体积应为 700 µl，叶绿素浓度为 0.8 mg/ml，溶于 0.9% β-DM（将 β-DM 溶于 H2O 中），其余体积用 H6 缓冲液补足。
  2. 为溶解步骤，为每个梯度分别准备含有类囊体、β-DM 和 H6 缓冲液的不同等分试样。
  3. 将样品置于冰上 20 分钟，每隔几分钟轻轻混匀（倒置混合）（溶解步骤）。
  4. 在 4 °C 下以最大速度（14,000 × g）离心 10 分钟。
    （离心后，沉淀应较小且呈白色，上清液呈深绿色。）
  5. 将上清液加样至梯度中。
  6. 用 H6 缓冲液平衡后，在 4 °C 下以 134,470 × g 超速离心过夜（14 小时）。
    （请注意，使用本方案中所述的光系统蔗糖密度梯度成功分离光合复合物，仅在使用新鲜制备的类囊体时才能实现，因为对于先前冷冻过的类囊体膜，其溶解及复合物分离效果难以预测。）

6. 光系统蔗糖密度梯度的组分分离

  1. 拍摄梯度图像。
  2. 用针头在离心管底部穿孔，并将梯度组分收集到 500 µl 的离心管中。或者，也可使用 96 孔板（微孔板）进行组分分离。
  3. 当使用微孔板时，在 675 nm 处测定不同梯度组分的吸光度。
    （此步骤样品可在 -80 °C 下保存数周。）

7. SDS-PAGE 和免疫检测

（请注意，仅针对WT与ΔPSI的比较，已进行蛋白质印迹分析以选择用于后续质谱分析的组分；而对于WT与pgrl1的实验，则根据各组分的吸光度来选择组分。）

  1. 在13% SDS聚丙烯酰胺凝胶上分别分离来自野生型（WT）和ΔPSI梯度的每种组分各30 µl32。
  2. 使用以下抗体进行蛋白质印迹分析33：ANR1（TEF7）26、PGRL134、CAS6、PSI亚基PSAD32以及PSII核心亚基D1。除D1抗体以1:10,000稀释外，其余抗体均以1:1,000稀释（用于增强化学发光检测技术）。
  3. 根据免疫检测结果，分别取野生型（WT）和ΔPSI中ANR1、PGRL1和PSAD的峰值组分（此处分别为第6和第13组分），将WT和ΔPSI的第6组分各取30 µl混合，并对第13组分进行同样操作，随后再次在13% SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。
  4. 为定量比较野生型（WT）与pgrl1突变体，根据各梯度组分的吸光度测定结果确定CEF超复合物组分，取两样品各30 µl混合后，在13% SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。
  5. 用考马斯亮蓝染色液（85%磷酸、757 mM硫酸铵、1.2%考马斯亮蓝、20%甲醇）在室温下染色2小时，或在4 °C过夜染色。
  6. 为去除非特异性染色，用ddH2O多次漂洗。
  7. 将泳道切成1 mm的凝胶小块，进行胶内酶解。
    （或者，样品可在真空离心浓缩仪中干燥数分钟，并在进行胶内酶解前保存数周。）

8. 胶内消化（修改自 Shevchenko et al.35）

请注意在使用前立即配制所有缓冲液和溶液，并使用玻璃瓶盛装含乙腈（ACN）的缓冲液。
警告！接触乙腈可能有害健康；更多信息可从以下网址下载：http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335（2013年）。

  1. 洗涤凝胶块 >10 体积 ddH₂O2O（约200 µl）持续30秒。
  2. 将凝胶条与 300 µl 25 mM NH4HCO3 振荡15分钟，弃去液体。
  3. 将凝胶小块与 300 µl 25 mM NH₄HCO₃ 溶液孵育4HCO3 在50%乙腈（通过混合乙腈与50 mM NH₄HCO₃溶液制备）中4HCO3 以1:1的比例振荡孵育15分钟，弃去液体。
  4. 如果凝胶碎片仍然呈蓝色，重复 NH4HCO3 和 NH4HCO3 用乙腈洗涤，直至大部分考马斯亮蓝被去除。
    （虽然应去除大部分考马斯亮蓝染色，但无需将凝胶小块完全脱色。）
  5. 加入100 µl乙腈（ACN）使凝胶条脱水5分钟。凝胶条应收缩并呈现完全白色。
  6. 尽可能去除乙腈（ACN），然后进行胰蛋白酶消化。或者，样品可在 -20 °C 保存数周。
  7. 每条带加入 10–20 µl 浓度为 20 ng/µl 的胰蛋白酶（溶于 10% 乙腈 / 25 mM 碳酸氢铵）4HCO3 （新鲜稀释后），将样品置于冰上保存。
  8. 30 分钟后检查溶液是否已完全吸收，必要时添加更多胰蛋白酶缓冲液。凝胶块应完全被胰蛋白酶缓冲液覆盖。将样品置于冰上保存。
  9. 将凝胶小块在冰上再放置90分钟，使其充分吸收胰蛋白酶。
    关键步骤：在冰上孵育时间越长，胰蛋白酶肽段的得率显著提高，可能是由于酶向聚丙烯酰胺凝胶基质中扩散较慢所致。过夜孵育期间，需确保胶块表面覆盖少量过量的溶液，以防止胶块干燥。
  10. 37 °C 下消化 4–6 小时。对于需要最大程度肽段回收的实验，可过夜消化。
  11. 消化后，离心沉淀浓缩缓冲液。
  12. 超声处理管子5分钟以洗脱肽段，然后再次离心。
  13. 收集上清液并转移至新管中。
  14. 在超声水浴中用80 µl含30%乙腈/1%甲酸（FA）的溶液进行肽段提取，持续15分钟。
  15. 在超声水浴中用80 µl含30%乙腈/1%甲酸的溶液提取15分钟。
  16. 在超声波浴中用80 µl的70%乙腈/1%甲酸提取15分钟。
  17. 再次离心，将上清液与先前的洗脱液合并。
    （FA 用于灭活胰蛋白酶并提高肽段的溶解度。）
  18. 在真空离心机中将肽溶液完全干燥。
    （此时样品可在 -20 °C 保存数周，之后再进行质谱分析。）
  19. 将肽重悬于6 µl质谱缓冲液（5%乙腈，0.1 v/v甲酸，水）中，超声处理2-5分钟。
  20. 以最大速度离心样品5分钟，以去除颗粒物。
  21. 使用4 µl上清液进行质谱分析。

9. 使用“Proteomatic”进行质谱数据分析

数据分析使用开源软件“Proteomatic”（可在 http://www.proteomatic.org/ 下载）进行，该平台通过结合免费和商业软件，支持生成和完成MS/MS数据评估流程36。简要设置如下所述，更详细的信息可参见文献6,26。

  1. 质谱数据的鉴定与定量
    对野生型（WT）与ΔPSI实验中的蛋白质进行鉴定和定量分别使用OMSSA（版本2.1.437）和qTrace26，具体方法如文献所述6,26。对于野生型（WT）与pgrl1突变体实验的质谱数据分析，采用以下更新后的分析流程：
    1. 除使用OMSSA37外，还使用X! Tandem（版本2013.02.0138）进行蛋白质鉴定。两种算法均通过搜索整合数据库实现，该数据库由JGI Chlamydomonas基因模型数据库（版本4.3）、AUGUSTUS数据库（版本10.2）以及NCBI数据库BK000554.2和NC_001638.1的联合数据库组成。
    2. 采用目标-诱饵（target-decoy）策略39进行MS2肽段鉴定。通过随机打乱每个蛋白质的胰蛋白酶肽段序列生成诱饵数据库，同时保留非特征性肽段的冗余性。
    3. 使用qvality软件（版本0.3.340）对肽段进行统计学验证，设定后验误差概率（PEP）阈值小于0.01，并以前体离子质量容差5 ppm为条件对结果进行筛选。
    4. 将OMSSA和X! Tandem鉴定出的肽段结果合并，并使用qTrace26进行定量，应用以下过滤步骤：要求具有MS2鉴定结果、添加蛋白质名称/分组信息，并要求包含成对的姐妹肽段（sister peptides）。

为了研究野生型（WT）和pgrl1突变体中混合CEF-超复合物组分内蛋白质比例是否存在显著差异，采用SPSS软件（版本21）进行了统计分析。细胞色素b6/f复合体的各个亚基之间相互比较，同时将FNR、FTSH2和HCF136蛋白与PSI亚基进行比较。对四次重复实验中每个蛋白质每次扫描得到的肽段比例数据，使用Shapiro-Wilk检验评估其是否符合正态分布。由于肽段数据总体不符合正态分布（p<0.001），因此采用非参数统计方法。首先应用Kruskal-Wallis检验判断各组间是否存在显著差异；只有当该检验显示组间存在显著差异时，才进一步采用Mann-Whitney U检验对两个独立组别之间的差异进行显著性分析。

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结果

所引入的定量蛋白质组学方法旨在通过比较遗传差异背景下环式电子传递超级复合物组分的分析，表征类囊体膜中多蛋白复合物的组成 C. reinhardtii 菌株。上述方法已由 Terashima 成功应用 等6 包括从厌氧培养的细胞中分离类囊体膜，随后用去垢剂进行溶解。然后根据等量叶绿素将样品上样至蔗糖密度梯度，并通过超速离心对蛋白复合物进行分级分离。在定量质谱分析中，将来自不同菌株的两份梯度组分等体积混合后进行比较分析。图1）。所示结果包括野生型（WT）之间CEF超复合物组分的比较 cw15-arg7 以及ΔPSI和野生型cc124 pgrl1分别。

为了比较野生型（WT）与ΔPSI突变株中CEF超复合体组分，选择免疫印迹分析显示的WT中的CEF超复合体组分所在的第6组分，以及ΔPSI突变株中ANR1峰值所在的第13组分（图2A和2B）进行分析6。图3

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讨论

近年来，已发表多项采用稳定同位素标记的定量蛋白质组学研究。在这些实验中，通常比较两种不同的样品，其中一种样品被稳定同位素标记。随后，将来自两种样品的蛋白质或肽段按等比例混合，并一同进行后续处理48。此类研究通常旨在比较在不同胁迫条件下处理的特定分离细胞组分（例如叶绿体、线粒体或类囊体膜），以分析特定蛋白质的上调或下调情况26,34,49。本文所述的比较性定量蛋白质组学方法旨在分析类囊体膜中多蛋白复合物的组成；与上述研究不同，该方法在超速离心前，先将等叶绿素浓度下加载的类囊体膜进行蔗糖密度梯度分离，然后混合相同体积的组分。Terashima et al.6已成功应用该方法，通过比较分析从野生型（WT）和ΔPSI突变株中分离得到的CEF超级复合物的组成，鉴定出在蔗糖密度梯度中依赖光系统I（PSI）迁移的蛋白质。

该策略的成功之处在于质谱结果得到了免疫检测的进一步支持。此外，Terashima 等 可以证实先前研...

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披露

作者声明 无竞争性财务利益。

致谢

M.H. 感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）的资助。作者 贡献： M.H. 设计研究；K.T.、J. S. 和 M.T. 实施研究并分析数据；K.T. 和 M.H. 撰写论文。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
乙酸AppliChemA0662http://www.applichem.com/home/
丙酮AppliChemA2300http://www.applichem.com/home/
乙腈 Optigrade für LC-MSDiagonal9340有害，操作时需戴手套。更多预防措施请参见实验方案正文。

https://www.diagonal.de/

氯化铵 15NCambridge Isotope Laboratories39466-62-1http://www.isotope.com/cil/index.cfm
氯化铵 14NAppliChemA0988http://www.applichem.com/home/
磷酸氢铵 AppliChemA3583http://www.applichem.com/home/
硫酸铵 AppliChemA3598http://www.applichem.com/home/
考马斯亮蓝 R-250Fisher Scientific10041653http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷AppliChemA0819http://www.applichem.com/home/
EDTAAppliChemA2937http://www.applichem.com/home/
甲酸  AppliChemA3858http://www.applichem.com/home/
HEPESAppliChemA3724http://www.applichem.com/home/
氯化镁AppliChemA4425http://www.applichem.com/home/
甲醇AppliChemA2954http://www.applichem.com/home/
亚磷酸AppliChemA0989http://www.applichem.com/home/
磷酸氢二钾 AppliChemA1042http://www.applichem.com/home/
磷酸二氢钾 AppliChemA1043http://www.applichem.com/home/
氢氧化钠AppliChemA1551http://www.applichem.com/home/
蔗糖AppliChemA1125http://www.applichem.com/home/
TricineAppliChemA3954http://www.applichem.com/home/
TrisAppliChemA2264http://www.applichem.com/home/
胰蛋白酶（测序级修饰型）及胰蛋白酶缓冲液PromegaV5111http://www.promega.de/
仪器设备
雾化器（BioNeb 细胞破碎仪）Glas-Colhttp://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
离心管（14 mm x 89 mm） Beckman Coulter331372用于制备 Takahashi 型梯度液

http://www.beckmancoulter.de/

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其他
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参考文献

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