Summary
Den beskrivna jämförande, kvantitativ proteomik strategi syftar till att få insikt i sammansättningen av multiproteinkomplex under olika förhållanden och demonstreras genom att jämföra genetiskt olika stammar. För kvantitativ analys av lika volymer av olika fraktioner från en sackarosdensitetsgradient blandas och analyseras med masspektrometri.
Abstract
Den introducerade protokoll tillhandahåller ett verktyg för analys av multiproteinkomplex i thylakoid membranet, genom att avslöja insikter i komplexa sammansättning under olika förhållanden. I detta protokoll den metod demonstreras genom att jämföra sammansättningen av proteinkomplex som ansvarar för cyklisk elektronflöde (CEF) i Chlamydomonas reinhardtii, isolerad från genetiskt olika stammar. Förfarandet innefattar isolering av Thylakoid membran åtföljt av deras separation i multiproteinkomplex genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering, SDS-PAGE, immunodetektion och jämförande, kvantitativ masspektrometri (MS) baserat på differentiell metabolisk märkning (14 N / 15 N) av analyserade stammar. Tvättmedel upplösta thylakoid membran lastas på sackaros densitetsgradienter på lika klorofyllkoncentration. Efter ultracentrifugering, är gradienter separeras i fraktioner, som analyseras av mass spectrometry baserad på samma volym. Detta tillvägagångssätt gör utredningen av sammansättningen inom gradientfraktionerna och dessutom att analysera vandringsbeteende olika proteiner, speciellt med fokus på ANR1, CAS, och PGRL1. Dessutom är denna metod demonstreras genom att bekräfta resultaten med immunoblotting och dessutom genom att stödja resultaten från tidigare studier (identifiering och PSI beroende migrering av proteiner som tidigare beskrivits som en del av FSE-supercomplex såsom PGRL1, FNR, och cyt f). Noterbart är detta tillvägagångssätt tillämpas för att hantera ett brett spektrum av frågor, för vilka detta protokoll kan antas och exempel som används för jämförande analyser av multiproteinkomplex komposition isolerad från olika miljöförhållanden.
Introduction
Fotosyntesen hos Thylakoid membran av växter och alger kan fungera i en linjär och cyklisk läge. Under linjär elektronflöde (LSF) fotosystem I (PSI), fotosystem II (PSII) och cytokrom b. 6 / f slutligen överföra elektroner från vatten till NADP + 1, vilket leder till generering av NADPH och ATP 2. I kontrast, cyklisk elektronflöde (CEF), som är känd för att induceras enligt olika miljöförhållanden som statliga 2 3 och anaeroba betingelser 4, resulterar i re-reduktion av oxiderat PSI genom att injicera elektroner tillbaka in i transportkedjan elektron. Denna process kan ske antingen vid stromal sidan av cytokrom b 6 / f komplex 1 eller på plastoquinone poolen 5 och genererar ATP, men ingen NADPH 2.
Syftet med den presenterade protokollet är att demonstrera en masspektrometri (MS) baserat metod för jämförande, kvantitativ analys av multiproteinkomplex i thylakoid membran av Chlamydomonas reinhardtii att få insikt i sammansättningen av dessa komplex under olika förhållanden (som exemplifieras genom att jämföra genetiskt olika stammar). Detta synsätt tillämpades i en publikation av Terashima et al. Under 2012 visar en Ca2 +-beroende reglering av CEF i C. reinhardtii förmedlas av en multiproteinkomplex med proteiner CAS, ANR1 och PGRL1 6. Förfarandet kommer att förklaras genom att jämförelsevis analysera sammansättningen av CEF-supercomplex i två genetiskt olika stammar, och därmed dra fördel av märkning en av de två stammar med tunga kväve (15 N). I korthet innehåller protokollet beredning av thylakoid membran, följt av tvättmedel lösningsgörande och fraktionering av fotosyntetiska komplex i en sackarosdensitetsgradient. Efter fraktionering av lutning, valda fracningar av två stammar blandas baserat på lika stor volym, separerades genom SDS-PAGE följt av in-gel digestion och efterföljande kvantitativ MS-analys.
Som nämnts ovan, är CEF induceras under olika miljöförhållanden och en publikation från 2010 visar att isolering av en funktionell CEF-supercomplex från staten 2 låsta celler av C. reinhardtii 7, som utfördes genom att separera solubiliserade Thylakoid membran på en sackarosdensitetsgradient under ultracentrifugering. Olika från al. Iwai et 7, beskriver den presenterade protokollet isoleringen av FSE-supercomplex från anaerob vuxit C. reinhardtii kulturer genom att följa ett alternativt förfarande. Detta omfattar förändringar i thylakoid isoleringsprotokoll samt skillnader beträffande solubiliseringssteget och separation av proteinkomplex genom ultracentrifugering. I det nuvarande protokollet, thylakoid membranisoleras genom tillämpning av den metod som publicerats av Chua och Bennoun 8, medan buffertarna som används för thylakoid framställning av Iwai et al. innehöll 25 mM MES, 0,33 M sackaros, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) såsom beskrivits 9. Solubiliseringen genomfördes med 0,7 till 0,8% detergent (n-tridecyl-β-D-maltosid) under 30 minuter på is i händelse av Iwai och medarbetare, medan solubiliseringen här beskrivna metoden förlitar sig på användningen av 0,9% detergent (n -dodecyl-β-D-maltosid (β-ts)) och utförs under endast 20 minuter på is. Båda grupperna använde 0.8 mg klorofyll per ml för lösningsgörande med respektive rengöringsmedel. För separation av fotosyntetiska komplex från upplösta thylakoid membran Iwai et al. Tillämpad sackaros koncentrationer 0,1-1,3 M, medan författarna till detta protokoll som används koncentrationer som sträcker sig från 0,4 till 1,3 M. Den sista skillnaden är centrifugeringshastigheten, vilket är lägre än till earlier publicering.
Solubilisering av thylakoid membran med nonjoniska tvättmedel följt av sackarosdensitetsgradient fraktione har redan tillämpats i ett flertal studier som sträcker sig från 1980-talet fram till i dag 7, 9-14 och även tillämpningen av metabolisk märkning av proteiner är en utbredd metod inom proteomik området. Den beskrivna tillvägagångssätt tillämpar 15 N metabolisk märkning för en av de två jämförda stammarna genom odling i närvaro av tunga kväve som enda kvävekälla i form av 15 N NH 4 Cl, som är införlivat med alla aminosyror som leder till en massa skifta beroende på aminosyrasekvensen för peptiden. Vid analys av en blandning av 14 N och 15 N inom en MS köra, kan detta massförskjutning användas för att bestämma provets ursprung för varje peptid och den relativa peptid abundances kan beräknas som representerar relativa förekomsten för motsvarandening protein 15.
Ett flertal kvantitativa proteomik studier på C. reinhardtii finns tillgängliga, som jämför en definierad mängd protein för att analysera förändringar i proteomet mellan experimentella förhållanden (t.ex. förändringar i proteomet grund av närings 16-19 eller lätta stressen 20,21). Jämfört med dessa studier, i den nu presenterade strategin lika volymer av prover kombineras och analyseras. Denna inställning gör det möjligt att studera vandringsbeteende proteiner i lutning och dessutom att analysera sammansättningen av olika komplex med avseende på de undersökta stammarna.
Denna metod kommer att förklaras genom att huvudsakligen koncentrera sig på tre proteiner: Den första kandidaten är kloroplasten-lokaliserad kalciumsensorprotein CAS, som visade sig vara involverade i foto acklimatisering i C. reinhardtii 22. Kalcium anses vara en viktig signalning jon för vägar som aktiveras på grund av olika biotiska och abiotiska påfrestningar slutligen leder till förändringar i genuttryck och cellfysiologi 23 och det föreslogs att kloroplaster kan bidra till cell Ca2 + signalering via CAS proteinet 22,24,25. Det andra proteinet är ANR1 (anaerob svar 1 6), ett protein som visade sig induceras under anoxiska odlingsförhållanden i C. reinhardtii 26. Noterbart var CAS samt ANR1 identifieras som subenheter av FSE-supercomplex och dessutom genom att använda omvänd genetiska metoder, visades att båda proteinerna bidrar funktionellt till CEF in vivo 6, stödja deras roll som funktionella subenheter av denna proteinkomplex. Den tredje proteinet är det thylakoid protein PGR5-Like 1 (PGRL1), som visade sig vara involverad i CEF i Chlamydomonas 4,27 samt i Arabidopsis 5,28 och var också identified i arbetet med Iwai et al. 7
Detta tillvägagångssätt kommer att presenteras genom att visa resultaten från två olika experiment: vildtyp (WT) kontra (vs) en Apsi 29 stam, uppvisar en strykning av PSAB genen kodar för en viktig fotosystem I underenhet, som också är en del av CEF-supercomplex och WT kontra en pgrl1 knock-out stam 4. För var och en av dessa experiment den kvantitativa sammansättningen av CEF-supercomplex mellan en 15 N-och en 14 N-märkta stammen har jämförts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Odling av Chlamydomonas
- Följande C. reinhardtii stammar användes i föreliggande studie: WT cc124, WT cw15-arg7 (cellvägg bristfällig och argininauxotrof), ett Apsi mutantstam 29 och en pgrl1 knock-out-stam 4.
- Alla stammar odlades i Tris-acetat-fosfat (TAP)-mediet 30, vid 25 ° C med en kontinuerlig ljusintensitet på 20 till 50 μE / m 2 sek och skakning vid 120 rpm. Kulturen i Apsi bör lindas med några silkespapper för ljusexponering av <5 μE / m 2 sek.
- Kulturerna i de märkta stammar (Apsi och WT cc124, respektive) innehöll 7,5 mM 15 N NH 4 Cl, medan odlingarna för nonlabeled stammar (WT cw15-arg7 och pgrl1, respektive) innehöll 7,5 mM 14 N NH4CI. Celler måste växa under åtminstone fyra Generatjoner för att uppnå fullständig märkning och måste hållas på exponentiell tillväxtfas.
- På dagen före start av experimentet räkna och späd cellerna till en densitet av 1 x 10 6 celler / ml i en volym av minst 750 ml / stam.
Observera att två typer av diskontinuerliga sukros densitetsgradienter beskrives i följande protokoll. De fotosystem sackaros densitetsgradienter enligt Takahashi et al. 9 används för att separera de olika fotosyntetiska proteinkomplex från isolerade och lösta thylakoids under över-natten centrifugering och måste förberedas dagen före (se protokoll 2) och de thylakoid sackaros densitetsgradienter 8 tillämpas i thylakoid isoleringsförfarandet (se protokoll 3).
2. Framställning av fotosystem Sackarosestrar densitetsgradienter
- För att hälla gradienterna behövs tre stamlösningar:
- 2 M Sackaros
- 10% β-DM i H2O
- 0,5 M tricin, pH 8,0 (NaOH)
- Med hjälp av dessa bestånd, förbereda följande lösningar:
Koncentration: 1,3 M 1,0 M 0,85 M 0,7 M 0,65 M 0,4 M 2 M Sackaros 13 ml 10 ml 8,5 ml 7 ml 6,5 ml 4 ml 10%46,-DM 100 | il 100 | il 100 | il 100 | il 100 | il 100 | il 0,5 M Tricine 200 | il 200 | il 200 | il 200 | il 200 | il 200 | il H2O 6,7 ml 9,7 ml 11,2 ml 12,7 ml 13,2 ml 15,7 ml - Använd 14 mm x 89 mm centrifugrör och häll gradienterna mycket långsamt, med början med den högsta sackaros densitet lösning till lägre densitet lösning.
- Häll endast 1 ml vardera för de 1,3 och 1,0 M lösningar och 2 ml för resten av lösningarna.
- Lämna gradienter över natten i kylrum.
3. Anaerob Induktion och isolering av Thylakoid Membran 8
- Innan man börjar med isolering av Thylakoid membraner inducera anaeroba betingelser genom bubbling med argon under 4 timmar. Den bubblande kan utföras genom en glaspipett i odling kolvar med konstant blandning av kulturen med en magnetisk omrörarstav.
- Börja med isoleringen av Thylakoid membraner genom pelletering av cellerna under 5 min vid 2500 x g, återsuspendera i H1-buffert (0,3 M sackaros, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2).
(Observera att när du börjar med isolering av thylakoid membran prover shOuld hållas på is för att undvika proteinnedbrytning är alla centrifugeringssteg utförs vid 4 ° C och arbetar med handskar rekommenderas starkt att undvika keratin föroreningar.) - Pellets celler i 5 min vid 2500 xg, resuspendera i H1 buffert.
- Bryt celler med två passager genom en nebulisator med en kvävetryck av 1500 hPa (för påfrestningar utan cellvägg gör bara en passage).
- Centrifugera ner cellerna under 7 min vid 2500 x g..
(Efter detta steg supernatanten bör vara ljusgrön, om inte, cell brott var inte lyckat.) - Återsuspendera cellerna i H2-buffert (0,3 M sackaros, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) och pelletceller för 10 min vid 32800 x g..
- Slamma upp cellerna i H3-buffert (1,8 M sackaros, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) och homogenisera pellets med en krukmakare (inga gröna partiklar bör förbli i slutet av detta arbetssteg).
- Förbered thylakoid sackaros densitetsgradienter i badkaretes (25 mm x 89 mm) genom att starta i botten med ett lager av 12 ml H3 buffert med celler, häll ett mellanskikt av 12 ml H4 buffert (1,3 M sackaros, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA ( pH 8,0)) och ovanpå 12 ml H5-buffert (0,5 M sackaros, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Var försiktig när du häller gradienterna och undvika blandning av de tre skikten.
- Balans med H5-buffert och centrifug Thylakoid sackaros densitetsgradienter under 1 timme vid 70.700 x g..
- Avlägsna Thylakoid band från Thylakoid sackaros densitetsgradienter och späda ut dem med en lämplig volym H6-buffert (5 mM HEPES (pH 7,5) 10 mM EDTA (pH 8,0)).
- Centrifugera ner cellerna vid 37900 x g under 20 min. Om pellets är inte tät, är mer H6 buffert som krävs för detta centrifugeringssteg.
- Resuspendera thylakoids i en liten volym H6 buffert och gå vidare med bestämning av klorofyllkoncentrationen.
4. Fastställande av klorofyll koncentration 31
- Bestämningen av klorofyll belopp utförs med 80% aceton.
- Blanda 995 pl 80% aceton och 5 ^ thylakoids i H6-buffert (utspädning 1:200).
- Vortex i flera sekunder tills inga gröna partiklar kvar och sedan snurra ner på 14,1 xg under 5 minuter.
- Ta supematanten och mät extinktionen vid 663,6 och 646,6 nm och 750 nm, respektive.
- Beräkna klorofyll beloppet med hjälp av följande formler:
- C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * utspädningsfaktor
- C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * utspädningsfaktor
- C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b
5. Lastning av Foto Sackarosestrar densitetsgradienter
- Beräkna mängderna thylakoids, β-DM och H6 buffert som behövsför varje gradient:
- Varje lutning bör belastas med en total volym på 700 l med 0,8 mg / ml klorofyll i 0,9% β-DM (upplösa β-DM i H 2 O), fyll den återstående volymen med H6 buffert.
- För lösningsgörande förbereda olika alikvoter med thylakoids, β-DM och H6 buffert för varje lutning.
- Lämna prover för 20 minuter på is med regelbundet blanda (invertera) med några minuter (solubiliseringssteg).
- Centrifugera vid maximal hastighet (14.000 x g) under 10 min vid 4 ° C.
(Efter centrifugering bör pellets vara liten och vitaktig medan supernatanten är mörkgröna.) - Ladda supernatanten på lutningar.
- Balans med H6 buffert och snurra med hjälp av ultracentrifug vid 134.470 xg över natten (14 timmar) vid 4 ° C.
(Observera att den framgångsrika separationen av fotosyntetiska komplex med hjälp av fotosystem sackaros densitetsgradienter som presenteras i detta protokoll endast uppnås när using nyligen isolerade thylakoids, eftersom en prognos för solubilisering och komplicerad separation är svårt att göra när man arbetar med thylakoid membran som har varit nedfryst före.)
6. Fraktionering av fotosystem Sackarosestrar densitetsgradienter
- Ta bilder av gradienter.
- Punktera ett hål i botten av röret med hjälp av en nål och fraktionera-gradienter i 500 | il rör. Alternativt kan fraktioneringen även utföras genom användning av en 96-brunnsplatta (mikroplatta).
- Vid användning av en mikroplatta, bestämma absorbansen för de olika gradientfraktioner vid 675 nm.
(I detta steg prover kan lagras vid -80 ° C i ett par veckor.)
7. SDS-PAGE och Immundetektion
(Observera att endast för jämförelse av WT vs Apsi en western blot-analys har genomförts för att välja fraktionerna för senare MS-analys. För experimentet WT vs pgrl1 fråtgärder valdes medelst absorbansen i de olika fraktionerna.)
- Separata 30 | il av varje fraktion från WT och Apsi gradient på en 13% SDS-polyakrylamidgel 32.
- Utför western blot-analys 33 med följande antikroppar: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, PSI-subenheten pSAD 32 och PSII kärn subenheten D1. Använd alla antikroppar med en utspädning på 1:1000 (för förstärkt kemiluminescens detektionsteknik), med undantag för D1-antikroppen, som ska användas med en utspädning på 1:10.000.
- Baserat på resultaten från immunodetection, ta toppfraktioner ANR1, PGRL1 och pSAD för WT och Apsi (här fraktionerna 6 och 13, respektive), blanda 30 l av fraktion 6 från WT och Apsi och göra samma sak med fraktion 13 från både förberedelser och separera dem igen på en 13% SDS polyakrylamidgel.
- För kvantitativ jämförelse av WT vs pgrl1 ta CEF-supercomplex fraktionerna såsom bestämts genom mätning av absorbansen i de olika gradientfraktioner och blanda 30 | il av båda proven, följt av separation på en 13% SDS-polyakrylamidgel.
- Fläck proteinbanden med Coomassie-lösning (85% fosforsyra, 757 mM ammoniumsulfat, 1,2% Coomassie brilliant blue, 20% metanol) under 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- För att ta bort ospecifik färgning, tvätta flera gånger med DDH 2 O.
- Skär körfält i 1 mm gel bitar och gå vidare med den i-gel matsmältningen.
(Alternativt kan proverna torkas några minuter i en vakuumcentrifug och lagras under några veckor innan du fortsätter med den i-gel matsmältningen.)
8. I-gel Digestion (Ändrad från Shevchenko et al. 35)
Observera att förbereda alla buffertar och lösningar strax före användning och ta glasflaskor för buffertar som innehåller acetonitril (ACN). <br /> VARNING! Att arbeta med ACN kan vara skadlig, mer information kan laddas ner från: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).
- Tvätta gelstycken med> 10 volymer av DDH 2 O (~ 200 | il) under 30 sek.
- Inkubera gelstycken med 300 ul av 25 mM NH 4 HCO 3 till 15 min med skakning, avlägsna vätska.
- Inkubera gelstycken med 300 ul av 25 mM NH 4 HCO 3 i 50% ACN (förbereda genom blandning ACN och 50 mM NH 4 HCO 3 i ett förhållande av 01:01) i 15 min med skakning, avlägsna vätska.
- Om gelen bitar är fortfarande blå, upprepa NH 4 HCO 3 och NH 4 HCO 3 / ACN tvättar tills det mesta av Coomassie avlägsnas.
(Även om den största delen av Coomassie färgning bör tas bort, är det inte nödvändigt att Avfärga gelen bitarna helt.) - Addera 100 pl av ACN att dehydratisera de gelstycken för 5 min. De gelstycken ska krympa ennd se helt vit.
- Ta bort så mycket ACN som möjligt och gå vidare med trypsin matsmältningen. Alternativt kan proverna förvaras vid -20 ° C i ett par veckor.
- Lägg till 10-20 l per band av 20 ng / l trypsin i 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (nyligen utspädd), hålla prover på is.
- Efter 30 minuter, kontrollera att alla lösning absorberades och tillsätt mer trypsin buffert, om det behövs. Gel bitar bör vara helt täckt med trypsin buffert. Håll prover på is.
- Lämna gelstycken i ytterligare 90 minuter på is för att mätta dem med trypsin.
(Kritiskt steg: utbytet av tryptiska peptider ökar avsevärt med ökande inkubationstider på is, förmodligen på grund av långsam diffusion av enzymet in i polyakrylamid matris Det är nödvändigt att ha ett litet överskott av lösning som omfattar de gelstycken att undvika att styckena. falla torka under natten inkubation.) - Koka vid 37 ° C under 4-6 timmar. För experiment som krävermaximal peptid återhämtning, smälta över natten.
- Efter uppslutning spinn ner kondenserad buffert.
- Sonikera rör för 5 min att eluera peptider och centrifugera igen.
- Samla supernatanten och överför den till ett nytt rör.
- Utför peptid extraktion med 80 | il av 30% ACN / 1% myrsyra (FA) i en sonisk bad under 15 min.
- Utför extraktion med 80 | il av 30% ACN / 1% FA i en ljudbadet under 15 minuter.
- Utför extraktion med 80 | il av 70% ACN / 1% FA i en ljudbadet under 15 minuter.
- Centrifugera igen och poolen supernatanten med den tidigare eluatet.
(FA tjänar till att inaktivera trypsin och öka peptid löslighet.) - Torr peptidlösning helt i en vakuumcentrifug.
(Vid denna punkt prover kan lagras under några veckor i -20 ° C innan du fortsätter med MS-analys.) - Resuspendera peptider i 6 pl MS buffert (5% ACN, 0,1 v / v FA, vatten) och låt ligga i 2-5 min.
- Centrifugera proverna vid maximum hastighet under 5 min för att avlägsna partikelformigt material.
- Använd 4 l av supernatanten för masspektrometrisk analys.
9. MS-dataanalys med "Proteomatic"
Dataanalys utfördes med öppen källkod "Proteomatic" (som kan laddas ner på http://www.proteomatic.org/), en plattform som tillåter generering och slutförandet av MS / MS-data för utvärdering rörledningar, genom att använda fri och kommersiell mjukvara 36. I korthet är de inställningar som beskrivs nedan och mer detaljerad information finns i 6,26.
- Identifiering och kvantifiering av MS-uppgifter
Identifiering och kvantifiering av proteiner från experiment WT vs Apsi gjordes med OMSSA (version 2.1.4 37) och qTrace 26, respektive, såsom beskrivits 6,26. För analys MS-data från experimentet WT vs pgrl1 följande uppdaterade pipeline användes:- Förutom OMSSA 37 överfördes proteiner identifierades även med X! Tandem (version 2013/02/01 38). Båda algoritmerna applicerades genom sökning mot en databas som genereras genom att kombinera JGI Chlamydomonas genen modelldatabas version 4.3 med AUGUSTUS databasversionen 10.2 liksom mot en fogade databas av NCBI databaser BK000554.2 och NC_001638.1.
- MS 2 Identifiering av peptider utfördes med användning av en mål-decoy tillvägagångssätt 39. Ett lockbete för varje protein skapades av slumpvis blanda tryptiska peptider med bibehållen redundans nonproteotypic peptider.
- Statistisk validering av peptiderna utfördes med mjukvaran qvality (version 0.3.3 40) med användning av en posterior felsannolikhet (PEP) tröskel som är mindre än 0,01 och resultaten filtrerades med en prekursor masstolerans av 5 ppm.
- Peptider från OMSSA och X! Tandem körningar förenades och kvantifieras med qTrace
För att undersöka huruvida proteinförhållanden var signifikant olika mot varandra i de blandade CEF-supercomplex fraktioner från WT och pgrl1 uppnåddes statistisk analys utfördes med tillämpning av programvara SPSS (version 21). De subenheter av cytokrom b 6 / f-komplexet testades mot varandra liksom de proteiner FNR, FTSH2 och HCF136 mot PSI-subenheter. Peptid förhållandena för varje skannings räkningen per protein av alla fyra replikat testades för normalfördelning med Shapiro-Wilks test. Eftersom peptidpopulationer inte var normalfördelade (p <0,001), var icke-parametriska statistik utförts. Först var det Kruskal-Wallis test tillämpas bedöma en betydande avvikelse mellan grupper. Endast om detta test förutsade signifikant skillnads mellan grupper gjordes ytterligare analys utförs för att förutsäga signifikanta skillnader mellan två oberoende grupper med Mann-Whitney-U-testet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den introducerade kvantitativa proteomik strategi syftar till att karakterisera sammansättningen av multiproteinkomplex i thylakoid membran visas av den jämförande analys av CEF-supercomplex komponenter i genetiskt olika C. reinhardtii stammar. Den beskrivna metoden har med framgång tillämpats av al. Terashima et 6 och består isoleringen av thylakoid membran från anaeroba odlade kulturer, följt av tvättmedel görande. Därefter proverna laddas på ett sackarosdensitetsgradient baserad på lika klorofyll belopp och komplex fraktioneras genom ultracentrifugering. För kvantitativ MS-analys av lika volymer av två gradientfraktioner från olika stammar blandas och jämförelsevis analyseras (Figur 1). De presenterade resultaten innefatta jämförelser av FSE-supercomplex fraktionen mellan WT cw15-arg7 och Apsi samt WT cc124 och pgrl1, respektive.
(Figurerna 2A och 2B) valdes 6. Figur 3 skildrar den relativa proteinförhållanden som WT / Apsi (14 N / 15 N) för flera PSI kärna och LHCI proteiner (ljus skörd proteiner av PSI också namnges som Lhca proteiner) samt för proteiner som tilldelats med CEF-supercomplex. Som väntat är PSI kärnproteiner endast i WT prover påvisas genom oändlighet kvoterna i båda fraktionerna. Lhca2 och Lhca9 anrikas i WT, medan Lhca4 -6 och -8 visar en annan reglering i båda fraktioner. Det är viktigt att notera att LHCI proteiner syntetiseras och ackumuleras normalt i Apsi mutant 41. Jämförelsen polypeptid av PSI-LHCIkomplex från C. reinhardtii WT med LHCI komplexet av Apsi mutanten avslöjade att majoriteten av Lhca2, -3 och -9 verkar vara endast svagt bunden till LHCI och dessutom att närvaron av PSI-kärnan är nödvändig för en stabil bindning. Däremot Lhca1, -4, -6, -7 och -8 bilda ett komplex som är oberoende av monteringen av PSI 14, vilket kan förklara de olika reglering av Lhca4, -6 och -8 i föreliggande experiment.
För proteiner som ska tilldelas med CEF-supercomplex, kan det skiljas mellan de som är mer rikligt i WT fraktion 6 och fraktion 13 i Apsi mutant, som visar en stark PSI beroende migration visas av nyckeltal fler än för fraktion 6 och nyckeltal är lägre än en eller inte upptäckts i fraktion 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, flytväst, HCF136 och cyt f) och de visar inte så stark, men ändå en PSI-beroende lokalisering (FNR, FTSH1, FTSH2 och ATPC ).
Med detta experiment Terashima et al. 6 visade en PSI beroende migrationsbeteende för ANR1 och CAS (figurerna 2A-D och Fig. 3), och därigenom avslöjar dem som nya proteinerna enligt CEF-supercomplex, som tidigare inte identifierat 7. Resultaten av MS-analysen bekräftades också av immunodetektion och stöds av tillämpning av omvänd genetik för att bekräfta en funktionell roll dessa proteiner för CEF in vivo 6. Dessutom har denna jämförande MS-metod stödjer starkt resultat från tidigare studier, genom att bekräfta proteiner som redan har visat sig vara en del av FSE-supercomplex såsom PGRL1, cyt f och FNR 7, samt Lhcbm5 7,9 för att visa en PSI beroende lokalisering i sackarosdensitetsgradient, vilken är jämförbar med ANR1 och CAS.
Jämförelsen av fraktion 6 och 13 av anr1 och Apsi användning av samma approach (se figur S8 6) visade en liknande sammansättning av FSE-supercomplex i anr1 och samma trend för proteinerna ANR1, CAS och PGRL1 som i experimentet WT vs Apsi. Noterbart är även att proteinförhållande på ANR1 i fraktion 6 (anr1 vs Apsi) är jämförbar med förhållandet mellan WT vs Apsi experiment, mängderna av CAS och PGRL1 verkar vara högre i det förra försöket och kan vara ett resultat av kompensera för nedreglering av ANR1 6.
Dessutom, att berika ANR1 och CAS i CEF-supercomplex fraktion kunde också härleda PSI beroende migrering av flera andra proteiner från detta experiment. Dessa är två ATP-beroende metallproteaser FTSH1 och FTSH2 som spelar en grundläggande roll i nedbrytningen av PSII reaktionscentrum protein D1 i kloroplaster 42,43, en prefoldin-domän som innehåller protein, det HCF136, vilket är en avgörande faktor för stabiliteten eller assembly i PSII 44 och γ-subenheten av ATPas. Medan för den senare, behöver förhållandet mellan fraktion 6 och 13 visar inte en sådan tydlig skillnad, ytterligare försök måste göras för att kontrollera om de andra proteiner kan också vara kandidater i CEF-supercomplex.
Som ett proof of concept experiment för denna jämförande metod, analyserade vi FSE-supercomplex sammansättning i två stammar, som båda har PSI, vilket gör att bildandet av detta komplex. Respektive fraktioner valdes ut baserat på absorbans-mätningar av de fraktionerade gradienter. Figurerna 4A och 4B visar resultaten för kvantitativ jämförelse mellan WT och en pgrl1 knock-out-stam. Det bör påpekas att ANR1 och CAS inte anmärkningsvärt förändras mellan WT och pgrl1. Intressant nog verkar HCF136 att berikas i WT, medan FTSH2 verkar berikas i pgrl1. En statistiskt significant skillnad för båda ovan nämnda proteiner till alla PSI-subenheter (inklusive LHCI proteiner) kunde bekräftas.
Dessutom cytokrom b 6 / f komplexa subenheter cyt f och PETO visade sig vara betydligt annorlunda cyt b 6, cyt b 6 / f IV och PETC, respektive. Särskilt tycks cyt f vara uppreglerad i pgrl1, medan cyt b 6 och cyt b 6 / f IV är något nedregleras, även om regleringen av cyt f syntes innebär förmodligen cyt b 6 och cyt b 6 / f IV 45 . Kärnkrafts-kodade PETC, som också är känd som Rieske protein visar en liknande reglering som cyt b 6 och cyt b 6 / f IV (dvs. en nedreglering i pgrl1). Det är slående som en minskning eller frånvaro av Rieske proteinet ändå leda till ansamling av OTHer cyt b 6 / f subenheter till ~ 60% av WT nivå C. reinhardtii 46. Dessutom är viktigt att notera den uppreglering av PETO i pgrl1 eftersom detta löst bundet subenhet visade sig ackumuleras till reducerade nivåer i C. reinhardtii mutanter som saknar antingen cyt b 6, cyt b 6 / f IV eller PETC 47, vilket är mindre förekommande i pgrl1 jämfört med WT i detta experiment.
Figur 1. Experimentell arbetsflöde såsom avbildas för WT och Apsi. Celler metaboliskt märkt under minst fyra generationer, anaeroba förhållanden induceras genom argonbubbling under 4 h och Thylakoid membran är isolerade genom gradient separation. Den isolated membran solubiliseras med användning av β-DM, laddades på en sackarosdensitetsgradient (för båda stammarna lika mängder klorofyll tillämpas i detta steg) och centrifugerades över natten. De gradientfraktioner uppsamlas och analyseras genom SDS-PAGE liksom immunodetektion att bestämma fördelningen av proteiner inom gradienten. För att identifiera proteiner med en PSI beroende migrering lika volymer av WT CEF-supercomplex fraktion (fraktionsnummer 6) och den motsvarande 15 ^ N-märkt fraktionen från Apsi stam blandades och jämförelsevis analyseras. Detsamma gjordes med toppfraktionen av ANR1 i Apsi stammen (fraktion nummer 13). För jämförande, kvantitativ MS-metod, de blandade proteinprover separerades med SDS-PAGE, proteinband färgades med Coomassie blå lösning, följt av i-gel matsmältningen innan MS-analys. Klicka här för att visa en större imaGE.
Figur 2. ANR1 och CAS migrera till de lägre densitet regionerna i Apsi stammen. A:. Sackaros densitetsgradienter av WT och Apsi thylakoids isolerats från anaeroba förhållanden separerades i 20 fraktioner B: Immun av ANR1 i 20 fraktioner av gradienten från WT och Apsi. Även detta protein är lokaliserad till den högre densitet regionen i WT (fraktion 6) det är upp-skiftat till de lägre densitet regioner i Apsi stammen (fraktion 13) C:. Sackaros densitetsgradienter av WT och Apsi thylakoids isolerad från anaeroba förhållanden separerades i 27 fraktioner D:. Immunodetektering av CAS i 27 fraktioner av gradienten från WT och Apsi. Även detta protein är lokaliserad to högre densitet regionen i WT (med en topp runt fraktion 7) är det upp-skiftat till de lägre densitet regioner i Apsi stammen (med en topp runt fraktion 19). (Denna siffra har modifierats Terashima et al. 6). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Relativ proteinförhållanden bestäms i fraktion 6 och 13 från WT och Apsi genom kvantitativ masspektrometri. Fraktionerna 6 och 13 från WT har jämförts med de respektive fraktionerna från 15 N-märkt Apsi stammen. De relativa proteinförhållanden som representerar två biologiska replikat och tre MS-körningar avbildas som WT / Apsi (14N / 15 N) för både analyserade fraktioner med undantag av cyt f, vilka endast identifierades i fraktion 6. Denna jämförande kvantifiering avslöjar att ANR1 och CAS visar en PSI beroende migration i sackarosdensitetsgradient (denna siffra har modifierats Terashima et al. 6). Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Relativa proteinförhållanden bestäms i CEF-supercomplex fraktion av WT och pgrl1 genom kvantitativ masspektrometri. A: sackaros densitetsgradienter av WT och pgrl1 thylakoids isolerats från anaeroba förhållanden B:. Relativa proteinförhållanden mellan FSE-supercomplex fraktion som härrör från fyra olika replikat avbildad som WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). I detta experiment ANR1 och CAS inte är anmärkningsvärt förändrats, medan FTSH2 och HCF136 uppvisar betydande skillnader jämfört med alla PSI-subenheter (p ≤ 0,001 som anges med *** i rött, HCF136: 1900 <U <58127; FTSH2: 2117 <U <164197). Dessutom är cyt b 6 / f komplexa subenheter cyt f och PETO visade sig vara signifikant från cyt b 6, cyt b 6 / f IV och PETC, respektive (p ≤ 0,001 vilket indikeras av *** i blått; cyt f : 2684 <U <11535, PETO:. 4700 <U <23663) Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika kvantitativa proteomik studier med stabila isotopen märkning har publicerats under de senaste åren. I dessa experiment vanligtvis två olika prover jämförs, av vilka ett prov är märkt med en stabil isotop. Därefter proteiner eller peptider från de två proven kombineras i samma förhållande och bearbetas vidare tillsammans 48. Sådana studier tänker ofta att jämföra definierade isolerade cellulära utrymmen (t.ex. kloroplaster, mitokondrier eller thylakoid membran) utsätts för olika stressförhållanden 26,34,49 att undersöka upp-eller nedreglering av specifika proteiner. Den beskrivna jämförande, kvantitativ proteomic tillvägagångssätt syftar till att analysera sammansättningen av multiproteinkomplex i thylakoid membranet och, i motsats till de tidigare nämnda studierna, är baserad på att blanda samma volym av prover efter sackaros täthetsseparation av Thylakoid membran laddades vid lika klorofyllkoncentrationen före ultracentrifugation. Denna metod tillämpas i praktiken av Terashima et al. 6 som jämförelsevis analyserat sammansättningen av CEF-supercomplex isolerad från ett WT och en Apsi stammen för att identifiera proteiner som migrerar PSI beroende i en sackarosdensitetsgradient.
För att uppnå denna strategi bevisas av det faktum att MS-resultaten ytterligare av immunodetektion. Dessutom Terashima et al. Kunde bekräfta resultaten från tidigare studier (dvs. identifiering och PSI beroende migrering av proteiner som redan beskrivits som en del av FSE-supercomplex, t.ex. PGRL1, FNR, och cyt f. 7). Identifieringen av ANR1 och CAS som nya komponenter i CEF-maskiner 6 avslöjar denna metod som ett mycket kraftfullt och effektivt verktyg. Noterbart är den isolerade CEF-supercomplex uppvisade in vitro-aktivitet, vilket visar den framgångsrika reningen av en funktionmassan från traditionella multiproteinkomplex 6. Tillämpningen av denna metod även för två stammar av vilka båda bildar en CEF-supercomplex demonstreras av jämförelsen mellan WT och pgrl1.
I allmänhet kan denna metod användas för att kartlägga komplexa kompositioner i olika stammar eller villkor som framgår av identifiering av tidigare okända proteiner som copurified med CEF-supercomplex fraktion (dvs. anrikning av FTSH1, FTSH2, flytväst, och HCF136 i CEF-supercomplex fraktion). Huruvida dessa proteiner är tänkbara nya kandidater för denna komplexa och för att förbättra vår förståelse för olika reglering av FTHS2, HCF136, liksom för cyt b 6 / f subenheter vilket framgår av en jämförelse mellan WT och pgrl1, ytterligare experiment är nödvändiga.
Förutom de beskrivna fördelarna med denna metod, det finns brytaal kritiska steg som måste övervägas noga när man arbetar med detta protokoll: Bryt av celler med nebulisatorn är det första viktiga steget. Om öppningen av cellerna inte utförs på ett korrekt sätt, kommer avkastningen av isolerade thylakoids vara ganska låg och kan resultera i knappt någon upptäckt av FSE-supercomplex efter över-natten centrifugering. Den framgångsrika söndring av celler kan härledas från den ljusgröna färgen på supernatanten efter centrifugering. Om däremot trycket under cellsprängning är för hög, kan delar av supercomplex desintegrera och viktiga kofaktorer kan förloras. Ett annat steg som påverkar utbytet av thylakoids är resuspension av celler med en krukmakare. Detta måste göras noggrant och i slutet av detta steg bara några gröna partiklar bör förbli. Vidare för framställning av sackaros-densitetsgradienter dagen före såväl som för solubilisering av membrankomplex, är det mycket viktigt attexakt följa detta protokoll vad gäller koncentrationen av β-DM, eftersom detta är avgörande för att erhålla fullt upplösta thylakoids 50 och därmed även för rening av FSE-supercomplex. Solubiliseringssteget har utförts med godkänt resultat, om en liten, vitaktig pellets observeras efter den efterföljande centrifugeringssteget. En annan kritisk punkt som bör nämnas här är den tid på över-natten ultracentrifugering. De sackaros densitetsgradienter skall centrifugeras under minst tolv timmar för att uppnå fullständig separation av de fotosyntetiserande komplex.
Även om det protokoll som visas med användning av C. reinhardtii för jämförande analys av FSE-supercomplex komposition i två genetiskt olika stammar, är det lätt att anpassa även till en rad andra frågor, som till exempel de jämförande analyser av multiproteinkomplex komposition isolerad från tydlig miljöprofil / experimentellvillkor eller genom att använda andra typer av fraktionering. De enda kraven i denna strategi är att modellen organismen kan odlas i cellkultur, är i stånd att använda ammonium som kvävekälla och proteinkomplex kan separeras genom sackaros-densitetsgradienter, visar en bred tillämpning av denna metod. För framtida tillämpning av denna metod SDS-PAGE-fraktionering av de blandade 14 N / 15 N prover och efterföljande in-gel digestion skulle kunna ersättas genom att applicera filtret stödd provberedningsmetod (FASP). Denna metod innefattar tillämpning av starka rengöringsmedel för solubilisering syftar till "städa upp" proteomet innan matsmältningen och för att erhålla renade peptider, förebygga nackdelarna med den i-gel matsmältningen strategi som kan hämma peptid återhämtning, även om man bör överväga att i-gel matsmältning beskrivs vara robusta för föroreningar som kan störa matsmältningen 51.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
MH erkänner stöd från "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Författare bidrag: MH utformade forskning, KT, JS och MT utfört forskning och analyserade data, KT och MH skrev tidningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
