Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Multiprotein परिसरों का तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक नए दृष्टिकोण पर आधारित Published: March 13, 2014 doi: 10.3791/51103
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, 2Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

Summary

वर्णित तुलनात्मक, मात्रात्मक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण अलग परिस्थितियों में multiprotein परिसरों की संरचना में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए करना है और आनुवंशिक रूप से अलग उपभेदों की तुलना द्वारा प्रदर्शन किया है. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक सुक्रोज घनत्व ढाल से अलग अंशों की बराबर मात्रा मास स्पेक्ट्रोमेट्री से मिलाया और विश्लेषण कर रहे हैं.

Abstract

पेश प्रोटोकॉल विभिन्न परिस्थितियों में जटिल संरचना में अंतर्दृष्टि खुलासा, thylakoid झिल्ली में multiprotein परिसरों के विश्लेषण के लिए एक उपकरण प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल में दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से अलग उपभेदों से पृथक Chlamydomonas reinhardtii में चक्रीय इलेक्ट्रॉन प्रवाह (CEF), के लिए जटिल जिम्मेदार प्रोटीन की संरचना की तुलना द्वारा प्रदर्शन किया है. प्रक्रिया के अंतर चयापचय लेबलिंग (14 एन / 15 एन) के आधार पर सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation, एसडीएस पृष्ठ, immunodetection और तुलनात्मक, मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा multiprotein परिसरों में उनकी जुदाई द्वारा पीछा thylakoid झिल्ली के अलगाव, शामिल हैं विश्लेषण किया उपभेदों. डिटर्जेंट solubilized thylakoid झिल्ली बराबर क्लोरोफिल एकाग्रता में सुक्रोज gradients घनत्व पर लोड कर रहे हैं. Ultracentrifugation के बाद, ढ़ाल जन spectromet से विश्लेषण कर रहे हैं, जो भिन्न, में विभाजित हैंRY बराबर मात्रा पर आधारित है. यह दृष्टिकोण इसके अलावा ढाल भिन्न भीतर की संरचना की जांच और विशेष रूप से ANR1, कैस, और PGRL1 पर ध्यान केंद्रित, विभिन्न प्रोटीन के प्रवास व्यवहार का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. इसके अलावा, इस विधि (पिछले अध्ययनों से पहले इस तरह के PGRL1, एफ एन आर रूप CEF-supercomplex का हिस्सा होना बताया गया है कि प्रोटीन की पहचान और साई पर निर्भर प्रवास निष्कर्ष का समर्थन है, और द्वारा immunoblotting के साथ और साथ ही परिणाम की पुष्टि द्वारा प्रदर्शन किया है CYT च). विशेष रूप से, इस दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल को अपनाया जा सकता है और जैसे विशिष्ट पर्यावरण की स्थिति से अलग multiprotein जटिल संरचना के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है जिसके लिए सवालों की एक व्यापक रेंज पता करने के लिए लागू है.

Introduction

पौधों और शैवाल की thylakoid झिल्ली में संश्लेषक प्रक्रियाओं एक रेखीय और चक्रीय मोड में कार्य कर सकते हैं. रेखीय इलेक्ट्रॉन प्रवाह (LEF) प्रकाशतंत्र मैं (साई), प्रकाशतंत्र द्वितीय (PSII) और साइटोक्रोम बी 6 / एफ के दौरान अंततः NADPH और एटीपी 2 की पीढ़ी के लिए अग्रणी, पानी से NADP + 1 इलेक्ट्रॉनों हस्तांतरण. इसके विपरीत, राज्य 2 3 और अवायवीय स्थितियों 4, वापस इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में इलेक्ट्रॉनों इंजेक्शन लगाने के द्वारा ऑक्सीकरण साई की फिर से कमी में परिणाम जैसे विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में प्रेरित किया जा करने के लिए जाना जाता है जो चक्रीय इलेक्ट्रॉन प्रवाह (CEF),. इस प्रक्रिया साइटोक्रोम बी 6 / एफ जटिल 1 के स्ट्रोमल पक्ष में या plastoquinone पूल 5 में या तो जगह ले और एटीपी उत्पन्न करता है, लेकिन कोई NADPH 2 सकते हैं.

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित एम प्रदर्शित करने के लिए है(आनुवंशिक रूप से अलग उपभेदों की तुलना द्वारा उदाहरण) अलग अलग परिस्थितियों में इन परिसरों की रचना में जानकारी हासिल करने के लिए Chlamydomonas reinhardtii की thylakoid झिल्ली में multiprotein परिसरों का तुलनात्मक, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए ethod. यह दृष्टिकोण Terashima एट अल द्वारा एक प्रकाशन में लागू किया गया था. 2012 में सी. में CEF के एक सीए 2 + निर्भर विनियमन दिखा प्रोटीन कैस, ANR1, और PGRL1 6 सहित एक multiprotein जटिल द्वारा मध्यस्थता reinhardtii. प्रक्रिया अपेक्षाकृत जिससे लेबलिंग भारी नाइट्रोजन (15 एन) के साथ दो उपभेदों में से एक का फायदा उठाते हुए दो आनुवंशिक रूप से विभिन्न प्रकारों में CEF-supercomplex की संरचना का विश्लेषण करके समझाया जाएगा. संक्षेप में, प्रोटोकॉल डिटर्जेंट solubilization और एक sucrose घनत्व ढाल में संश्लेषक परिसरों के विभाजन के द्वारा पीछा thylakoid झिल्ली की तैयारी भी शामिल है. ढाल के विभाजन के बाद, इन्हीं चयनितदो उपभेदों का माहौल मिलाया, बराबर मात्रा के आधार पर में जेल पाचन और बाद में मात्रात्मक एमएस विश्लेषण के बाद एसडीएस पृष्ठ से अलग हो रहे हैं.

जैसा कि ऊपर कहा, CEF विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में प्रेरित किया और 2010 से एक प्रकाशन राज्य से सी. के 2 अवरोधित कोशिकाओं एक कार्यात्मक CEF-supercomplex के अलगाव दर्शाता है ultracentrifugation दौरान एक सुक्रोज घनत्व ढाल पर solubilized thylakoid झिल्ली अलग से प्रदर्शन किया गया था, जो 7 reinhardtii. Iwai एट अल. 7 से अलग है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल अवायवीय उगाया सी. से CEF-supercomplex के अलगाव का वर्णन एक वैकल्पिक प्रक्रिया का पालन करते हुए reinhardtii संस्कृतियों. इस thylakoid अलगाव प्रोटोकॉल में परिवर्तन के साथ ही solubilization कदम के विषय में मतभेद और ultracentrifugation द्वारा प्रोटीन परिसरों की जुदाई शामिल हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल में, thylakoid झिल्लीबफ़र्स Iwai एट द्वारा thylakoid तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि Chua और Bennoun 8 द्वारा प्रकाशित प्रक्रिया को लागू करने से अलग कर रहे हैं अल. 9 वर्णित के रूप में 25 मिमी एमईएस, 0.33 एम सुक्रोज, 5 मिमी 2 MgCl, 1.5 मिमी NaCl (पीएच 6.5) निहित. यहाँ वर्णित solubilization विधि 0.9% डिटर्जेंट के उपयोग पर निर्भर करता है, जबकि solubilization, Iwai और सहकर्मियों के मामले में बर्फ पर 30 मिनट के लिए 0.7-0.8% डिटर्जेंट (एन tridecyl-β-D-maltoside) के साथ प्रदर्शन किया गया था (एन -Dodecyl-β-D-maltoside (β-डीएम)) और बर्फ पर केवल 20 मिनट के लिए किया जाता है. दोनों समूहों संबंधित साबुन के साथ solubilization के लिए मिलीलीटर प्रति क्लोरोफिल की 0.8 मिलीग्राम इस्तेमाल किया. इस प्रोटोकॉल के लेखकों लेकर सांद्रता का इस्तेमाल किया जबकि solubilized thylakoid झिल्ली से संश्लेषक परिसरों के विभाजन के लिए Iwai एट अल., 0.1-1.3 एम के बीच सुक्रोज सांद्रता लागू 0.4-1.3 एम. पिछले अंतर से तुलना में कम है जो centrifugation गति है, ईए के लिएrlier प्रकाशन.

सुक्रोज घनत्व ढाल fractionation द्वारा पीछा nonionic डिटर्जेंट के साथ thylakoid झिल्ली की solubilization पहले से ही 1980 के दशक से और भी प्रोटीन के चयापचय लेबलिंग के आवेदन प्रोटिओमिक्स क्षेत्र में एक व्यापक तरीका है आज 7, 9-14 तक लेकर कई अध्ययनों में लागू किया गया है. वर्णित दृष्टिकोण एक बड़े पैमाने पर करने के लिए अग्रणी सभी अमीनो एसिड में शामिल किया है जो 15 एन एनएच 4 सीएल, के रूप में एकमात्र नाइट्रोजन स्रोत के रूप में भारी नाइट्रोजन की उपस्थिति में यह संवर्धन द्वारा दो तुलना उपभेदों में से एक के लिए 15 एन चयापचय लेबलिंग लागू होता है पेप्टाइड के अमीनो एसिड अनुक्रम के आधार पर पाली. एक एमएस चलाने के भीतर 14 और एन 15 एन के एक मिश्रण का विश्लेषण करते हैं, यह बड़े पैमाने पर बदलाव प्रत्येक पेप्टाइड और abundances अनुरूप के लिए रिश्तेदार abundances का प्रतिनिधित्व गणना की जा सकती रिश्तेदार पेप्टाइड के लिए नमूना मूल निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रोटीन 15 आईएनजी.

सी. पर कई मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स पढ़ाई reinhardtii प्रयोगात्मक शर्तों के कारण (16-19 पोषक तत्व या प्रकाश तनाव 20,21 को proteome में जैसे परिवर्तन) के बीच proteome में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन का एक निर्धारित राशि की तुलना, जो उपलब्ध हैं. उन अध्ययनों की तुलना में, वर्तमान में प्रस्तुत दृष्टिकोण में नमूनों के बराबर मात्रा में संयुक्त और विश्लेषण कर रहे हैं. इस सेटअप ढाल के भीतर प्रोटीन के प्रवास व्यवहार का अध्ययन करने के लिए और इसके अलावा जांच उपभेदों के संबंध में विभिन्न परिसरों की संरचना का विश्लेषण करने की अनुमति देता है.

इस विधि में मुख्य रूप से तीन प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित करके समझाया जाएगा: पहले उम्मीदवार सी. में फोटो दशानुकूलन में शामिल होना दिखाया गया था जो क्लोरोप्लास्ट स्थानीय कैल्शियम सेंसर प्रोटीन कैस, है reinhardtii 22. कैल्शियम एक महत्वपूर्ण संकेत माना जाता हैअंत में जीन अभिव्यक्ति और सेल फिजियोलॉजी 23 में परिवर्तन करने के लिए प्रमुख कारण विभिन्न जैविक और अजैविक तनाव सक्रिय कर रहे हैं और यह क्लोरोप्लास्ट कैस प्रोटीन 22,24,25 के माध्यम से संकेत + सेलुलर 2 सीए करने के लिए योगदान हो सकता है कि प्रस्तावित किया गया था कि रास्ते के लिए आयन आईएनजी. दूसरे प्रोटीन ANR1 (अवायवीय प्रतिक्रिया 1 6), सी. में anoxic बढ़ती शर्तों के तहत प्रेरित किया जा दिखाया गया था कि एक प्रोटीन होता है reinhardtii 26. विशेष रूप से, कैस के रूप में अच्छी तरह से ANR1 CEF-supercomplex और इसके अलावा, रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके, यह दोनों प्रोटीन इस प्रोटीन परिसर के कार्यात्मक सब यूनिटों के रूप में अपनी भूमिका का समर्थन है, विवो 6 में CEF कार्यात्मक योगदान देने वाले प्रदर्शन किया गया की सब यूनिटों के रूप में पहचान की गई. तीसरे प्रोटीन Chlamydomonas 4,27 में और साथ ही एराबिडोप्सिस 5,28 में CEF में शामिल होने के लिए दिखाया गया है और यह भी आईडी था जो thylakoid प्रोटीन PGR5 तरह 1 (PGRL1), हैIwai एट अल के काम में entified. 7

, Wildtype (WT) (बनाम) एक ΔPSI 29 तनाव बनाम psab जीन की एक विलोपन प्रदर्शन भी का हिस्सा है जो मैं सबयूनिट एक आवश्यक प्रकाशतंत्र, के लिए कोडिंग: यह दृष्टिकोण दो अलग प्रयोगों के परिणाम दिखा द्वारा प्रस्तुत किया जाएगा CEF-supercomplex और गुम्मट बनाम एक pgrl1 नाक आउट तनाव 4. उन प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए एक 15 एन और एक 14 एन लेबल तनाव तुलना की गई है के बीच CEF-supercomplex की मात्रात्मक रचना.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Chlamydomonas के संवर्धन

  1. निम्नलिखित सी. reinhardtii उपभेदों वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया गया: WT cc124, गुम्मट cw15-arg7 (सेल दीवार कमी और arginine auxotroph), एक ΔPSI उत्परिवर्ती तनाव 29 और एक pgrl1 नाक आउट तनाव 4.
  2. सभी उपभेदों एक निरंतर प्रकाश 20-50 की तीव्रता μE / एम 2 सेकंड और 120 rpm पर मिलाते हुए साथ Tris-एसीटेट फॉस्फेट (नल) मध्यम 30, 25 डिग्री सेल्सियस में बड़े हो रहे थे. ΔPSI की संस्कृति <5 μE / एम 2 सेकंड के प्रकाश जोखिम के लिए कुछ टिशू पेपर के साथ लिपटे किया जाना चाहिए.
  3. nonlabeled उपभेदों (क्रमशः गुम्मट cw15-arg7 और pgrl1,) के लिए संस्कृतियों 7.5 मिमी 14 एन एनएच 4 सीएल निहित जबकि (क्रमशः ΔPSI और गुम्मट cc124,) लेबल उपभेदों की संस्कृतियों, 7.5 मिमी 15 एन एनएच 4 सीएल निहित. कोशिकाओं में कम से कम चार generat के लिए विकसित करने के लिए हैपूरी लेबलिंग और प्राप्त करने के आयनों घातीय विकास के चरण में रखा जाना चाहिए.
  4. प्रयोग की गिनती और कम से कम 750 मिलीग्राम / तनाव का एक मात्रा में 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व के लिए कोशिकाओं को कमजोर शुरू करने से पहले दिन.

टूटनेवाला सुक्रोज gradients घनत्व के दो प्रकार के निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित हैं कृपया ध्यान दें. प्रकाशतंत्र सुक्रोज gradients घनत्व ताकाहाशी एट अल. 9 के अनुसार thylakoid सुक्रोज gradients घनत्व (प्रोटोकॉल 2 देखें) से पहले खत्म रात centrifugation के दौरान अलग और solubilized thylakoids से अलग संश्लेषक प्रोटीन परिसरों को अलग किया और दिन के लिए तैयार रहना होगा करने के लिए उपयोग किया जाता है 8 (प्रोटोकॉल 3 देखें) thylakoid अलगाव की प्रक्रिया में लागू कर रहे हैं.

2. Photosystem सुक्रोज gradients घनत्व की तैयारी

  1. ढ़ाल डालने का कार्य के लिए तीन स्टॉक समाधान की जरूरत है:
    1. 2 एम सुक्रोज
    2. एच 2 में 10% β-डीएम हे
    3. 0.5 एम Tricine, पीएच 8.0 (NaOH)
  2. इन शेयरों का प्रयोग, निम्न समाधानों को तैयार:
    एकाग्रता: 1.3 एम 1.0 एम 0.85 एम 0.7 मीटर 0.65 मीटर 0.4 एम
    2 एम सुक्रोज 13 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर 8.5 मिलीलीटर 7 मिलीलीटर 6.5 मिलीलीटर 4 मिलीलीटर
    10%46, डीएम 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl
    0.5 एम Tricine 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl 200 μl
    एच 2 हे 6.7 मिलीलीटर 9.7 मिलीलीटर 11.2 मिलीलीटर 12.7 मिलीलीटर 13.2 मिलीलीटर 15.7 मिलीलीटर
  3. 14 मिमी x 89 मिमी अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग करें और कम घनत्व समाधान करने के लिए उच्चतम सुक्रोज घनत्व समाधान की शुरुआत के साथ, बहुत धीरे धीरे ढ़ाल डालना.
  4. समाधान के बाकी के लिए 1.3 और 1.0 एम समाधान और 2 मिलीलीटर के लिए केवल 1 मिलीलीटर प्रत्येक डालो.
  5. ठंडे कमरे में रात भर ढ़ाल छोड़ दें.

3. अवायवीय प्रेरण और Thylakoid झिल्ली 8 का अलगाव

  1. Thylakoid झिल्ली के अलगाव के साथ शुरू करने से पहले, 4 घंटा के लिए आर्गन साथ बुदबुदाती द्वारा अवायवीय स्थितियों के लिए प्रेरित. बुदबुदाती एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ संस्कृति के निरंतर मिश्रण के साथ बोतल संवर्धन में एक गिलास विंदुक के माध्यम से किया जा सकता है.
  2. 2,500 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं pelleting द्वारा thylakoid झिल्ली के अलगाव के साथ शुरू करो, एच 1 बफर में Resuspend (0.3 एम sucrose, 25 मिमी HEPES (पीएच 7.5), 5 मिमी 2 MgCl).
    (कृपया ध्यान दें कि thylakoid झिल्ली नमूने श के अलगाव की शुरुआत के साथ जबप्रोटीन गिरावट से बचने के लिए बर्फ पर रखा जाना ould, सभी centrifugation कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाता है और दस्ताने के साथ काम करने की जोरदार केरातिन संक्रमण से बचने के लिए सिफारिश की है.)
  3. 2,500 XG, एच 1 बफर में resuspend पर 5 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं.
  4. 1500 एचपीए की एक नाइट्रोजन दबाव के साथ एक छिटकानेवाला के माध्यम से दो मार्ग के साथ कोशिकाओं को तोड़ने (सेल दीवार बिना उपभेदों के लिए केवल एक मार्ग है).
  5. 2500 x जी पर 7 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन.
    (इस कदम के बाद सतह पर तैरनेवाला यदि नहीं, तो सेल टूटना सफल नहीं था, हल्के हरे रंग की होनी चाहिए.)
  6. एच 2 बफर (0.3 एम सुक्रोज, 5 मिमी HEPES (पीएच 7.5), 10 मिमी EDTA (8.0 पीएच)) और 32,800 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं में कोशिकाओं Resuspend.
  7. H3 बफर में Resuspend कोशिकाओं (1.8 मी सुक्रोज, 5 मिमी HEPES (पीएच 7.5), 10 मिमी EDTA (8.0 पीएच)) और एक कुम्हार (कोई हरी कणों यह काम कर कदम के अंत में रहना चाहिए) के साथ गोली homogenize.
  8. टब में thylakoid सुक्रोज gradients घनत्व की तैयारी12 एमएल H3 की एक परत के साथ नीचे शुरू से तों (25 मिमी x 89 मिमी) 12 मिलीलीटर एच 4 बफर के एक मध्यम स्तर डालना, कोशिकाओं के साथ बफर (1.3 एम सुक्रोज, 5 मिमी HEPES (पीएच 7.5), 10 मिमी EDTA ( पीएच 8.0)) और शीर्ष 12 एमएल H5 बफर पर (0.5 एम सुक्रोज, 5 मिमी HEPES (पीएच 7.5), 10 मिमी EDTA (8.0 पीएच)). ढ़ाल डालने का कार्य करते समय सावधान रहें और तीन परतों के मिश्रण से बचने.
  9. H5 x जी 70700 पर 1 घंटे के लिए बफर और अपकेंद्रित्र thylakoid सुक्रोज gradients घनत्व के साथ संतुलन.
  10. Thylakoid सुक्रोज घनत्व ढ़ाल से thylakoid बैंड निकालें और एक उचित मात्रा H6 बफर (5 मिमी HEPES (7.5 पीएच) 10 मिमी EDTA (पीएच 8.0)) के साथ उन्हें पतला.
  11. 20 मिनट के लिए 37,900 XG पर कोशिकाओं स्पिन. गोली तंग नहीं है, तो और एच 6 बफर इस centrifugation कदम के लिए आवश्यक है.
  12. एक छोटी मात्रा H6 बफर में thylakoids Resuspend और क्लोरोफिल एकाग्रता के लिए दृढ़ संकल्प के साथ आगे बढ़ना.

4. क्लोरोफिल एकाग्रता 31 का निर्धारण

  1. क्लोरोफिल राशि के निर्धारण के लिए 80% एसीटोन के साथ किया जाता है.
  2. 995 μl 80% एसीटोन और H6 बफर में thylakoids के 5 μl (कमजोर पड़ने 1:200) मिलाएं.
  3. कई सेकंड के लिए भंवर कोई हरा कणों रहना और फिर 5 मिनट के लिए 14.1 XG पर नीचे स्पिन जब तक.
  4. सतह पर तैरनेवाला लो और क्रमश: 663.6 और 646.6 एनएम और 750 एनएम पर विलुप्त होने का उपाय.
  5. निम्न सूत्रों का उपयोग क्लोरोफिल राशि की गणना:
    1. सी Chl एक [मिलीग्राम / एमएल] = (0.01225 * ई 663.6-0.00255 * ई 646,6) * कमजोर पड़ने कारक
    2. सी Chl बी [मिलीग्राम / एमएल] = (0.02031 * ई 646.6-0.00491 * ई 663.6) * कमजोर पड़ने कारक
    3. सी Chl [मिलीग्राम / एमएल] = सी Chl एक सी Chl बी

5. Photosystem सुक्रोज gradients घनत्व का लोड

  1. जरूरत है कि thylakoids, β-डीएम और एच 6 बफर की मात्रा की गणनाप्रत्येक ढाल के लिए:
    1. प्रत्येक ढाल 0.9% β-डीएम (एच 2 ओ में β-डीएम भंग) में 0.8 मिलीग्राम / एमएल क्लोरोफिल के साथ 700 μl की कुल मात्रा के साथ लोड किया जाना चाहिए, H6 बफर के साथ शेष मात्रा को भरने.
  2. Solubilization के लिए प्रत्येक ढाल के लिए thylakoids, β-डीएम और एच 6 बफर के साथ अलग aliquots तैयार करते हैं.
  3. नियमित रूप से (inverting) हर कुछ मिनट (solubilization कदम) के मिश्रण के साथ बर्फ पर 20 मिनट के लिए नमूने छोड़ दें.
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अधिकतम गति (14,000 XG) पर अपकेंद्रित्र
    (सतह पर तैरनेवाला काले हरी है, जबकि Centrifugation के बाद, गोली छोटे और सफेद होना चाहिए.)
  5. ढ़ाल पर सतह पर तैरनेवाला लोड करें.
  6. H6 बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर (14 घंटे) रातोंरात 134,470 XG पर ultracentrifuge का उपयोग स्पिन के साथ संतुलन
    (Usin जब इस प्रोटोकॉल के रूप में पेश प्रकाशतंत्र सुक्रोज gradients घनत्व का उपयोग संश्लेषक परिसरों की सफल जुदाई ही हासिल की है कि कृपया ध्यान देंsolubilization और जटिल अलग होने के लिए एक भविष्यवाणी से पहले जमे हुए किया गया है कि thylakoid झिल्ली के साथ जब काम करना मुश्किल है क्योंकि जी हौसले, thylakoids पृथक.)

6. Photosystem सुक्रोज gradients घनत्व का fractionation

  1. ढ़ाल की तस्वीरें ले लो.
  2. 500 μl ट्यूब में एक सुई और fractionate ढ़ाल का उपयोग ट्यूब के नीचे एक छेद पंचर. वैकल्पिक रूप से, विभाजन भी एक 96 अच्छी तरह से थाली (microplate) का उपयोग करके किया जा सकता है.
  3. एक microplate का उपयोग करते समय, 675 एनएम पर अलग ढाल अंशों के absorbance निर्धारित करते हैं.
    (यह कदम नमूनों में कुछ सप्ताह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.)

7. एसडीएस पृष्ठ और Immunodetection

(केवल ΔPSI बनाम गुम्मट की तुलना के लिए एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण बाद एमएस विश्लेषण के लिए भिन्न चयन करने के लिए प्रदर्शन किया गया है कि कृपया ध्यान दें. प्रयोग के लिए WT बनाम pgrl1 frकार्यों विभिन्न भागों में absorbance के माध्यम से चुने गए हैं.)

  1. एक 13% एसडीएस polyacrylamide जेल में 32 पर WT और ΔPSI ढाल से प्रत्येक अंश की अलग 30 μl.
  2. ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, कैस 6, साई सबयूनिट psad 32 और PSII कोर सबयूनिट डी 1: निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण 33 कार्य करें. 1:10,000 के कमजोर पड़ने के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए जो डी 1 एंटीबॉडी, के लिए छोड़कर (बढ़ाया chemiluminescence पहचान तकनीक के लिए) 1:1,000 के कमजोर पड़ने के साथ सभी एंटीबॉडी का प्रयोग करें.
  3. Immunodetection के परिणामों के आधार पर, गुम्मट और ΔPSI के लिए ANR1, PGRL1 और psad के शिखर भिन्न (क्रमशः यहां भिन्न 6 और 13,) ले WT और ΔPSI से अंश 6 की 30 μl मिश्रण और अंश 13 से साथ भी ऐसा ही दोनों की तैयारियाँ और एक 13% एसडीएस polyacrylamide जेल पर फिर से उन्हें अलग.
  4. गुम्मट बनाम pgrl1 की मात्रात्मक तुलना के लिए ले गअलग ढाल भागों में absorbance को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है और एक 13% एसडीएस polyacrylamide जेल पर जुदाई द्वारा पीछा दोनों नमूने के 30 μl मिश्रण के रूप में एफई supercomplex भिन्न.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर या अधिक रात 2 घंटे के लिए Coomassie समाधान (85% फॉस्फोरस एसिड, 757 मिमी अमोनियम सल्फेट, 1.2% Coomassie शानदार नीले, 20% मेथनॉल) के साथ प्रोटीन बैंड दाग
  6. Unspecific धुंधला निकालने के लिए, DDH 2 ओ के साथ कई बार धोना
  7. 1 मिमी जेल टुकड़ों में गलियों में कटौती और में जेल पाचन के साथ आगे बढ़ना.
    (वैकल्पिक रूप से, नमूने एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में कुछ ही मिनटों के सूखे और में जेल पाचन के साथ जारी रखने से पहले कुछ हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है.)

8. में जेल पाचन (Shevchenko एट अल. 35 से संशोधित)

कुछ ही देर में उपयोग करने से पहले सभी buffers और समाधान तैयार करने और acetonitrile (ACN) युक्त बफ़र्स के लिए कांच की बोतलें लेने के लिए कृपया ध्यान दें. <br /> चेतावनी! ACN के साथ कार्य करना हानिकारक हो सकता है, अधिक जानकारी से डाउनलोड किया जा सकता है: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

  1. 30 सेकंड के लिए DDH 2 ओ (~ 200 μl) के> 10 संस्करणों के साथ जेल टुकड़े धो लें.
  2. , झटकों के साथ 15 मिनट के लिए 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 की 300 μl के साथ जेल टुकड़े सेते तरल हटा दें.
  3. , झटकों के साथ 15 मिनट के लिए (1:1 के अनुपात में ACN और 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 के मिश्रण से तैयार) तरल निकालने के 50% ACN में 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 की 300 μl के साथ जेल टुकड़े सेते हैं.
  4. जेल टुकड़े अभी भी नीले हैं, तो Coomassie के सबसे निकाले जाने तक एनएच 4 HCO 3 और एनएच 4 HCO 3 / ACN washes दोहराएँ.
    (Coomassie धुंधला के थोक हटा दिया जाना चाहिए हालांकि, यह पूरी तरह से जेल टुकड़े destain करने के लिए आवश्यक नहीं है.)
  5. 5 मिनट के लिए जेल टुकड़े निर्जलीकरण ACN के 100 μl जोड़ें. जेल टुकड़े एक हटना चाहिएएन डी पूरी तरह से सफेद दिखेगा.
  6. जितना संभव हो उतना ACN निकालें और trypsin पाचन के साथ आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप से, नमूने कुछ हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  7. 20 एनजी के बैंड प्रति 10-20 μl जोड़ें / 10% में trypsin μl ACN / 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 (हौसले से पतला), बर्फ पर नमूने रहते हैं.
  8. 30 मिनट बाद सभी समाधान समाहित कर लिया गया है, तो जाँच करें और यदि आवश्यक हो, अधिक trypsin बफर जोड़ें. जेल टुकड़े पूरी तरह से trypsin बफर के साथ कवर किया जाना चाहिए. बर्फ पर नमूने रखें.
  9. Trypsin के साथ उन्हें तर करने के लिए बर्फ पर एक और 90 मिनट के लिए जेल टुकड़े छोड़ दें.
    (महत्वपूर्ण कदम: tryptic पेप्टाइड्स की उपज शायद क्योंकि polyacrylamide मैट्रिक्स में एंजाइम की धीमी प्रसार की, बर्फ पर ऊष्मायन बार बढ़ाने के साथ काफी बढ़ जाती है इसे से बचने के लिए जेल टुकड़े को कवर समाधान की एक छोटी अतिरिक्त है करने के लिए आवश्यक है कि टुकड़े. रात ऊष्मायन के दौरान शुष्क गिर जाते हैं.)
  10. 4-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर डाइजेस्ट. आवश्यकता के प्रयोगों के लिएअधिक से अधिक पेप्टाइड वसूली, रात भर पचाने.
  11. पाचन के बाद गाढ़ा बफर नीचे स्पिन.
  12. 5 मिनट के लिए Sonicate ट्यूबों फिर पेप्टाइड्स और अपकेंद्रित्र elute करने के लिए.
  13. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक नया ट्यूब को हस्तांतरण.
  14. 15 मिनट के लिए एक ध्वनि स्नान में 30% ACN / 1% चींटी एसिड (एफए) के 80 μl के साथ पेप्टाइड निष्कर्षण प्रदर्शन.
  15. 15 मिनट के लिए एक ध्वनि स्नान में 30% ACN / 1% एफए के 80 μl के साथ निष्कर्षण प्रदर्शन.
  16. 15 मिनट के लिए एक ध्वनि स्नान में 70% ACN / 1% एफए के 80 μl के साथ निष्कर्षण प्रदर्शन.
  17. पूर्व eluate के साथ फिर से और पूल सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र.
    (एफए trypsin निष्क्रिय और पेप्टाइड विलेयता बढ़ाने के लिए कार्य करता है.)
  18. पूरी तरह से एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में सूखी पेप्टाइड समाधान.
    (इस बिंदु पर नमूने एमएस विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस में कुछ सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.)
  19. 6 μl एमएस बफर (5% ACN, 0.1 वी / वी एफए, पानी) और 2-5 मिनट के लिए sonicate में Resuspend पेप्टाइड्स.
  20. Maximu नमूने अपकेंद्रित्रएम गति 5 मिनट के लिए सामग्री कण को ​​हटाने के लिए.
  21. बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला के 4 μl का प्रयोग करें.

9. "Proteomatic" के साथ एमएस डेटा विश्लेषण

डेटा विश्लेषण खुला स्रोत सॉफ्टवेयर (http://www.proteomatic.org/ पर डाउनलोड किया जा सकता है) "Proteomatic", पीढ़ी और एमएस / एमएस डेटा मूल्यांकन पाइपलाइनों के पूरा होने का उपयोग करके की अनुमति देता है कि एक मंच के साथ प्रदर्शन किया गया था स्वतंत्र और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर 36. संक्षेप में, सेटिंग नीचे वर्णित हैं और अधिक विस्तृत जानकारी 6,26 में पाया जा सकता है.

  1. एमएस डेटा की पहचान और मात्रा का ठहराव
    ΔPSI बनाम प्रयोगों गुम्मट से पहचान और प्रोटीन की मात्रा का ठहराव 6,26 के रूप में वर्णित, OMSSA (संस्करण 2.1.4 37) और क्रमशः qTrace 26, के साथ किया गया. निम्नलिखित अद्यतन पाइपलाइन pgrl1 प्रयोग गुम्मट बनाम से एमएस डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था:
    1. OMSSA 37 के अलावा, प्रोटीन भी एक्स के साथ पहचान की गई! एस्फाल्ट (संस्करण 2013/02/01 38). दोनों एल्गोरिदम एन सी बी आई की एक में शामिल हो गए डेटाबेस के खिलाफ ऑगस्टस डेटाबेस संस्करण 10.2 और साथ ही साथ JGI Chlamydomonas जीन मॉडल डेटाबेस संस्करण 4.3 के संयोजन से उत्पन्न एक डाटाबेस के खिलाफ खोज के द्वारा लागू किया गया BK000554.2 और NC_001638.1 डेटाबेस.
    2. पेप्टाइड्स के एमएस 2 पहचान एक लक्ष्य फंदा दृष्टिकोण 39 का उपयोग करके किया गया था. प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक फंदा nonproteotypic पेप्टाइड्स के अतिरेक को बनाए रखना है, जबकि बेतरतीब ढंग से tryptic पेप्टाइड्स फेरबदल द्वारा बनाया गया था.
    3. पेप्टाइड्स के सांख्यिकीय सत्यापन कम से कम 0.01 और परिणाम 5 पीपीएम के एक अग्रदूत जन सहिष्णुता के साथ फ़िल्टर किया गया की एक पीछे त्रुटि संभावना (पीईपी) सीमा का उपयोग सॉफ्टवेयर qvality (संस्करण 0.3.3 40) के साथ प्रदर्शन किया गया था.
    4. OMSSA और एक्स से पेप्टाइड्स! एस्फाल्ट रन qTrace साथ शामिल हो गए और मात्रा निर्धारित किया गया 2 पहचान की आवश्यकता प्रोटीन नाम / समूह जानकारी जोड़ सकते हैं और दोनों बहन पेप्टाइड्स की आवश्यकता होती है.

प्रोटीन के अनुपात WT और pgrl1 से मिश्रित CEF-supercomplex भागों में एक दूसरे के प्रति काफी अलग थे कि क्या जांच करने के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर SPSS (संस्करण 21) को लागू करने का प्रदर्शन किया गया था. साइटोक्रोम बी 6 / एफ परिसर के सब यूनिटों को एक दूसरे के साथ ही प्रोटीन एफ एन आर, FTSH2 और साई सब यूनिटों के खिलाफ HCF136 के खिलाफ जांच कर रहे थे. सभी चार replicates की प्रोटीन प्रति प्रत्येक स्कैन की गिनती की पेप्टाइड अनुपात शापिरो-विल्क्स परीक्षण के साथ सामान्य वितरण के लिए परीक्षण किया गया. पेप्टाइड आबादी सामान्य रूप से (पी <0.001) वितरित नहीं किए गए थे, आँकड़े nonparametric प्रदर्शन किया गया. सबसे पहले, Kruskal वालिस परीक्षण समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण विचलन का आकलन करने के लिए आवेदन किया था. इस परीक्षण महत्वपूर्ण अंतर भविष्यवाणी केवल अगरसमूहों के बीच है, आगे के विश्लेषण के मान व्हिटनी यू टेस्ट मैच के साथ दो स्वतंत्र समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर की भविष्यवाणी करने के लिए किया गया था.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पेश मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से अलग सी में CEF-supercomplex घटकों के तुलनात्मक विश्लेषण के द्वारा प्रदर्शन thylakoid झिल्ली में multiprotein परिसरों की रचना विशेषताएँ करना उपभेदों reinhardtii. वर्णित विधि सफलतापूर्वक Terashima एट अल. 6 से लागू है और डिटर्जेंट solubilization द्वारा पीछा अवायवीय बड़े हो संस्कृतियों से thylakoid झिल्ली के अलगाव शामिल किया गया है. बाद में, नमूने बराबर क्लोरोफिल राशि पर आधारित एक सुक्रोज घनत्व ढाल पर लोड कर रहे हैं और परिसरों ultracentrifugation द्वारा fractionated रहे हैं. मात्रात्मक एमएस विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकारों से दो ढाल अंशों की बराबर मात्रा में मिलाया जाता है और अपेक्षाकृत चित्रा (1) विश्लेषण कर रहे हैं. परिणाम प्रस्तुत गुम्मट cw15-arg7 और ΔPSI के साथ ही क्रमश गुम्मट cc124 और pgrl1, बीच CEF-supercomplex अंश की तुलना में शामिल हैं.

(आंकड़े 2A और 2 बी) 6 चुने गए हैं. 3 कई साई कोर और LHCI प्रोटीन (भी Lhca प्रोटीन के रूप में नाम साई के प्रकाश कटाई प्रोटीन) और साथ ही के लिए WT / ΔPSI (14 एन / 15 एन) के रूप में रिश्तेदार प्रोटीन के अनुपात को दर्शाया गया चित्र CEF-supercomplex साथ सौंपा प्रोटीन के लिए. जैसी कि उम्मीद थी, साई कोर प्रोटीन केवल दोनों भागों में अनंत अनुपात द्वारा प्रदर्शन गुम्मट के नमूने में पाए जाते हैं. Lhca4 -6 और दोनों भागों में एक अलग नियमन दिखाने -8 जबकि Lhca2 और Lhca9, गुम्मट में समृद्ध है. यह LHCI प्रोटीन ΔPSI उत्परिवर्ती 41 में संश्लेषित और सामान्य रूप से जमा कर रहे हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. साई LHCI की पॉलीपेप्टाइड तुलनासी. से जटिल ΔPSI उत्परिवर्ती की LHCI जटिल साथ reinhardtii गुम्मट Lhca2 के बहुमत, -3 और -9 केवल कमजोर LHCI करने के लिए बाध्य है और इसके अलावा साई कोर की उपस्थिति एक स्थिर बाइंडिंग के लिए आवश्यक है कि प्रतीत हो रहा है कि पता चला. इसके विपरीत, Lhca1, -4, -6, -7, और -8 मौजूद प्रयोग में अलग Lhca4 के नियमन, -6 और -8 समझा सकता है, जो साई की 14 विधानसभा का एक जटिल स्वतंत्र रूप में.

CEF-supercomplex साथ सौंपा जा करने के लिए प्रोटीन के लिए, यह अंश 6 के लिए एक से अधिक अनुपात द्वारा प्रदर्शित एक मजबूत साई पर निर्भर प्रवास दिखा, गुम्मट अंश 6 और ΔPSI उत्परिवर्ती का अंश 13 में प्रचुर मात्रा में हैं कि उन दोनों के बीच प्रतिष्ठित किया जा सकता है से अनुपात कम एक या नहीं अंश 13 में पाया (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, कैस, PFD, HCF136 और CYT च) और इस तरह एक मजबूत, लेकिन फिर भी एक साई पर निर्भर स्थानीयकरण (एफ एन आर, FTSH1, FTSH2, और ATPC नहीं दिखा उन ).

इस प्रयोग के साथ Terashima एट अल. 6 CEF-supercomplex के उपन्यास प्रोटीन, पहले 7 की पहचान के रूप में नहीं है, जिससे उन्हें खुलासा ANR1 और कैस (आंकड़े 2A-D और चित्रा 3) के लिए एक साई पर निर्भर प्रवास व्यवहार का प्रदर्शन किया. एमएस विश्लेषण का निष्कर्ष भी immunodetection से इसकी पुष्टि की और इन विवो 6 में CEF के लिए इन प्रोटीनों की एक कार्यात्मक भूमिका की पुष्टि करने के लिए रिवर्स आनुवंशिकी के आवेदन के द्वारा समर्थित थे. इसके अलावा, इस तुलनात्मक एमएस दृष्टिकोण दृढ़ता से पहले ही इस तरह दिखाने के लिए PGRL1, CYT एफ और एफ एन आर 7, साथ ही Lhcbm5 7,9 के रूप में CEF-supercomplex का हिस्सा बनने के लिए प्रदर्शन किया गया है कि प्रोटीन की पुष्टि करके, पिछले अध्ययनों से परिणाम का समर्थन करता है ANR1 और कैस के बराबर है जो सुक्रोज घनत्व ढाल, में एक साई पर निर्भर स्थानीयकरण.

अंश 6 और anr1 और ΔPSI की 13 की तुलना में एक ही approac का उपयोगज (चित्रा S8 6 देखें) anr1 में CEF-supercomplex और ΔPSI बनाम प्रयोग गुम्मट में पता चला प्रोटीन ANR1, कैस और PGRL1 के लिए इसी प्रवृत्ति की एक ऐसी संरचना का प्रदर्शन किया. (Anr1 बनाम ΔPSI) अंश 6 में ANR1 के प्रोटीन अनुपात ΔPSI प्रयोग बनाम गुम्मट के अनुपात के बराबर है, हालांकि उल्लेखनीय है कि, कैस और PGRL1 की मात्रा पूर्व प्रयोग में अधिक होने की और की वजह से हो सकता है लगते ANR1 6 के नीचे विनियमन के लिए compensating.

इसके अलावा, CEF-supercomplex अंश में ANR1 और कैस के संवर्धन एक भी इस प्रयोग से कई अन्य प्रोटीन के साई पर निर्भर प्रवास परिणाम निकालना सकता है. ये क्लोरोप्लास्ट में PSII प्रतिक्रिया केंद्र प्रोटीन डी 1 की गिरावट में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं कि दो एटीपी निर्भर metalloproteases FTSH1 और FTSH2 हैं 42,43, एक महत्वपूर्ण स्थिरता के लिए कारक या है जो एक prefoldin डोमेन युक्त प्रोटीन, HCF136, assembPSII 44 के भंडारण और ATPase के γ सबयूनिट. बाद में एक के लिए, अंश 6 और 13 के बीच के अनुपात में इस तरह के एक स्पष्ट अंतर नहीं दिखा है, जबकि आगे के प्रयोगों के अन्य प्रोटीन भी CEF-supercomplex के उम्मीदवार हो सकता है कि क्या सत्यापित करने के लिए बाहर ले जाने के लिए है.

इस तुलनात्मक दृष्टिकोण के लिए अवधारणा प्रयोग के प्रमाण के रूप में, हम इस जटिल के गठन की अनुमति, दोनों साई है जो दो उपभेदों में CEF-supercomplex संरचना का विश्लेषण किया. संबंधित भिन्न fractionated ढ़ाल के absorbance माप के आधार पर चयन किया गया था. -4 ए के आंकड़े और 4 बी WT और एक pgrl1 नाक आउट तनाव के बीच मात्रात्मक तुलना के लिए परिणाम दिखाते हैं. यह ANR1 और कैस उल्लेखनीय WT और pgrl1 के बीच नहीं बदल रहे हैं कि बताया जाना चाहिए. FTSH2 pgrl1 में समृद्ध होने लगता है दिलचस्प है, जबकि HCF136, गुम्मट में समृद्ध किया जा रहा है. एक सांख्यिकीय सी(LHCI प्रोटीन सहित) सभी साई सब यूनिटों को aforementioned प्रोटीन दोनों के लिए gnificant अंतर की पुष्टि की जा सकता है.

इसके अलावा, साइटोक्रोम बी 6 / एफ जटिल सब यूनिटों च CYT और PETO क्रमशः CYT बी 6, CYT बी 6 / एफ चतुर्थ और PETC, को काफी अलग होना दिखाया गया है. विशेष रूप से, CYT च CYT बी 6 और CYT बी 6 / एफ चतुर्थ थोड़ा नीचे विनियमित रहे हैं, जबकि CYT च संश्लेषण के विनियमन शायद CYT बी 6 और CYT बी 6 / एफ चतुर्थ 45 शामिल है, हालांकि, pgrl1 में विनियमित अप किया जा रहा है . भी Rieske प्रोटीन के रूप में जाना जाता है जो परमाणु इनकोडिंग PETC, CYT बी 6 और CYT ख के रूप में एक समान विनियमन पता चलता 6 / एफ चतुर्थ (pgrl1 में यानी एक नीचे विनियमन). इस Rieske प्रोटीन की कमी या अनुपस्थिति के रूप में हड़ताली है अभी भी अन्य संगठनों के संचय के लिए नेतृत्वएर CYT बी 6 / एफ सब यूनिटों को ~ सी में गुम्मट स्तर के 60% reinhardtii 46. इस शिथिल बाध्य सबयूनिट सी. में स्तर कम करने के लिए जमा करने के लिए दिखाया गया था के बाद से ही, pgrl1 में PETO के ऊपर विनियमन, नोट करना महत्वपूर्ण है reinhardtii मौजूद प्रयोग में गुम्मट की तुलना pgrl1 में कम प्रचुर मात्रा में हैं जो CYT बी 6, CYT बी 6 / एफ चतुर्थ या PETC 47, या तो कमी म्यूटेंट.

चित्रा 1
चित्रा 1. गुम्मट और ΔPSI के लिए दर्शाया के रूप में प्रायोगिक कार्यप्रवाह. कोशिकाओं metabolically कम से कम चार पीढ़ियों के लिए चिह्नित कर रहे हैं, anaerobic परिस्थितियों 4 घंटे के लिए आर्गन बुदबुदाती द्वारा प्रेरित कर रहे हैं और thylakoid झिल्ली ढाल जुदाई के माध्यम से अलग कर रहे हैं. Isolaटेड झिल्ली एक सुक्रोज घनत्व ढाल (दोनों उपभेदों के लिए क्लोरोफिल के बराबर मात्रा में इस चरण में लागू कर रहे हैं) पर लादा और रातोंरात centrifuged, β-डीएम का उपयोग solubilized रहे हैं. ढाल भिन्न एसडीएस पृष्ठ के रूप में अच्छी तरह से ढाल भीतर प्रोटीन का वितरण निर्धारित करने के लिए immunodetection द्वारा एकत्र की है और विश्लेषण कर रहे हैं. एक साई पर निर्भर प्रवास, गुम्मट CEF-supercomplex अंश (अंश संख्या 6) के बराबर मात्रा और ΔPSI तनाव से इसी 15 एन लेबल अंश के साथ प्रोटीन की पहचान करने के लिए मिश्रित थे और अपेक्षाकृत विश्लेषण किया. एक ही ΔPSI तनाव (अंश संख्या 13) में ANR1 के शिखर अंश के साथ किया गया था. तुलनात्मक, मात्रात्मक एमएस दृष्टिकोण के लिए, मिश्रित प्रोटीन के नमूने प्रोटीन बैंड पूर्व एमएस विश्लेषण करने में जेल पाचन द्वारा पीछा किया, Coomassie नीले समाधान के साथ दाग रहे थे, एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे. बड़ा आईएमए देखने के लिए यहां क्लिक करेंजीई.

चित्रा 2
चित्रा 2. ANR1 और कैस ΔPSI तनाव में कम घनत्व क्षेत्रों की ओर पलायन. एक:. अवायवीय स्थितियों से अलग WT और ΔPSI thylakoids की सुक्रोज gradients घनत्व 20 भागों में विभाजित किया गया बी: WT और ΔPSI से ढाल का 20 भागों में ANR1 की Immunodetection. इस प्रोटीन गुम्मट में उच्च घनत्व क्षेत्र के लिए स्थानीय है जबकि (अंश 6) यह ΔPSI तनाव (अंश 13) में कम घनत्व क्षेत्रों में स्थानांतरित कर दिया अप है सी:. WT और ΔPSI की सुक्रोज gradients घनत्व से अलग thylakoids अवायवीय स्थितियों 27 भागों में विभाजित किया गया है: डी. कैस के Immunodetection WT और ΔPSI से ढाल का 27 भागों में. इस प्रोटीन टी स्थानीय है जबकिओ (अंश 7 चारों ओर बढ़ता जा) WT में उच्च घनत्व क्षेत्र में यह (अंश 19 के आसपास बढ़ता जा) ΔPSI तनाव में कम घनत्व क्षेत्रों में स्थानांतरित कर दिया ऊपर है. (यह आंकड़ा Terashima एट अल. 6 से संशोधित किया गया है). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. सापेक्ष प्रोटीन अंश 6 में निर्धारित अनुपात और मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा WT और ΔPSI से 13. भिन्न 6 और गुम्मट से 13 से 15 एन लेबल ΔPSI तनाव से संबंधित भागों के साथ तुलना की गई है. के रूप में wt / ΔPSI (14 दो जैविक replicates और तीन एमएस रन का प्रतिनिधित्व करते हैं कि सापेक्ष प्रोटीन अनुपात चित्रित कर रहे हैंदोनों के लिए एन / 15 एन) के ही अंश 6 में पहचान की थी जो CYT एफ, के अपवाद के साथ अंशों का विश्लेषण किया. यह तुलनात्मक मात्रा का ठहराव ANR1 और कैस (यह आंकड़ा Terashima एट अल. 6 से संशोधित किया गया है). सुक्रोज घनत्व ढाल में एक साई पर निर्भर प्रवास दिखाने पता चलता है कि बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा CEF-supercomplex गुम्मट के अंश और pgrl1 में निर्धारित सापेक्ष प्रोटीन अनुपात. एक: anaerobic परिस्थितियों से अलग सुक्रोज गुम्मट के gradients घनत्व और pgrl1 thylakoids बी:. सापेक्ष प्रोटीन अनुपात between चार अलग replicates से stemming CEF-supercomplex अंश दर्शाया wt / pgrl 1 (14 एन / 15 एन) के रूप में. FTSH2 और HCF136 लाल में *** द्वारा संकेत के रूप में 0,001 ≤ सभी साई सब यूनिटों (पी की तुलना में काफी अंतर दिखा रहे हैं, जबकि इस प्रयोग में ANR1 और कैस उल्लेखनीय है, नहीं बदल रहे हैं; HCF136: 1900 <यू <58,127; FTSH2: 2117 <यू <164,197). इसके अतिरिक्त, CYT बी 6 / एफ जटिल सब यूनिटों च CYT और नीले रंग में *** से संकेत के रूप PETO CYT बी 6 0,001 ≤ क्रमश: CYT बी 6 / एफ चतुर्थ और PETC, (पी से काफी अलग होना दिखाया गया है, CYT च : 2684 <यू ​​<11535, PETO:. 4700 <यू <23663) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग विभिन्न मात्रात्मक प्रोटिओमिक पढ़ाई पिछले साल में प्रकाशित किया गया है. इन प्रयोगों में आमतौर पर दो अलग नमूने एक नमूना एक स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल है, जिनमें से तुलना कर रहे हैं. इसके बाद दो नमूनों से प्रोटीन या पेप्टाइड्स एक समान अनुपात में संयुक्त रहे हैं और आगे एक साथ 48 संसाधित. इस तरह के अध्ययन अक्सर जांच करने के लिए अलग तनाव की स्थिति 26,34,49 के संपर्क में परिभाषित अलग सेलुलर डिब्बों (जैसे क्लोरोप्लास्ट, mitochondria, या thylakoid झिल्ली) की तुलना करने का इरादा ऊपर या नीचे विनियमन विशिष्ट प्रोटीन की. वर्णित तुलनात्मक, मात्रात्मक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण thylakoid झिल्ली में multiprotein परिसरों की संरचना का विश्लेषण करना है और, aforementioned पढ़ाई के विपरीत, पहले बराबर क्लोरोफिल एकाग्रता पर लोड thylakoid झिल्ली की सुक्रोज घनत्व जुदाई के बाद नमूनों के समान मात्रा के मिश्रण पर आधारित है ultracentrifugation. इस पद्धति को प्रभावी ढंग से अपेक्षाकृत एक गुम्मट और एक sucrose घनत्व ढाल में साई dependently पलायन प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक ΔPSI तनाव से अलग CEF-supercomplex की संरचना का विश्लेषण किया जो Terashima एट अल. 6 से लागू किया गया था.

इस रणनीति की उपलब्धि एमएस परिणाम आगे immunodetection द्वारा समर्थन कर रहे हैं कि इस तथ्य से साबित हो रहा है. इसके अतिरिक्त, Terashima एट अल. पिछले अध्ययनों से निष्कर्षों की पुष्टि कर सकता है (यानी पहले से ही इस तरह के PGRL1, एफ एन आर, और CYT च रूप में 7 CEF-supercomplex का हिस्सा होना बताया प्रोटीन की पहचान और साई पर निर्भर माइग्रेशन). CEF-6 मशीनरी के उपन्यास घटकों के रूप में ANR1 और कैस की पहचान एक बहुत शक्तिशाली और कुशल उपकरण के रूप में इस दृष्टिकोण का पता चलता है. विशेष रूप से, इन विट्रो गतिविधि में प्रदर्शित पृथक CEF-supercomplex, जिससे एक समारोह के सफल शुद्धि का प्रदर्शन6 multiprotein जटिल राष्ट्रीय. इस दृष्टिकोण की प्रयोज्यता भी, जिनमें से दो उपभेदों के लिए एक CEF-supercomplex WT और pgrl1 के बीच तुलना द्वारा प्रदर्शन किया है फार्म दोनों.

CEF-supercomplex अंश (यानी में FTSH1, FTSH2, PFD, और HCF136 के संवर्धन के साथ copurified रहे हैं कि पहले से अज्ञात प्रोटीन की पहचान से पता चला सामान्य में, इस विधि अलग उपभेदों या परिस्थितियों में जटिल रचनाओं सर्वेक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है CEF-supercomplex अंश). इन प्रोटीनों इस परिसर के संभावित नए उम्मीदवार हैं और गुम्मट और pgrl1 की तुलना से पता चला FTHS2, HCF136 के विभिन्न विनियमन के लिए हमारी समझ में सुधार, और साथ ही CYT बी 6 / एफ सब यूनिटों के लिए करना है या नहीं, आगे के प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं.

इस दृष्टिकोण से वर्णित लाभों के अलावा, तोड़ रहे हैंइस प्रोटोकॉल के साथ कार्य करते समय सावधानी से विचार करने की आवश्यकता है कि अल महत्वपूर्ण कदम: छिटकानेवाला के साथ कोशिकाओं के टूटने पहला महत्वपूर्ण कदम है. कोशिकाओं के उद्घाटन के एक उचित तरीके से बाहर नहीं किया जाता है, तो पृथक thylakoids की उपज के बजाय कम हो जाएगा और अधिक रात Centrifugation के बाद CEF-supercomplex का शायद ही कोई पता लगाने में परिणाम हो सकता है. कोशिकाओं के सफल व्यवधान Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला के हल्के हरे रंग से अनुमान लगाया जा सकता है. सेल व्यवधान के दौरान दबाव बहुत अधिक है इसके विपरीत, यदि, supercomplex के कुछ हिस्सों में बिखर सकता है और महत्वपूर्ण cofactors खो दिया जा सकता है. Thylakoids की उपज को प्रभावित एक और कदम एक कुम्हार के साथ कोशिकाओं का मेजबान है. यह सावधानी से कार्य शुरू हो गया है और इस चरण के अंत में केवल कुछ हरे रंग के कणों रहना चाहिए. सुक्रोज घनत्व की तैयारी झिल्ली परिसरों की solubilization के लिए और साथ ही पहले दिन gradients के लिए इसके अलावा, यह बहुत महत्वपूर्ण हैइस CEF-supercomplex की शुद्धि के लिए भी इसलिए पूरी तरह से solubilized thylakoids 50 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है और बाद ठीक, β-डीएम एकाग्रता के मामले में इस प्रोटोकॉल का पालन करें. एक छोटे, सफेद गोली बाद centrifugation कदम के बाद मनाया जाता है solubilization कदम सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है. यहां उल्लेख किया जाना चाहिए कि एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु पर रात ultracentrifugation का समय है. सुक्रोज gradients घनत्व संश्लेषक परिसरों की पूर्ण जुदाई को प्राप्त करने के लिए कम से कम बारह घंटे के लिए centrifuged किया जाना चाहिए.

प्रोटोकॉल सी. का उपयोग प्रदर्शन किया है हालांकि दो आनुवंशिक रूप से विभिन्न प्रकारों में CEF-supercomplex रचना के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए reinhardtii, यह इस तरह के अलग पर्यावरण / प्रायोगिक से अलग multiprotein जटिल संरचना के तुलनात्मक विश्लेषण के रूप में अन्य सवालों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए भी आसानी से अनुकूल हैस्थितियां या विभाजन के अन्य प्रकार का उपयोग करके. इस दृष्टिकोण से केवल आवश्यकताओं मॉडल जीव सेल संस्कृति में खेती की जा सकती है, इस पद्धति की एक विस्तृत आवेदन का प्रदर्शन, सूक्रोज gradients घनत्व द्वारा अलग किया जा सकता नाइट्रोजन स्रोत और प्रोटीन परिसरों के रूप में अमोनियम उपयोग करने में सक्षम है कि कर रहे हैं. मिश्रित 14 एन / 15 एन नमूने और बाद में जेल पाचन के इस दृष्टिकोण एसडीएस पृष्ठ fractionation के भविष्य के आवेदन के लिए फिल्टर सहायता प्राप्त नमूना तैयार (FASP) पद्धति लागू करने के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है. एक में जेल विचार करना चाहिए कि हालांकि इस विधि, पाचन से पहले proteome "साफ" करने के लिए और शुद्ध पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए, पेप्टाइड वसूली को बाधित कर सकते हैं कि में जेल पाचन दृष्टिकोण के नुकसान को रोकने के लिए लक्ष्य solubilization के लिए मजबूत डिटर्जेंट के आवेदन भी शामिल है पाचन पाचन 51 के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि संदूषण के लिए मजबूत होना बताया है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित की घोषणा.

Acknowledgments

महाराष्ट्र "ड्यूश Forschungsgemeinschaft" (DFG) से समर्थन मानता है. लेखक योगदान: महाराष्ट्र अनुसंधान बनाया गया, के.टी., जे एस और मीट्रिक टन अनुसंधान प्रदर्शन और डेटा का विश्लेषण, के.टी. और महाराष्ट्र पत्र लिखा था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acetic acid AppliChem A0662 http://www.applichem.com/home/
Acetone AppliChem A2300 http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MS Diagonal 9340 Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions.

https://www.diagonal.de/
Ammonium chloride 15N Cambridge Isotope Laboratories 39466-62-1 http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14N AppliChem A0988 http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate  AppliChem A3583 http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate  AppliChem A3598 http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250 Fisher Scientific 10041653 http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside AppliChem A0819 http://www.applichem.com/home/
EDTA AppliChem A2937 http://www.applichem.com/home/
Formic acid   AppliChem A3858 http://www.applichem.com/home/
HEPES AppliChem A3724 http://www.applichem.com/home/
Magnesium chloride AppliChem A4425 http://www.applichem.com/home/
Methanol AppliChem A2954 http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acid AppliChem A0989 http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate  AppliChem A1042 http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate  AppliChem A1043 http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxide AppliChem A1551 http://www.applichem.com/home/
Sucrose AppliChem A1125 http://www.applichem.com/home/
Tricine AppliChem A3954 http://www.applichem.com/home/
Tris AppliChem A2264 http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer Promega V5111 http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor) Glas-Col http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm)  Beckman Coulter 331372 for preparation of Takahashi style gradients

http://www.beckmancoulter.de/
Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm
 Beckman Coulter 344058 for preparation of thylakoid isolation gradients.

http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP Beckman Coulter http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber Diagonal 449/72 https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml  Fisherbrand 10618242 http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizer Fisherbrand 105252220 http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies  Agrisera http://www.agrisera.com/en/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
  2. Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
  3. Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
  4. Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
  5. Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
  6. Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
  7. Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
  8. Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
  9. Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
  10. Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
  11. Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
  12. Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
  13. Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
  14. Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
  15. Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
  16. Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
  17. Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
  18. Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
  19. Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
  20. Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
  21. Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
  22. Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
  23. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
  24. Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
  25. Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
  26. Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
  27. Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
  28. DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
  29. Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
  30. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
  31. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
  32. Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
  33. Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
  34. Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
  37. Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
  38. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  39. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  40. Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
  41. Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
  42. Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
  43. Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
  44. Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
  45. Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
  46. de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
  47. Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
  48. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
  49. Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
  50. Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
  51. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).

Tags

सूक्ष्म जीव विज्ञान अंक 85 sucrose gradients घनत्व Chlamydomonas multiprotein परिसरों, thylakoids
Multiprotein परिसरों का तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक नए दृष्टिकोण पर आधारित<sup&gt; 15</sup&gt; एन मेटाबोलिक लेबल और मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trompelt, K., Steinbeck, J.,… More

Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (85), e51103, doi:10.3791/51103 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter