Summary
所描述的比较，定量蛋白质组学方法的目的是获得见解多蛋白复合物的组成不同的条件下，并证明通过比较基因不同的菌株。为定量分析从蔗糖密度梯度不同的馏分等体积完全由质谱混合并进行分析。
Abstract
所引入的协议提供了在类囊体膜多蛋白复合物的分析工具，通过在不同条件下揭示见解复杂的组合物。在这个协议中的方法被证明通过比较蛋白复合物负责在莱茵衣藻的循环电子流（CEF），分离自遗传上不同的菌株的组合物。该方法包括类囊体膜的分离，随后通过基于差分代谢标记（14 N / 15 N）分离成多蛋白复合物通过蔗糖密度梯度离心法，SDS-PAGE，免疫检测和比较，定量质谱（MS）分析菌株。洗涤剂溶解的类囊体膜对蔗糖密度梯度装在平等的叶绿素浓度。超速离心后，将梯度分离成各种馏分，这是由大量spectromet分析RY基于等量。这种方法允许梯度组分中的成分进行调查，此外，分析不同蛋白质的迁移行为，尤其是专注于ANR1，CAS和PGRL1。此外，这种方法被证明了通过从以往的研究支持的结果（即先前描述的是CEF-超复合如PGRL1，FNR的一部分的蛋白质的识别和PSI-依赖的迁移，并在确认的结果与免疫印迹和另外细胞色素F）。值得注意的是，这种方法适用于解决范围广泛的有本协议可以通过， 例如用于多蛋白复合物成分从不同的环境条件下分离出的比较分析问题。
Introduction
在植物和藻类类囊体膜的光合过程可以以线性和环状的方式发挥作用。在线性电子流（LEF）光系统I（PSI），光系统II（PSII）和细胞色素b 6 / f电子转移，最终从水到NADP + 1，导致NADPH和ATP 2的产生。与此相反，循环电子传递（CEF），这被称为像状态2 3和厌氧条件4，结果在由注入电子返回到电子传递链的再还原氧化的PSI不同的环境条件下被诱导。这个过程可以发生在任何的色素b 6 / f复合体1的基质侧或在质体醌库5并产生ATP，但没有NADPH 2。
所提出的协议的目的是展示一个质谱（MS）基于米法认列在莱茵衣藻的类囊体膜多蛋白复合物来获得不同的条件（通过比较基因不同的菌株例举）下洞察这些配合物的组合物的比较，定量分析。这种方法在出版物由寺岛等被使用。在2012年呈现持续进修基金C中的钙离子依赖的调节衣藻由多蛋白复合物包括蛋白CAS号，ANR1和PGRL1 6介导的。该过程将通过比较分析CEF-超复合两种基因不同菌株的组成，从而采取贴标两个菌株与重氮（15 N）的一个优势来解释。简要地，该协议包括类囊体膜的制备，随后的洗涤剂溶解，并在蔗糖密度梯度光合配合物分馏。梯度分离后，选定压裂两株蒸发散是基于等体积混合，通过SDS-PAGE随后在凝胶内消化和随后的定量质谱分析分离。
如上所述，CEF是不同的环境条件下诱导，并从2010年出版演示了CEF功能，超复合的隔离状态下的2锁定单元格衣藻 7，这是由于超速离心过程中蔗糖密度梯度分离溶解的类囊体膜进行。从岩井等 7种不同的，所提出的协议说明了CEF-超复合的厌氧生长C.隔离莱茵衣藻培养物下面的替代程序。这包括在类囊体隔离协议的变化，以及关于在溶解步骤的差异和蛋白质复合物通过超速离心分离。在本协议中，类囊体膜通过施加由蔡氏和Bennoun 8公布的程序，而用于类囊体膜制剂通过岩井等的缓冲液中分离人含有25mM的MES，0.33M的蔗糖，5毫摩尔MgCl 2，1.5 mM氯化钠（pH6.5）中所描述的9。用0.7-0.8％的洗涤剂（N-十三烷基-β-D-麦芽糖苷）进行增溶，在冰上在岩井和同事的情况下30分钟，而这里所描述的增溶方法依赖于使用0.9％的去污剂（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（β-DM））和仅20分钟在冰上进行。两组用每毫升0.8毫克叶绿素为与各自的洗涤剂的溶解。对于光合作用复合体从溶解的类囊体膜的分离岩井等人采用蔗糖浓度0.1-1.3 M之间，而该协议的作者使用浓度为0.4-1.3米的最后一个区别是离心速度，相比是较低的在EArlier出版。
类囊体膜与非离子洗涤剂然后再进行蔗糖密度梯度分级分离的增溶作用已经在大量的研究，从20世纪80年代，直至今日7，9-14和还蛋白的代谢标记的应用是在蛋白质组学领域中的广泛的方法中得到应用。所描述的方法通过将其在重氮如在15 N的NH 4 Cl等 ，其掺入到所有氨基酸导致大规模的形式唯一氮源的存在下培养适用于比较两种菌株之一的15 N代谢标记移取决于肽的氨基酸序列。当分析的内一个MS运行14 N和15 N的混合物，该质量转移可以被用来确定样品原点为每种肽的丰度和可以计算表示为对应的相对丰度相肽ING蛋白质15。
C.上众多的定量蛋白质组学研究莱茵衣藻是可用的，这比较确定蛋白质的量来分析实验条件（ 例如 ，由于营养16-19或光胁迫20,21改变蛋白质组）之间变化，蛋白质组。相比，这些研究中，在目前提出的方法的样品的等体积相结合，并进行分析。这种设置允许以研究蛋白质的迁移行为的梯度内，此外，分析不同的复合物相对于所研究的菌株的组合物。
此方法将被解释主要集中在三种蛋白质：第一候选是叶绿体本地化钙传感器蛋白CAS，这被证明是涉及光驯化C中藻 22。钙被认为是一个重要的信号ING离子为激活由于不同的生物和非生物胁迫最终导致基因表达的变化和细胞生理学和23有人提出，叶绿体可能有助于细胞内Ca 2 +通过CAS蛋白22,24,25的信号通路。第二蛋白是ANR1（厌氧反应1 6），其被证明是缺氧的生长条件下在C诱导的蛋白藻 26。值得注意的是，中科院以及ANR1被认定为CEF-超复合，而且，通过使用反向遗传学的方法，它表明，这两种蛋白质有助于在功能上的CEF 在体内 6，支持他们为这种蛋白质复合体的功能性亚基作用亚基。第三蛋白是类囊体蛋白PGR5样1（PGRL1），将其显示参与在CEF中衣藻 4,27以及在拟南芥 5,28和也标识entified在岩井等人的工作。7
野生型（WT）相对于（对比）一个ΔPSI29株表现出缺失的PSAB基因，编码为一个重要的光系统I亚单位，这也是该组成部分：该方法将通过示出的两个不同的实验的结果呈现CEF-超复合和WT与一个pgrl1敲除株4。为每个实验的CEF-超复合的15 N和14 N-标记的菌株进行了比较之间的定量组成。
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Protocol
1。 衣藻的培养
- 以下三莱茵衣藻株在本研究中使用：WT cc124，WT CW15-arg7（细胞壁缺陷和精氨酸营养缺陷型），一个ΔPSI突变体菌株29和一个pgrl1敲除菌株4。
- 所有菌株均生长在Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）的介质30，在25℃用20-50的连续光强度μE/米2秒，振摇在120rpm。 ΔPSI的文化应该被包裹着一些纸巾<5μE/米2秒的曝光。
- 标记株（ΔPSI和WT cc124，分别）的培养物含有7.5 mM的15 N的NH 4 Cl等 ，而文化对于未标记株（WT CW15-arg7和pgrl1，分别）含有7.5 mM的14 N的NH 4 Cl等 。细胞具有生长为至少4 GENERAT离子全部实现标签和必须保持在指数生长期。
- 于实验开始计数并稀释细胞至1×10 6个细胞/在至少为750毫升/应变的体积ml的密度的前一天。
请注意，两种类型的不连续蔗糖密度梯度在以下方案中描述。根据Takahashi 等人 9的光系统蔗糖密度梯度用来在过夜离心分离不同的光合蛋白质复合物从分离和溶解的类囊体，并且必须在一天前制备（参见方案2）和类囊体蔗糖密度梯度8顷应用的类囊体分离过程中（见协议3）。
2。光系统蔗糖密度梯度准备
- 浇注梯度需要三种股票的解决方案：
- 2M的蔗糖
- 10％的β-DM，在H 2 O的
- 0.5M的甲基甘氨酸，pH 8.0的氢氧化钠（NaOH）
- 使用这些个股，准备了以下解决方案：
浓度： 130万 1.0M的 0.85米 0.7M的 65万 0.4M的 2M的蔗糖 13毫升 10毫升 8.5毫升 7毫升 6.5毫升 4毫升 10％46;-DM 100微升 100微升 100微升 100微升 100微升 100微升 0.5M的甲基甘氨酸 200微升 200微升 200微升 200微升 200微升 200微升 H 2 O的 6.7毫升 9.7毫升 11.2毫升 12.7毫升 13.2毫升 15.7毫升 - 使用14毫米x 89毫米离心管中，并倒入梯度非常缓慢，开始以较低的密度最高的解决方案蔗糖密度解决方案。
- 倾每个只有1毫升的1.3和1.0M溶液和2ml的溶液的其余部分。
- 离开梯度隔夜在寒冷的房间。
3。厌氧诱导和类囊体膜8的隔离
- 开始的类囊体膜的分离之前，通过用4小时氩气鼓泡引起的厌氧条件。发泡可以通过玻璃吸管与培养的恒定混合有磁力搅拌棒的培养烧瓶中进行。
- 通过在2,500 xg离心制粒细胞5分钟，从类囊体膜的分离，重悬在H 1缓冲液（0.3M的蔗糖，25mM的HEPES（pH值7.5），5mM的MgCl 2的）。
（请注意，与类囊体膜样品SH隔离时开始乌尔德保持在冰上，以避免蛋白质降解，所有离心步骤都在4℃和手套工作，强烈建议避免角蛋白污染。） - 颗粒细胞5分钟，2,500 xg离心，重悬在H1的缓冲区。
- 通过与1500百帕氮气压力喷雾器打破细胞有两个通道（无细胞壁的菌株做只有一个通道）。
- 降速细胞7分钟，2,500×g的。
（在此步骤之后将上清液应该浅绿，如果不是，则电池单电池破损没有成功。） - 悬浮细胞在H2缓冲液（0.3M的蔗糖，5毫米的HEPES（pH值7.5），10 mM的EDTA（pH值8.0））和颗粒细胞在32,800×g的10分钟。
- 悬浮细胞在H3的缓冲液（1.8米蔗糖，5毫米的HEPES（pH值7.5），10 mM的EDTA（pH值8.0））和均质颗粒与陶工（没有绿色的颗粒应保持在这一工作步骤结束）。
- 在浴缸类囊体准备蔗糖密度梯度ES（25毫米x 89毫米）由从底部开始有一层12毫升H3缓冲液与细胞，倒入12毫升H4缓冲的中间层（1.3M蔗糖，5mM的HEPES（pH 7.5）中，10毫摩尔EDTA（ pH 8.0）中），和在顶部12毫升H5缓冲液（0.5M蔗糖，5mM的HEPES（pH 7.5）中，10毫摩尔EDTA（pH8.0）中）。浇注梯度时要小心，避免了三层的混合。
- 平衡了H5缓冲和离心类囊体蔗糖密度梯度为1小时，在70,700×g的。
- 从类囊体蔗糖密度梯度除去囊体条带，并与适当量H6缓冲液（5mM HEPES（pH 7.5）中的10mM EDTA（pH 8.0）中）稀释它们。
- 降速细胞在37,900×g离心20分钟。如果颗粒不紧，更H6缓冲是需要这种离心步骤。
- 类囊体悬浮在小体积H6缓冲区，并进行测定叶绿素浓度。
4。叶绿素浓度31的测定
- 叶绿素量的确定是用80％的丙酮进行。
- 混合995微升80％的丙酮和5μl，以H6缓冲液囊体（1:200稀释）。
- 涡流几秒钟，直到没有绿色颗粒保持，然后停止旋转，在14.1×g离心5分钟。
- 取上清液，测定灭绝在663.6和646.6 nm和750 nm处，分别。
- 使用下列公式计算叶绿素金额：
- Ç 叶绿素a [毫克/毫升] =（0.01225 * E 663.6 - 0.00255 * E 646,6）*稀释倍数
- Ç 叶绿素b [毫克/毫升] =（0.02031 * E 646.6 - 0.00491 * E 663.6）*稀释倍数
- Ç 叶绿素 [毫克/毫升] = C 叶绿素a + C 叶绿素b
5。光系统蔗糖密度梯度加载中
- 计算类囊体，β-DM和H6缓冲区需要的金额每个梯度：
- 每个梯度应装有700微升总体积为0.8毫克/毫升的叶绿素在0.9％的β-DM（溶解β-DM中H 2 O），填充H6缓冲液的剩余量。
- 对于增溶准备不同的等份与类囊体，β-DM和H6缓冲区每个梯度。
- 离开样本20分钟，冰与定期混合（反相）每隔几分钟（溶解步骤）。
- 以最大速度离心（14,000×g离心）为10分钟，在4°C。
（离心后，将沉淀物应该是小而发白，而上清液为暗绿色。） - 加载上清对梯度。
- 用H6缓冲液并在4℃下旋转利用超速离心机在134,470×g离心过夜（14小时）平衡
（请注意，使用如本协议提出了光系统蔗糖密度梯度光合复合物的分离成功是全光照时才能实现克新鲜分离的类囊体，由于预测为增溶和复杂的分离是困难的与已经之前冻结类囊体膜中工作时作出。）
6。光系统蔗糖密度梯度分离
- 采取梯度的照片。
- 使用针和分馏梯度中加入500μl管穿刺孔在管的底部。或者，所述分馏也可以通过使用96孔板（微孔板）上进行。
- 当使用微板，确定不同的梯度级分的吸光度在675纳米。
（在这一步骤中的样品可以贮存于-80℃下几个星期。）
7。 SDS-PAGE和免疫检测
（请注意，只有对WT的对比ΔPSI比较的免疫印迹分析已选择分数为后续质谱分析。对于实验WT与pgrl1 FR行动者是由在不同部位的吸光度的方法。）
- 独立的30微升的WT和ΔPSI在13％SDS-聚丙烯酰胺凝胶32梯度每个分数的。
- ANR1（TEF7）26，PGRL1 34，CAS号6，PSI的亚基PSAD 32和PSII核心亚基D1：使用下列抗体进行免疫印迹分析33。使用的所有抗体用稀释1:1,000（增强化学发光检测法），除了D1抗体，其中应用稀释为1:10,000被使用。
- 基于免疫检测的结果，采取ANR1，PGRL1及PSAD的峰组分WT和ΔPSI（这里馏分6和13，分别），混合30微升部分6从WT和ΔPSI，并与部分13从做同样的无论筹备工作，并再次将它们分开在13％SDS聚丙烯酰胺凝胶。
- 对于WT与pgrl1的定量比较采取了C通过测量在不同的梯度级分的吸光度测定，混合30μl的两个样品随后在13％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离的EF-超复合馏分。
- 染色的蛋白条带在4℃的考马斯溶液（85％亚磷酸，757 mM的硫酸铵，1.2％的考马斯亮兰，20％甲醇）处理2小时，在室温或过晚
- 要删除非特异性染色，洗几次与双蒸2 O。
- 切车道成1mm的凝胶块，并继续进行胶内消化。
（可替换地，样本可以干燥几分钟，在真空离心机和贮存几周的凝胶内消化，然后再继续）。
8。胶内消化（从舍甫琴科等人 35修正）
请注意，准备在即将使用前的所有缓冲区和解决方案，并采取玻璃瓶含有乙腈（ACN）的缓冲区。<BR />注意！用ACN工作可能是有害的，更多的信息可以从以下网站下载：http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335（2013年）。
- > 10卷双蒸2 O（〜200微升）的30秒洗凝胶块。
- 孵育凝胶块用300微升25毫米的NH 4 HCO 3为15分钟，振摇，除去液体。
- 孵育凝胶片用300微升的25mM NH 4 HCO 3在50％ACN 15分钟，在摇动（通过混合乙腈和50mM NH 4 HCO 3以1:1的比例制备），除去液体。
- 如果凝胶块还是蓝色的，重复的NH 4 HCO 3和NH 4 HCO 3 /乙腈洗，直到大部分的考马斯亮被删除。
（虽然大部分考马斯染色的应被删除，这是没有必要完全脱色的凝胶块。） - 加入100μl乙腈脱水的凝胶片5分钟。凝胶块应该收缩ND看起来完全白色。
- 删除尽可能多的ACN，尽量进行胰蛋白酶消化。或者，样品可以贮存于-20℃下几个星期。
- 添加每个波段10-20微升20纳克/微升胰蛋白酶在10％乙腈/ 25 mM的NH 4 HCO 3（新鲜摊薄），继续冰样本。
- 30分钟后，检查是否所有溶液吸收，并在必要时添加更多的胰蛋白酶缓冲。凝胶块应完全覆盖胰蛋白酶缓冲。继续冰样本。
- 离开凝胶块在冰上另外90分钟，以用胰蛋白酶饱和它们。
（关键步骤：胰蛋白酶肽的产率与在冰上增加孵育时间大大增加了酶进入聚丙烯酰胺基质慢速扩散的可能，因为它需要有一个稍微过量的溶液覆盖所述凝胶片，以避免碎片。隔夜孵化期间跌倒干。） - 消化在37℃4-6小时。对于需要实验最大的肽恢复，消化过夜。
- 消化后降速简明缓冲区。
- 超声处理管5分钟，再洗脱肽和离心机。
- 收集上清液，并将其转移至新管。
- 在超声波水浴中15分钟80微升的30％乙腈/ 1％甲酸（FA）进行肽的提取。
- 与80μL30％乙腈/ 1％FA在超声波水浴中15分钟进行提取。
- 与80μL70％乙腈/ 1％FA在超声波水浴中15分钟进行提取。
- 再次和池上清液离心与以往洗脱液。
（FA用于灭活胰蛋白酶和肽增加溶解度。） - 完全在真空离心机干燥的肽溶液。
（此时样品可存放数周在-20℃下继续进行质谱分析之前。） - 重悬肽6微升的MS缓冲液（5％乙腈，0.1 V / V FA，水）和超声为2-5分钟。
- 离心样品在maximu米速度5分钟，以去除颗粒物质。
- 使用4μL上清进行质谱分析。
9。与“Proteomatic”MS-数据分析
与开源软件“Proteomatic”（可在http://www.proteomatic.org/下载），一个平台，允许发电和MS / MS数据评估管道完成后，通过进行数据分析免费和商业软件36。简单地说，设置如下所述，更详细的信息，可以在6,26找到。
- 的质谱数据鉴定和量化
从实验WT与ΔPSI识别和蛋白质的定量进行了与OMSSA（版本2.1.4 37）和qTrace 26，分别描述6,26。从实验中野生型与pgrl1以下更新管线的MS数据分析方法：- 除了OMSSA 37，蛋白质也被确定了X！串联（版本2013年2月1日38）。两种算法通过检索对由衣 JGI的基因模型数据库4.3版结合奥古斯数据库版本10.2，以及对NCBI的加入数据库生成的数据库应用数据库BK000554.2和NC_001638.1。
- 通过使用一个目标诱饵的方法39进行质谱鉴定2肽。一个诱饵每个蛋白通过随机洗牌的胰蛋白酶肽，同时保留nonproteotypic肽的冗余创建的。
- 使用小于0.01和结果进行过滤，用5 ppm的前体质量耐受后验误差概率（PEP）的阈值与该软件qvality（0.3.3 40版）进行肽的统计验证。
- 肽从OMSSA和X！串联运行被加入并与qTrace量化
为了研究蛋白质之比是否朝向彼此显著不同在来自WT和pgrl1混合CEF-超复合馏分，进行统计学分析应用软件SPSS（版本21）。该色素b 6 / f复合体的亚基测试对彼此以及蛋白质FNR，FTSH2和HCF136对PSI亚基。每蛋白质每扫描计数四个重复的肽比例进行了测试正态分布与夏皮罗 - 威尔克斯测试。由于肽种群不是正态分布（P <0.001），非参数统计被执行。首先，Kruskal-Wallis检验施加评估组间显著发散。只有当这个测试预测显著差异团体s之间，进行进一步的分析，预测两个独立的组间显著差异与采用Mann-Whitney-U检验。
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Representative Results
所引入的定量蛋白质组学方法的目的是多蛋白复合物的组成表征由基因不同C. CEF-超复合成分的比较分析表明类囊体膜衣藻株。所描述的方法已经被成功地由寺岛等人 6施加，并且包括从厌氧生长的培养物类囊体膜，随后洗涤剂增溶的隔离。随后，样品装载到蔗糖密度梯度的基础上平等的叶绿素量和复合物通过超速离心分级。用于定量质谱分析从不同菌株2梯度组分等体积混合，并比较分析（ 图1）。所呈现的结果包括WT CW15-arg7和ΔPSI以及野生cc124和pgrl1之间分别持续进修基金，超复合分数的比较。
图2A和2B）被选为6， 图3示出了相对于蛋白质之比为WT /ΔPSI（14 N / 15 N）为几个PSI的核心和LHCI蛋白（PSI也被命名为LHCA蛋白的捕光蛋白）以及对于分配与CEF-超复合蛋白。正如预期的那样，PSI核心蛋白是由两种组分无穷比率表明野生样本中只发现了。 Lhca2和Lhca9富集的WT，同时Lhca4 -6和-8展现不同的调控在这两个部分。要注意的是LHCI蛋白质被合成，并且通常积累在ΔPSI突变体41是很重要的。该PSI-LHCI的多肽比较从C复合藻 WT与ΔPSI突变体的LHCI复杂的显示，大多数Lhca2的，-3，-9似乎只有弱结合到LHCI，此外，该PSI核心的存在是必要的稳定的结合。与此相反，Lhca1，-4，-6，-7，-8和形成PSI 14的组件的复杂的独立的，这可以解释在不同规Lhca4的，-6和-8在本实验中。
对于与CEF-超复合分配的蛋白质，它可以是那些较为丰富的野生分数6和ΔPSI突变的部分13之间进行区分，呈现出由比大于1的分数6显示强大的PSI的依赖性迁移和低于比一个或没有分数13检测（Lhcbm5，PGRL1，ANR1，CAS号，PFD HCF136和细胞色素f）和那些显示的是没有这样一个强大的，但尽管如此PSI的依赖本地化（FNR，FTSH1，FTSH2和ATPC ）。
有了这个实验寺岛等 6展示了用于ANR1和CAS（ 图2A-D和图3）PSI依赖性迁移行为，从而揭示它们作为CEF-超复合的新型蛋白质，以前没有确定7。在MS-分析的研究结果也证实了免疫检测，并支持通过反向遗传学的应用程序以确认这些蛋白质的持续进修基金体内 6职能作用。此外，这种比较的MS-办法强烈支持从以前的研究结果，通过确认已被证明是在CEF-超复合如PGRL1，细胞色素f和 FNR 7，以及Lhcbm5 7,9来显示的一部分的蛋白质PSI的依赖性定位在蔗糖密度梯度，这与ANR1和CAS。
部分6和13 anr1和ΔPSI的比较使用相同approacH（见图S8 6）展示了一款类似的基金，超复合的anr1和透露，在实验中野生与ΔPSI的蛋白质ANR1，CAS和PGRL1相同的趋势的组成。值得注意的是，虽然ANR1的分数6蛋白比（anr1与ΔPSI）相媲美的WT的对比ΔPSI实验的比例，CAS和PGRL1的数额似乎是在实验前和较高可能是导致补偿下调ANR1 6。
此外，ANR1和CAS在CEF-超复合组分富集我们也可以推断出其它几种蛋白质的PSI依赖移民从这个实验。这是两个ATP-依赖性金属蛋白酶FTSH1和FTSH2中发挥的PSII反应中心蛋白D1在叶绿体的降解基本作用42,43，含蛋白质prefoldin-领域，HCF136，这对于稳定性或一个关键因素ASSEMBPSII 44 LY和ATP酶的γ亚基。而对于后来人，部分6和13之间的比值不显示这样一个明显的区别，进一步的实验必须进行，以验证其他蛋白是否也可能持续进修基金，超复合的候选人。
作为一种概念的实验为这个比较的方法证明，我们分析了两株，这都有PSI的CEF-超复合成分，使这种复合物的形成。基于该分级梯度的吸光度测量的各个级分选。 图4A和图4B示出的结果为WT和一个pgrl1敲除菌株之间的定量比较。应当指出，ANR1和CAS不显着WT和pgrl1之间改变。有趣的是，HCF136似乎在WT得到充实，而FTSH2似乎pgrl1加以充实。有统计SI为上述蛋白质的所有PSI-亚基（包括LHCI蛋白）gnificant差异可以确认。
此外，色素b 6 / f复合体亚基cyt的f和PETO被证明是显著不同细胞色素b 6，细胞色素b 6 /女 IV和PETC，分别。值得注意的是，细胞色素f似乎是上调pgrl1，而细胞色素b 6和细胞色素b 6 /女四是小幅下调，虽然细胞色素F作为中间体的调控可能涉及细胞色素b 6和细胞色素b 6 /女四45 。核编码PETC，这也被称为Rieske蛋白显示了类似的监管，因为细胞色素b 6和细胞色素b 6 /女四（ 即下调在pgrl1）。这是惊人的Rieske蛋白的减少或缺失仍导致超视距的积累呃细胞色素b 6 /女亚基〜C中的WT水平的60％ 藻 46。另外，在pgrl1上调PETO是很重要的是要注意，因为这种松散结合的亚单位显示累积到在C中的水平降低莱茵衣藻突变体，缺乏任何细胞色素b 6，细胞色素b 6 /女 IV或PETC 47，这是不太丰富的pgrl1相比，WT在本实验中。
图1所描绘的WT和ΔPSI实验的工作流程。细胞代谢标记为至少四代，厌氧条件是通过氩气鼓泡诱导4小时和类囊体膜是通过梯度分离分离。 Isola酒店特德膜使用β-DM溶解，装上一个蔗糖密度梯度（对两个菌株的叶绿素等量应用于此步骤）和隔夜离心。梯度级分收集并分析通过SDS-PAGE以及免疫检测，以确定梯度内蛋白质的分布。要识别的蛋白质与PSI依赖迁移，WT CEF-超复合分数（分数数6）等体积和相应的15从ΔPSI菌株N-标记的部分混合，并对比分析。同样是与ANR1在ΔPSI株（分数13号）的峰值部分进行。对于比较，定量的MS-办法，混合蛋白样品经SDS-PAGE分离，蛋白质条带，考马斯亮蓝染色溶液中，然后在凝胶消化之前的MS-分析。 点击这里查看大伊马GE。
图2。ANR1和CAS迁移到在ΔPSI应变的密度较低的地区。 A：的WT和ΔPSI类囊体从厌氧条件分离蔗糖密度梯度分离成20个级分B：ANR1在20级分来自WT和ΔPSI梯度的免疫检测。而该蛋白质定位于高密度区域中的WT（馏分6）它是向上移动到密度较低的地区，在ΔPSI应变（级分13）C：WT和ΔPSI的蔗糖密度梯度类囊体从分离厌氧条件下被分成27部分D：中科院免疫检测在27级的WT和ΔPSI梯度。虽然这种蛋白定位吨o在WT中的高密度区域（峰值周围部分7）它是向上移动到密度较低的地区，在ΔPSI应变（峰值周围部分19）。 （这个数字已经被修改寺岛等。6） 点击这里查看大图。
在部分6确定图3。相对蛋白质之比和13从野生型和ΔPSI通过定量质谱法。馏分6和13从野生型进行了比较与来自15 N-标记的ΔPSI应变各个馏分。这代表了两个生物学重复和3的MS-奔跑的相对蛋白质之比被描绘为WT /ΔPSI（14Ñ/ 15 N）的两种组分分析与异常细胞色素楼这是只在部分6确定。这种比较定量揭示了ANR1和CAS显示在蔗糖密度梯度的PSI依赖迁移（这个数字已经被修改寺岛等。6） 点击这里查看大图。
图4：在WT的CEF-超复合分数和pgrl1通过定量质谱法测定蛋白质的相对比率。答 ：WT蔗糖密度梯度和pgrl1类囊体厌氧条件中分离B：相对蛋白质比between个CEF-超复合分数从四个不同的重复而产生描绘为WT / pgrl 1（14 N / 15 N）。在这个实验中ANR1和CAS都没有显着变化，而FTSH2和HCF136表现相比，由***以红色作为指明外，所有PSI-亚基（P≤0.001显著差异; HCF136：1900 <U <58127; FTSH2 2117 <ü <164197）。此外，细胞色素b 6 / f复合体亚基cyt的f和PETO被证明是显著不同细胞色素b 6，细胞色素b 6 /女 IV和PETC，分别为（P≤0.001 ***蓝色所示;细胞色素f ：2684 <U <11535; PETO：4700 <U <23663） 点击此处查看大图。
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Discussion
利用稳定同位素标记不同的蛋白质组定量研究已经发表在最近几年。在这些实验中通常有两种不同的样品进行比较，其中一个样品都标有一个稳定的同位素。其后，两个样品的蛋白质或肽组合在相等的比率，并进一步处理一起48。这种研究常常想比较定义孤立的细胞区室（ 例如叶绿体，线粒体，或类囊体膜）暴露于不同应激条件26,34,49调查向上或向下调节特定蛋白质。所描述的比较，定量蛋白质的方法的目的是分析在类囊体膜的多蛋白复合物的组成和，相对于上述的研究中，基于混合的样品相同体积的类囊体膜的蔗糖密度分离以相等的叶绿素浓度之前加载后超速离心化。这种方法有效地寺岛等。6谁比较分析的CEF-超复合从WT和一个ΔPSI应变，以确定蛋白质在蔗糖密度梯度迁移的PSI依赖性隔离的组合物施用。
为实现这一策略的是由一个事实，即MS-结果由免疫检测进一步支持了证实。此外，寺岛等人可以从先前的研究证实的结果（ 即已经描述的是CEF-超复合，如PGRL1，FNR，以及细胞色素F 7的一部分的蛋白质的识别和PSI-依赖的迁移）。 ANR1和CAS的识别作为CEF-6机械新型元器件揭示了这种方法作为一个非常强大和有效的工具。值得注意的是，孤立的CEF-超复合展出的体外活性，从 而证明一个函数的成功提纯周志武多蛋白复合物6。这种方法的适用性也为两株其中既形成了CEF-超复合被证明WT和pgrl1之间的比较。
在一般情况下，此方法可用于探测在不同的菌株或条件复杂的组合物所揭示的那些共纯化与CEF-超复合馏分（ 即 FTSH1，FTSH2，PFD和HCF136在浓缩以前未知的蛋白质的鉴定CEF-超复合分数）。无论这些蛋白是这种复杂的可能的新的候选人，并改善我们的理解为不同的监管FTHS2，HCF136的，以及对细胞色素b 6 /女亚基所揭示的WT和pgrl1的比较，进一步的实验是必要的。
除了这种方法的描述的优点，有断绝需要仔细考虑这一协议工作时，人的关键步骤：细胞与雾化器的断裂是重要的第一步。如果单元格的开口不进行以适当的方式，隔离类囊体的产量将是相当低，并可能导致通宵离心后几乎没有任何检测的CEF-超复合的。小区的干扰成功可以从离心后的上清液的浅绿色来推断。相反，如果细胞破碎时的压力过高时，该超复合的部分可能瓦解和重要辅因子可能会丢失。影响类囊体的屈服的另一个步骤是细胞的一个陶工的再悬浮。此，必须小心地进行，并在此步骤结束时只有少数绿色颗粒应维持不变。此外，对于蔗糖密度梯度制剂的前一天，以及用于膜复合物的增溶作用，这是非常重要的正是遵循这一协议中的β-DM浓度方面，因为这是非常重要的获得完全溶解的类囊体50，因此也为CEF-超复合净化。在溶解步骤中已经成功地执行，如果一个小的，发白的沉淀随后的离心步骤后观察。应该在这里提到的另一个关键点是通宵超速离心的时间。蔗糖密度梯度应离心至少十小时才能达到光合复合物充分分离。
即使该协议是使用C.证实衣藻的两种基因不同菌株的CEF-超复合成分的对比分析，它很容易适应也是一个广泛的其他问题，如多蛋白复合物成分从不同的环境/实验分离出的比较分析条件下或使用其它类型的分馏。这种方法的唯一要求是，该模型有机体可在细胞培养物进行培养，能够使用氨作为氮源和蛋白复合物可通过蔗糖密度梯度进行分离，这表明该方法具有广泛的应用。对于这种方法的SDS-PAGE混合14 N / 15 N个样本，并随后在凝胶消化分馏未来的应用可以通过应用过滤器辅助样品制备（FASP）方法所取代。此方法包括强洗涤剂增溶旨在“清理”蛋白质组的消化之前和获得纯化的肽，防止能抑制肽恢复的凝胶内消化方法的缺点的应用，尽管应该考虑，在凝胶消化被描述为鲁棒性，可能与消化51干扰污染。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
MH从“德意志研究联合会”（DFG）的承认支持。作者 贡献：MH设计的研究，KT，JS和MT进行研究和分析的数据，KT和MH写文章。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
