Summary
Il confronto, approccio di proteomica quantitativa descritta mira ad ottenere intuizioni nella composizione dei complessi multiproteici in condizioni diverse ed è dimostrato dal confronto ceppi geneticamente diversi. Per l'analisi quantitativa volumi uguali di frazioni diverse da un gradiente di densità di saccarosio sono mescolati e analizzati mediante spettrometria di massa.
Abstract
Il protocollo introdotto fornisce uno strumento per l'analisi di complessi multiproteici nella membrana tilacoidi, rivelando intuizioni composizione complessa in condizioni diverse. In questo protocollo l'approccio è dimostrato confrontando la composizione della proteina complessa responsabile ciclico flusso di elettroni (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolata da ceppi geneticamente diversi. Il procedimento comprende l'isolamento di membrane tilacoidi, seguita dalla loro separazione in complessi multiproteici da centrifugazione su gradiente di densità di saccarosio, SDS-PAGE, immunodetection e comparativa, spettrometria di massa quantitativa (MS) basato su marcatura metabolica differenziale (14 N / 15 N) del ceppi analizzati. Detergente membrane tilacoidi solubilizzate vengono caricati su gradienti di densità di saccarosio in concentrazione pari clorofilla. Dopo ultracentrifugazione, le pendenze sono separati in frazioni, che vengono analizzati dai mass-spectrometry basato sulla parità di volume. Questo approccio permette l'indagine della composizione all'interno delle frazioni gradiente ed inoltre per analizzare il comportamento di migrazione di diverse proteine, in particolare concentrandosi su ANR1, CAS, e PGRL1. Inoltre, questo metodo è dimostrato confermando i risultati con immunoblotting e inoltre sostenendo i risultati di studi precedenti (identificazione e di migrazione PSI-dipendente delle proteine precedentemente descritti a far parte del CEF-supercomplex come PGRL1, FNR, e cyt f). In particolare, questo approccio è applicabile ad affrontare una vasta gamma di domande per le quali questo protocollo può essere adottato e, ad esempio utilizzato per le analisi comparative dei multiproteico composizione complessa isolato da condizioni ambientali diverse.
Introduction
Processi fotosintetici nelle membrane tilacoidi di piante e alghe possono funzionare in modo lineare e ciclica. Durante lineare flusso di elettroni (LEF) fotosistema I (PSI), fotosistema II (PSII) e citocromo b 6 / f definitiva trasferire elettroni dall'acqua al NADP + 1, che porta alla generazione di NADPH e ATP 2. Al contrario, ciclico flusso di elettroni (CEF), che è noto per essere indotta in diverse condizioni ambientali come stato 2 e 3 anaerobici condizioni 4, provoca la re-riduzione del PSI ossidato iniettando elettroni indietro nella catena di trasporto degli elettroni. Questo processo può avvenire sia sul lato stromale del citocromo b complesso di 6 / f 1 o in piscina plastoquinone 5 e genera ATP, ma non NADPH 2.
Lo scopo del protocollo presentato è dimostrare una spettrometria di massa (MS) m basatoetodo per il confronto, l'analisi quantitativa dei complessi multiproteici nelle membrane tilacoidi di Chlamydomonas reinhardtii al fine di conoscere la composizione di questi complessi in condizioni diverse (esemplificati confrontando ceppi geneticamente differenti). Questo approccio è stato applicato in una pubblicazione di Terashima et al. Nel 2012 mostra un Ca 2 +-dipendente regolamento del CEF in C. reinhardtii mediata da un complesso multiproteico comprese le proteine CAS, ANR1, e PGRL1 6. La procedura verrà spiegata analizzando comparativamente la composizione del CEF-supercomplex in due ceppi geneticamente diversi, sfruttando così etichettatura uno dei due ceppi con azoto pesante (15 N). Brevemente, il protocollo prevede la preparazione di membrane tilacoidi, seguita da detersivo solubilizzazione e frazionamento di complessi fotosintetici in un gradiente di densità di saccarosio. Dopo frazionamento del gradiente, Frac selezionatozioni di due ceppi sono mescolati basano sulla parità di volume, separate mediante SDS-PAGE seguita da in-gel digestione e successiva analisi MS quantitativa.
Come accennato in precedenza, CEF è indotta in diverse condizioni ambientali e una pubblicazione dal 2010 dimostra l'isolamento di un funzionale CEF-supercomplex da stato 2 celle bloccate di C. reinhardtii 7, che è stata eseguita separando membrane tilacoidi solubilizzate su un gradiente di saccarosio durante ultracentrifugazione. Diverso da Iwai et al. 7, il protocollo presentato descrive l'isolamento del CEF-supercomplex da anaerobico cresciuto C. culture reinhardtii seguendo una procedura alternativa. Questo comprende cambiamenti nel protocollo di isolamento tilacoidi nonché le differenze riguardanti la fase di solubilizzazione e la separazione dei complessi proteici mediante ultracentrifugazione. Nel presente protocollo, le membrane tilacoidisono isolati applicando la procedura pubblicata da Chua e Bennoun 8, mentre i buffer utilizzati per la preparazione tilacoidi da Iwai et al. contenute Mes 25 mM, saccarosio 0,33 M, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) come descritto 9. La solubilizzazione è stata effettuata con 0,7-0,8% di detergente (n-tridecil-β-D-maltoside) per 30 min in ghiaccio in caso di Iwai e collaboratori, mentre il metodo di solubilizzazione qui descritto si basa sull'utilizzo di 0,9% di detergente (n -Dodecil-β-D-maltoside (β-DM)) e viene eseguita solo per 20 min in ghiaccio. Entrambi i gruppi utilizzati 0,8 mg di clorofilla per ml per la solubilizzazione con il rispettivo detersivo. Per la separazione dei complessi fotosintetici dalle membrane tilacoidi solubilizzate Iwai et al. Applicato concentrazioni di saccarosio tra 0,1-1,3 M, che di questo protocollo gli autori hanno utilizzato concentrazioni comprese 0,4-1,3 M. L'ultima differenza è la velocità di centrifugazione, che è inferiore rispetto Per il bisrlier pubblicazione.
Solubilizzazione delle membrane tilacoidi con detergenti non ionici seguite da densità gradiente di saccarosio frazionamento già applicato in numerosi studi che vanno dal 1980 fino ad oggi 7, 9-14 e anche l'applicazione di marcatura metabolica delle proteine è un metodo diffuso nel campo proteomica. L'approccio descritto si applica l'etichettatura 15 N metabolica per uno dei due ceppi confrontati da coltura in presenza di azoto pesante come unica fonte di azoto in forma di 15 N NH 4 Cl, che è integrata in tutti gli aminoacidi che conducono ad una massa spostare a seconda della sequenza amminoacidica del peptide. Quando si analizza una miscela di 14 N e 15 N entro un MS eseguito, questo spostamento di massa può essere utilizzato per determinare l'origine del campione per ogni peptide e peptide abbondanza relativa possono essere calcolati rappresentano abbondanze relative per l'corrispondonoing proteine 15.
Numerosi studi di proteomica quantitative C. reinhardtii sono disponibili, che confronta una quantità definita di proteine per analizzare i cambiamenti del proteoma tra le condizioni sperimentali (ad esempio cambiamenti nella proteoma a causa di nutrienti 16-19 o alla luce di stress 20,21). Rispetto a tali studi, nell'approccio attualmente presentata uguali volumi di campioni vengono combinati e analizzati. Questa configurazione permette di studiare il comportamento di migrazione delle proteine all'interno del gradiente ed inoltre per analizzare la composizione di diversi complessi rispetto ai ceppi esaminati.
Questo metodo sarà spiegata principalmente da concentrandosi su tre proteine: Il primo candidato è il calcio proteina sensore CAS cloroplasto-localizzato, che ha dimostrato di essere coinvolti in foto-acclimatazione in C. reinhardtii 22. Il calcio è considerato un segnale importantezione di ioni per percorsi che vengono attivati a causa di diversi stress biotici e abiotici, infine, che porta a cambiamenti nell'espressione genica e fisiologia cellulare 23 ed è stato proposto che cloroplasti potrebbero contribuire a cellulare Ca 2 + segnalazione tramite la proteina CAS 22,24,25. La seconda proteina è ANR1 (risposta anaerobica 1 6), una proteina che ha dimostrato di essere indotta in condizioni anossiche crescita in C. reinhardtii 26. In particolare, CAS nonché ANR1 sono stati identificati come subunità del CEF-supercomplex ed inoltre, utilizzando approcci di genetica inversa, è stato dimostrato che entrambe le proteine contribuiscono funzionalmente al CEF in vivo 6, sostenendo il loro ruolo di subunità funzionali di questo complesso proteico. La terza proteina è la proteina tilacoidi PGR5-Like 1 (PGRL1), che ha dimostrato di essere coinvolti in CEF in Chlamydomonas 4,27 e 5,28 in Arabidopsis e era anche identified nel lavoro di Iwai et al. 7
Questo approccio sarà presentato mostrando i risultati di due esperimenti diversi: di tipo selvatico (WT) contro (vs) una ΔPSI 29 ceppo, esibendo una delezione del gene PSAB, che codifica per un fotosistema I essenziale subunità, che è anche parte del CEF-supercomplex e WT contro un pgrl1 knock-out ceppo 4. Per ciascuno di questi esperimenti la composizione quantitativa del CEF-supercomplex tra 15 N e un ceppo 14 N-marcato è stato confrontato.
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Protocol
1. Coltura di Chlamydomonas
- Il seguente C. reinhardtii ceppi sono stati utilizzati nel presente studio: WT cc124, WT cw15-arg7 (parete cellulare carente e arginina auxotroph), un ceppo mutante ΔPSI 29 e un pgrl1 knock-out ceppo 4.
- Tutti i ceppi sono stati coltivati in Tris-acetato-fosfato (TAP)-mezzo 30, a 25 ° C con una intensità di luce continua di 20-50 μE / m 2 sec e agitazione a 120 rpm. La cultura della ΔPSI deve essere avvolto con della carta tissue per esposizione alla luce <5 μE / m 2 sec.
- Le culture dei ceppi etichettati (ΔPSI e WT cc124, rispettivamente) contenevano 7,5 mm 15 N NH 4 Cl, mentre le colture di ceppi nonlabeled (WT cw15-arg7 e pgrl1, rispettivamente) contenevano 7,5 mm 14 N NH 4 Cl. Le cellule devono crescere per almeno quattro generationi per raggiungere la piena etichettatura e devono essere mantenuti a fase di crescita esponenziale.
- Il giorno prima di iniziare il conteggio dell'esperimento e diluire le cellule ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml in un volume di almeno 750 ml / ceppo.
Si prega di notare che due tipi di gradiente discontinuo di densità di saccarosio sono descritte nella seguente protocollo. I gradienti di densità di saccarosio fotosistema secondo Takahashi et al. 9 sono utilizzati per separare i diversi complessi proteici fotosintetici da tilacoidi isolati e solubilizzate durante durante la notte centrifugazione e devono essere preparati il giorno prima (vedi protocollo 2) ed i tilacoidi gradienti di densità di saccarosio 8 sono applicati nella procedura di isolamento tilacoidale (vedi protocollo 3).
2. Preparazione del fotosistema saccarosio gradienti di densità
- Per versare le pendenze sono necessarie tre soluzioni stock:
- 2 M saccarosio
- 10% β-DM in H 2 O
- 0,5 M Tricina, pH 8,0 (NaOH)
- L'utilizzo di questi titoli, preparare le seguenti soluzioni:
Concentrazione: 1.3 M 1,0 M 0.85 M 0,7 M 0.65 M 0,4 M 2 M saccarosio 13 ml 10 ml 8.5 ml 7 ml 6.5 ml 4 ml 10%46;-DM 100 microlitri 100 microlitri 100 microlitri 100 microlitri 100 microlitri 100 microlitri 0,5 M Tricina 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml H 2 O 6.7 ml 9.7 ml 11.2 ml 12.7 ml 13.2 ml 15.7 ml - Utilizzare 14 millimetri tubi x 89 millimetri centrifuga e versare le pendenze molto lentamente, a partire con la soluzione di più alta densità di saccarosio per la soluzione minore densità.
- Versare solo 1 ml ciascuno per i 1.3 e 1.0 M soluzioni e 2 ml per il resto delle soluzioni.
- Lasciare gradienti durante la notte in cella.
3. Anaerobica Induzione e isolamento di tilacoidale Membrane 8
- Prima di iniziare con l'isolamento delle membrane tilacoidi, indurre condizioni anaerobiche con argon per 4 ore. La formazione di bolle può essere effettuata tramite una pipetta di vetro in coltura fiaschi con una costante miscelazione della cultura con un bastoncino magnetico.
- Iniziare con l'isolamento delle membrane tilacoidi pastigliando le cellule per 5 minuti a 2500 xg, risospendere in tampone H1 (0,3 M saccarosio, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl 2).
(Si prega di notare che quando si inizia con l'isolamento di tilacoidali membrane campioni should essere tenuti in ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine, tutte le fasi di centrifugazione sono eseguite a 4 ° C e lavorare con i guanti si consiglia vivamente di evitare la contaminazione cheratina.) - Cellule pellet per 5 min a 2500 xg, risospendere in tampone H1.
- Rompere le celle con due passaggi attraverso un nebulizzatore con una pressione di azoto di 1500 hPa (per i ceppi senza parete cellulare solo fare un passaggio).
- Spin le cellule per 7 minuti a 2500 x g.
(Dopo questo passo il surnatante deve essere di colore verde chiaro, in caso contrario, la rottura delle cellule non è riuscita.) - Risospendere le cellule in tampone H2 (0.3 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e cellule pellet per 10 min a 32800 x g.
- Risospendere le cellule in tampone H3 (1.8 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e omogeneizzare pellet con potter (senza particelle verdi dovrebbero rimanere alla fine di questa fase di lavorazione).
- Preparare tilacoidali gradienti di densità di saccarosio in vascaes (25 millimetri x 89 mm) avviando in fondo con uno strato di 12 ml H3 buffer con le cellule, versare uno strato intermedio di 12 ml di tampone H4 (1.3 M saccarosio, 5 HEPES mM (pH 7,5), EDTA 10 mM ( pH 8,0)) e sulla parte superiore 12 ml di tampone H5 (0,5 M saccarosio, 5 mM HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Prestare attenzione quando si versa le pendenze ed evitare la miscelazione dei tre strati.
- Equilibrio con tampone H5 e centrifugare tilacoidali gradienti di densità di saccarosio per 1 ora a 70.700 x g.
- Rimuovere le bande tilacoidali dalle tilacoidali gradienti di densità di saccarosio e diluirli con un adeguato volume di tampone H6 (5 HEPES mM (pH 7,5) EDTA 10 mM (pH 8,0)).
- Spin le cellule a 37.900 xg per 20 min. Se il pellet non è stretto, più di buffer H6 è necessario per questa fase di centrifugazione.
- Risospendere tilacoidi in un buffer H6 piccolo volume e procedere con determinazione della concentrazione di clorofilla.
4. Determinazione della clorofilla Concentrazione 31
- La determinazione della quantità clorofilla viene eseguita con 80% acetone.
- Mescolare 995 ml 80% acetone e 5 ml di tilacoidi in tampone H6 (diluizione 1:200).
- Vortex per alcuni secondi fino particelle verdi rimangono e poi girano giù a 14.1 g per 5 min.
- Prendete il surnatante e misurare l'estinzione a 663,6 e 646,6 nm e 750 nm, rispettivamente.
- Calcolare la quantità di clorofilla utilizzando le seguenti formule:
- C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * fattore di diluizione
- C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * fattore di diluizione
- C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b
5. Caricamento del fotosistema saccarosio gradienti di densità
- Calcolare la quantità di tilacoidi, β-DM e tampone H6 che sono necessariper ogni sfumatura:
- Ogni sfumatura deve essere caricata con un volume totale di 700 ml con 0,8 mg / ml clorofilla a 0,9% β-DM (sciogliere β-DM in H 2 O), riempire il volume rimanente con tampone H6.
- Per solubilizzazione preparare diverse aliquote con tilacoidi, β-DM e tampone H6 per ogni sfumatura.
- Lasciare i campioni per 20 minuti sul ghiaccio con mescolando regolarmente (invertito) ogni pochi minuti (solubilizzazione passo).
- Centrifugare alla massima velocità (14.000 xg) per 10 min a 4 ° C.
(Dopo centrifugazione, il pellet dovrebbe essere piccolo e biancastro mentre il surnatante è verde scuro.) - Caricare surnatante sulle pendenze.
- Equilibrio con tampone H6 e spin usando Ultracentrifuge a 134.470 xg durante la notte (14 ore) a 4 ° C.
(Si prega di notare che il successo separazione dei complessi fotosintetici utilizzando gradienti di densità fotosistema saccarosio come presentato in questo protocollo si ottiene solo quando using isolate di fresco tilacoidi, poiché una previsione per solubilizzazione e separazione complesso è difficile fare quando si lavora con membrane tilacoidi che sono stati congelati prima.)
6. Frazionamento del fotosistema saccarosio gradienti di densità
- Scattare foto dei gradienti.
- Perforare un foro nella parte inferiore del tubo con ago e gradienti frazionare in tubi 500 microlitri. In alternativa, il frazionamento può essere eseguita anche utilizzando una piastra a 96 pozzetti (micropiastra).
- Quando si utilizza una micropiastra, determinare l'assorbanza delle diverse frazioni gradiente a 675 nm.
(A questo passo campioni possono essere conservati a -80 ° C per alcune settimane.)
7. SDS-PAGE e immunorivelazione
(Si prega di notare che solo per il confronto delle WT vs ΔPSI è stata effettuata un'analisi western blot per selezionare le frazioni per la successiva MS-analisi. Per l'esperimento WT vs pgrl1 frazioni sono stati scelti mediante l'assorbanza nelle diverse frazioni.)
- Separa i 30 ml di ogni frazione di WT e ΔPSI sfumato su un 13% di SDS poliacrilammide gel 32.
- Eseguire l'analisi Western Blot 33 utilizzando i seguenti anticorpi: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, il PSI subunità psad 32 e il PSII nucleo subunità D1. Utilizzare tutti gli anticorpi con una diluizione di 1:1000 (per una migliore tecnica chemiluminescenza), fatta eccezione per l'anticorpo D1, che dovrebbe essere utilizzato con una diluizione di 1:10.000.
- Sulla base dei risultati del immunorivelazione, prendere le frazioni di picco di ANR1, PGRL1 e PSAD per WT e ΔPSI (qui frazioni 6 e 13, rispettivamente), miscelare 30 ml di frazione 6 da WT e ΔPSI e fare lo stesso con la frazione da 13 entrambi preparati e li separano di nuovo su un gel SDS poliacrilammide 13%.
- Per il confronto quantitativo di WT vs pgrl1 prendere la CFrazioni EF-supercomplex come determinata misurando l'assorbanza nelle diverse frazioni gradiente e Mescolare 30 ml di entrambi i campioni seguiti da separazione su gel di poliacrilammide SDS 13%.
- Macchiare le bande proteiche con una soluzione di Coomassie (85% acido fosforoso, 757 mM di solfato di ammonio, 1,2% blu brillante Coomassie, 20% metanolo) per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
- Per rimuovere la colorazione aspecifica, lavare più volte con DDH 2 O.
- Tagliare le corsie a 1 millimetro pezzi di gel e procedere con la digestione in-gel.
(In alternativa, i campioni possono essere asciugati in pochi minuti in una centrifuga a vuoto e conservati per un paio di settimane prima di continuare con la digestione in-gel.)
8. In-gel Digestione (Modificato da Shevchenko et al. 35)
Si prega di notare per preparare tutti i buffer e le soluzioni poco prima dell'uso e prendere bottiglie di vetro per tamponi contenenti acetonitrile (ACN). <br /> ATTENZIONE! Lavorare con ACN potrebbe essere dannoso; ulteriori informazioni può essere scaricato da: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).
- Lavare i pezzi di gel con> 10 volumi di DDH 2 O (~ 200 ml) per 30 sec.
- Incubare i pezzi di gel con 300 ml di 25 mM NH 4 HCO 3 per 15 minuti con agitazione, rimuovere il liquido.
- Incubare i pezzi di gel con 300 ml di 25 mM NH 4 HCO 3 nel 50% ACN (prepara mescolando ACN e 50 NH mm 4 HCO 3 con un rapporto di 1:1) per 15 minuti con agitazione, rimuovere il liquido.
- Se i pezzi gel sono ancora blu, ripetere l'NH 4 HCO 3 e NH 4 HCO 3 / ACN lava fino a quando la maggior parte del Coomassie viene rimosso.
(Anche se la maggior parte di Coomassie colorante deve essere rimosso, non è necessario Destain completamente i pezzi di gel.) - Aggiungere 100 ml di ACN a disidratare i pezzi di gel per 5 min. I pezzi di gel dovrebbero ridurre unand guardare completamente bianco.
- Rimuovere il più ACN possibile e procedere con tripsina digestione. In alternativa, i campioni possono essere conservati a -20 ° C per alcune settimane.
- Aggiungere 10-20 ml per ogni gruppo di 20 ng / mL tripsina nel 10% ACN / 25 NH mm 4 HCO 3 (appena diluito), mantenere i campioni in ghiaccio.
- Dopo 30 minuti, controllare se tutto soluzione è stata assorbita e aggiungere più tampone tripsina, se necessario. Pezzi di gel devono essere completamente coperti con tampone di tripsina. Conservare i campioni in ghiaccio.
- Lasciare pezzi di gel per altri 90 minuti sul ghiaccio di saturare loro con tripsina.
(Passaggio critico: la resa di peptidi triptici aumenta notevolmente con l'aumentare i tempi di incubazione in ghiaccio, probabilmente a causa della lenta diffusione dell'enzima nella matrice poliacrilammide E 'necessario avere un piccolo eccesso di soluzione copre i pezzi di gel per evitare che i pezzi. cadere asciutto durante la notte di incubazione.) - Digerire a 37 ° C per 4-6 ore. Per esperimenti che richiedonorecupero peptide massimo, digerire durante la notte.
- Dopo la digestione spin down del buffer condensato.
- Tubi ultrasuoni per 5 min a eluiscano peptidi e centrifugare di nuovo.
- Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta.
- Procedere all'estrazione del peptide con 80 ml di 30% ACN / acido formico 1% (FA) in un bagno sonico per 15 min.
- Eseguire l'estrazione con 80 ml di 30% ACN / 1% FA in un bagno sonico per 15 min.
- Eseguire l'estrazione con 80 ml di 70% ACN / 1% FA in un bagno sonico per 15 min.
- Centrifuga di nuovo e la piscina surnatante con l'eluato precedente.
(FA serve per inattivare la tripsina e aumentare il peptide solubilità.) - Soluzione peptide asciugare completamente in una centrifuga a vuoto.
(A questo punto i campioni possono essere conservati per un paio di settimane a -20 ° C prima di procedere con MS-analisi.) - Peptidi Risospendere in 6 microlitri di buffer MS (5% ACN, 0,1 v / v FA, acqua) e ultrasuoni per 2-5 min.
- Centrifugare i campioni a maximum velocità per 5 minuti per rimuovere il materiale particolato.
- Utilizzare 4 ml di surnatante per l'analisi di spettrometria di massa.
9. MS-Analisi dei dati con "Proteomatic"
L'analisi dei dati è stata effettuata con il software open-source "Proteomatic" (che può essere scaricato http://www.proteomatic.org/), una piattaforma che consente la generazione e completamento di MS / MS condotte valutazione dei dati in base software libero e commerciale 36. In breve, le impostazioni sono descritte di seguito e più dettagliate informazioni possono essere trovati in 6,26.
- Identificazione e quantificazione di MS-dati
Identificazione e quantificazione delle proteine dal esperimenti WT vs ΔPSI sono state fatte con OMSSA (versione 2.1.4 37) e qTrace 26, rispettivamente, come descritto 6,26. Per l'analisi MS-dati dall'esperimento WT vs pgrl1 seguente conduttura aggiornato è stato utilizzato:- Oltre a OMSSA 37, proteine sono state anche identificate con X! Tandem (versione 2013/02/01 38). Entrambi gli algoritmi sono stati applicati da una ricerca su un database generato combinando il JGI Chlamydomonas database model gene versione 4.3 con la versione del database AUGUSTUS 10.2, nonché un database unita del NCBI banche dati BK000554.2 e NC_001638.1.
- MS 2 Identificazione di peptidi è stata effettuata utilizzando un approccio target-richiamo 39. Un richiamo per ogni proteina è stato creato da mischiare a caso peptidi triptici, pur mantenendo la ridondanza dei peptidi nonproteotypic.
- Validazione statistica dei peptidi è stata effettuata con il software qvality (versione 0.3.3 40) con una probabilità di errore posteriore (PEP) soglia inferiore a 0,01 e risultati sono stati filtrati con una tolleranza massa precursore di 5 ppm.
- Peptidi da OMSSA e X! Corre Tandem sono state riunite e quantificate con qTrace
Per studiare se Proporzioni proteina erano significativamente differenti l'una verso l'altra nelle frazioni CEF-supercomplex contrastanti da WT e pgrl1, analisi statistica è stata effettuata applicando il software SPSS (versione 21). Le subunità del citocromo b complesso 6 / f sono stati testati contro l'altro, così come le proteine FNR, FTSH2 e HCF136 contro le subunità PSI. I rapporti peptidici ogni conteggio scansione per proteine di tutti i quattro replicati sono stati testati per la distribuzione normale con il test di Shapiro-Wilks. Poiché le popolazioni peptide non erano normalmente distribuiti (p <0.001), sono stati eseguiti statistica non parametrica. In primo luogo, il test di Kruskal-Wallis è stato applicato valutare una divergenza significativa tra i gruppi. Solo se questo test previsto differenza significativas tra gruppi, ulteriori analisi è stata effettuata per prevedere differenze significative tra i due gruppi indipendenti con il test di Mann-Whitney-U.
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Representative Results
L'approccio di proteomica quantitativa introdotto mira a caratterizzare la composizione dei complessi multiproteici in membrane tilacoidi dimostrato dall'analisi comparata dei componenti CEF-supercomplex in geneticamente differenti C. reinhardtii ceppi. Il metodo descritto è stato applicato con successo da Terashima et al. 6 e comprende l'isolamento di membrane tilacoidi da colture anaerobiche cresciuta, seguiti da solubilizzazione detergente. Successivamente, i campioni vengono caricati su un gradiente di saccarosio basato su importo pari clorofilla e complessi sono frazionati mediante ultracentrifugazione. Per l'analisi quantitativa MS-volumi uguali di due frazioni gradiente di ceppi diversi sono mescolati e comparativamente analizzati (Figura 1). I risultati presentati comprendono il confronto della frazione CEF-supercomplex tra WT cw15-arg7 e ΔPSI nonché WT cc124 e pgrl1 rispettivamente.
(Figure 2A e 2B) sono state scelte 6. Figura 3 illustra i rapporti proteici relativamente da WT / ΔPSI (14 N / 15 N) per vari nucleo PSI e proteine LHCI (proteine luce raccolta di PSI anche chiamata come proteine Lhca) nonché per le proteine assegnate con la CEF-supercomplex. Come previsto, proteine core PSI si trovano solo nei campioni WT dimostrate da rapporti di infinito in entrambe le frazioni. Lhca2 e Lhca9 sono arricchite nel WT, mentre Lhca4 -6 e -8 mostrano un regolamento diverso in entrambe le frazioni. È importante notare che le proteine sono sintetizzate LHCI e accumulati normalmente nella ΔPSI mutante 41. Il confronto polipeptide della PSI-LHCIcomplesso da C. reinhardtii WT con il complesso LHCI del mutante ΔPSI rivelato che la maggioranza dei Lhca2, -3 e -9 sembra essere solo debolmente alle LHCI e inoltre che la presenza del nucleo PSI è necessario per un legame stabile. Al contrario, Lhca1, -4, -6, -7 e -8 formano un complesso indipendente del gruppo del PSI 14, il che potrebbe spiegare la diversa regolamentazione di Lhca4, -6 e -8 nel presente esperimento.
Per le proteine essere assegnate con la CEF-supercomplex, si può distinguere tra quelli che sono più abbondanti nella frazione WT 6 e frazione 13 del mutante ΔPSI, mostrando una forte migrazione PSI-dipendente visualizzata da una proporzione più elevata di una frazione per 6 e rapporti inferiori a uno o non rilevati in frazione 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, PFD, HCF136 e cyt f) e quelli che non mostrano una tale forte, ma comunque una localizzazione PSI-dipendente (FNR, FTSH1, FTSH2, e ATPC ).
Con questo esperimento Terashima et al. 6 dimostrato un comportamento migrazione PSI-dipendente per ANR1 e CAS (figure 2A-D e Figura 3), rivelando così come nuove proteine del CEF-supercomplex, precedentemente non identificati 7. I risultati del MS-analisi sono stati confermati anche da immunorivelazione e sostenuti con l'applicazione della genetica inversa per confermare un ruolo funzionale di queste proteine per CEF in vivo 6. Inoltre, questo approccio comparativo MS-sostiene con forza i risultati di studi precedenti, confermando le proteine che sono già stati dimostrati di essere parte del CEF-supercomplex come PGRL1, cit f e FNR 7, così come Lhcbm5 7,9 per mostrare una localizzazione PSI-dipendente in gradiente di densità di saccarosio, che è paragonabile a ANR1 e CAS.
Il confronto della frazione 6 e 13 della anr1 e ΔPSI utilizzando lo stesso approach (vedi Figura S8 6) ha dimostrato una simile composizione del CEF-supercomplex in anr1 e la stessa tendenza per le proteine ANR1, CAS e PGRL1 come rivelato nell'esperimento WT vs ΔPSI. In particolare, anche se il rapporto proteina di ANR1 in frazione 6 (anr1 vs ΔPSI) è paragonabile al rapporto del WT vs esperimento ΔPSI, le quantità di CAS e PGRL1 sembrano essere più elevati nel primo esperimento e potrebbe essere il risultato di compensando la down-regolazione di ANR1 6.
Inoltre, l'arricchimento di ANR1 e CAS nella frazione CEF-supercomplex si potrebbe anche dedurre la migrazione PSI-dipendente di diverse altre proteine da questo esperimento. Si tratta di due metalloproteasi ATP-dipendenti FTSH1 e FTSH2 che giocano un ruolo fondamentale nella degradazione del PSII centro di reazione proteina D1 in cloroplasti 42,43, una proteina contenente prefoldin-dominio, il HCF136, che è un fattore cruciale per la stabilità o assembly di PSII 44 e la subunità γ della ATPasi. Mentre per quello successivo, i rapporti tra frazione 6 e 13 non mostrano una differenza così netta, ulteriori esperimenti devono essere effettuati per verificare se le altre proteine potrebbe anche essere candidati del CEF-supercomplex.
Come un proof of concept esperimento per questo approccio comparativo, abbiamo analizzato la composizione CEF-supercomplex in due ceppi, che entrambi hanno PSI, permettendo la formazione di questo complesso. Le rispettive frazioni sono stati selezionati sulla base delle misurazioni di assorbanza dei gradienti frazionati. Figure 4A e 4B mostrano i risultati del confronto quantitativo tra WT e un ceppo pgrl1 knock-out. Va sottolineato che ANR1 e CAS non sono notevolmente cambiati tra WT e pgrl1. È interessante notare che, HCF136 sembra essere arricchito in WT, mentre FTSH2 sembra essere arricchito in pgrl1. Un SI statisticamentedifferenza gnificant per entrambe le proteine di cui sopra a tutte PSI-subunità (compresi le proteine LHCI) potrebbe essere confermata.
Inoltre, il citocromo b 6 / F subunità complessi cit f e Peto hanno dimostrato di essere significativamente diversa da cyt b 6, cyt b 6 / f IV e PETC, rispettivamente. In particolare, cit f sembra essere up-regolata in pgrl1, mentre cyt b 6 e cyt b 6 / f IV sono leggermente down-regolato, anche se la regolazione della sintesi f cit probabilmente coinvolge cyt b 6 e cyt b 6 / f IV 45 . Il PETC nucleare codificato, che è anche conosciuto come proteina Rieske mostra un regolamento simile a cyt b 6 e cyt b 6 / f IV (cioè un down-regulation in pgrl1). Ciò è sorprendente, come riduzione o assenza della proteina Rieske ancora portare all'accumulo del OTHer citocromo b 6 / subunità f per ~ 60% del livello di WT in C. reinhardtii 46. Inoltre, l'up-regolazione PETO in pgrl1 È importante notare, poiché questa subunità legame debole ha dimostrato di accumularsi a livelli ridotti di C. reinhardtii mutanti privi sia citocromo b 6, citocromo b 6 / f IV o PETC 47, che sono meno abbondanti in pgrl1 rispetto al WT nel presente esperimento.
Figura 1. Flusso di lavoro sperimentale come illustrato per la WT e ΔPSI. Cellule sono metabolicamente etichettati per almeno quattro generazioni, condizioni anaerobiche sono indotte da argon bubbling per 4 ore e le membrane tilacoidi sono isolati attraverso la separazione gradiente. L'isolamembrane ted vengono solubilizzati mediante β-DM, caricato su un gradiente di saccarosio (per entrambi i ceppi uguali quantità di clorofilla sono applicati in questa fase) e centrifugati notte. Le frazioni gradiente vengono raccolti e analizzati mediante SDS-PAGE e immunodetezione per determinare la distribuzione delle proteine all'interno del gradiente. Per identificare le proteine con una migrazione PSI-dipendente, volumi uguali della frazione CEF-supercomplex WT (numero frazione 6) e la corrispondente frazione N-15 marcato dal ceppo ΔPSI sono stati mescolati e comparativamente analizzati. Lo stesso è stato fatto con la frazione di picco ANR1 nel ceppo ΔPSI (frazione numero 13). Per l', quantitativa MS-approccio comparativo, i campioni di proteine misti sono stati separati mediante SDS-PAGE, bande proteiche sono state colorate con soluzione di blu di Coomassie, seguita da digestione in-gel prima di MS-analisi. Clicca qui per ingrandire image.
Figura 2. ANR1 e CAS migrano verso le regioni più bassa densità nel ceppo ΔPSI. A:. Gradienti di densità di saccarosio degli WT e ΔPSI tilacoidi isolati da condizioni anaerobiche sono stati divisi in 20 frazioni B: immunorivelazione delle ANR1 nelle 20 frazioni del gradiente di WT e ΔPSI. Mentre questa proteina è localizzata nella regione a densità maggiore nel WT (frazione 6) è spostato fino alle regioni più bassa densità nel ceppo ΔPSI (frazione 13) C:. Gradienti di densità di saccarosio degli WT e ΔPSI tilacoidi isolati da condizioni anaerobiche sono stati divisi in 27 frazioni D:. immunorivelazione del CAS in 27 frazioni del gradiente di WT e ΔPSI. Mentre questa proteina è localizzata to la regione più alta densità nel WT (con un picco intorno frazione 7) è up-spostato alle regioni più bassa densità nel ceppo ΔPSI (con un picco intorno frazione 19). (Questa cifra è stata modificata da Terashima et al. 6). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Relativa rapporti proteiche determinate frazione 6 e 13 da WT e ΔPSI mediante spettrometria di massa quantitativa. Frazioni 6 e 13 da WT sono state confrontate con le rispettive frazioni del ceppo ΔPSI 15 N-marcato. I rapporti di proteine relativi che rappresentano due repliche biologiche e tre MS-run sono raffigurati come WT / ΔPSI (14N / 15 N) sia analizzato frazioni ad eccezione del citocromo f, che è stato identificato solo in frazione 6. Tale quantificazione comparativa rivela che ANR1 e CAS mostrano una migrazione PSI-dipendente nel gradiente di densità di saccarosio (questa cifra è stata modificata Terashima et al. 6). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4. Rapporti proteici relativi determinati nella frazione CEF-supercomplex di WT e pgrl1 mediante spettrometria di massa quantitativa. A: gradienti di saccarosio densità di WT e thylakoids pgrl1 isolati da condizioni anaerobiche B: proteine. Rapporti relativi between la frazione CEF-supercomplex derivanti da quattro diverse repliche raffigurato come WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). In questo esperimento ANR1 e CAS non sono notevolmente cambiati, mentre FTSH2 e HCF136 presentano differenze significative rispetto a tutti PSI-subunità (p ≤ 0,001 come indicato dalla *** in rosso; HCF136: 1900 <U <58.127; FTSH2: 2117 <U <164.197). Inoltre, i cit B 6 / f subunità complessi cit f e Peto hanno dimostrato di essere significativamente diversa da cyt b 6, cyt b 6 / f IV e PETC, rispettivamente (p ≤ 0,001 come indicato dalla *** in blu; cyt f : 2.684 <U <11535; PETO:. 4700 <U <23663) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Diversi studi di proteomica quantitativa, utilizzando l'etichettatura degli isotopi stabili sono stati pubblicati negli ultimi anni. In questi esperimenti solitamente due diversi campioni sono confrontati, di cui un campione è marcato con un isotopo stabile. Successivamente proteine o peptidi dai due campioni vengono combinati in un rapporto uguale e successivamente trattati insieme 48. Tali studi spesso intendono confrontare compartimenti definiti isolati cellulari (ad esempio cloroplasti, mitocondri o membrane tilacoidi) esposti a diverse condizioni di stress 26,34,49 per indagare up-o down-regulation di proteine specifiche. Il comparativo, proteomica quantitativa descritto lo scopo di analizzare la composizione di complessi multiproteici nella membrana tilacoidi e, in contrasto con gli studi di cui sopra, si basa sulla miscelazione stesso volume di campioni dopo separazione densità di saccarosio membrane tilacoidi caricato in concentrazione pari clorofilla prima ultracentrifugazione. Questo metodo è stato efficacemente applicato da Terashima et al. 6 che comparativamente analizzato la composizione del CEF-supercomplex isolato da un WT e un ceppo ΔPSI per identificare le proteine migrano PSI-dipendente in un gradiente di densità di saccarosio.
Il raggiungimento di questa strategia è provato dal fatto che i MS-risultati sono confermati da immunorivelazione. Inoltre, Terashima et al. Potrebbe confermare i risultati di studi precedenti (ossia l'identificazione e PSI-dipendente migrazione delle proteine già descritte a far parte del CEF-supercomplex, come PGRL1, FNR e cyt f 7). L'identificazione di ANR1 e CAS quali nuovi componenti del CEF-macchine 6 rivela questo approccio come uno strumento molto potente ed efficiente. In particolare, l'isolato CEF-supercomplex esposto in attività in vitro, dimostrando così la purificazione di successo di una funzionezionale multiproteico complesso 6. L'applicabilità di questo approccio anche per i due ceppi di cui entrambi formano una CEF-supercomplex è dimostrato dal confronto tra WT e pgrl1.
In generale, questo metodo può essere utilizzato per rilevare composizioni complesse in ceppi o condizioni diverse, come rivelato dalla identificazione di proteine precedentemente identificati che sono copurified con la frazione CEF-supercomplex (cioè l'arricchimento di FTSH1, FTSH2, PFD, e HCF136 nella frazione CEF-supercomplex). Se queste proteine sono possibili nuovi candidati di questo complesso e per migliorare la nostra comprensione per la diversa regolazione della FTHS2, HCF136, così come per i citocromo b 6 / f subunità come rivelato dal confronto di WT e pgrl1, ulteriori esperimenti sono necessari.
Oltre ai vantaggi descritti di questo approccio, vi sono diverseAL passaggi critici che devono essere attentamente considerato quando si lavora con questo protocollo: La rottura delle cellule con il nebulizzatore è il primo passo importante. Se l'apertura di cellule non avviene in modo corretto, il rendimento di tilacoidi isolati sarà piuttosto basso e potrebbe causare quasi nessun rilevamento del CEF-supercomplex dopo durante la notte centrifugazione. L'interruzione di successo di cellule può essere dedotta dal colore verde chiaro del surnatante dopo centrifugazione. Al contrario, se la pressione durante la distruzione cellulare è troppo elevato, parti del supercomplex potrebbero disintegrano e cofattori importanti potrebbero essere persi. Un altro passo influenzare la resa di tilacoidi è risospensione delle cellule con un Potter. Questo deve essere effettuata con attenzione e alla fine di questa fase solo poche particelle verdi dovrebbe rimanere. Inoltre, per la preparazione della densità di saccarosio gradienti il giorno prima e per la solubilizzazione di complessi di membrana, è molto importanteseguire precisamente questo protocollo in termini di concentrazione di β-DM, poiché questa è fondamentale avere tilacoidi completamente solubilizzati 50 e quindi anche per la purificazione del CEF-supercomplex. Il passo solubilizzazione è stata eseguita con successo se una piccola, pellet biancastro si osserva dopo la successiva fase di centrifugazione. Un altro punto critico che dovrebbe essere qui menzionato è il tempo di over-night ultracentrifugazione. I gradienti di densità di saccarosio devono essere centrifugati per almeno dodici ore per raggiungere la piena separazione dei complessi fotosintetici.
Anche se il protocollo è dimostrata utilizzando C. reinhardtii per l'analisi comparativa della composizione CEF-supercomplex in due ceppi geneticamente diversi, è facilmente adattabile anche ad una vasta gamma di altre questioni, come ad esempio le analisi comparative dei multiproteico composizione complessa isolato dal distinta ambientale / sperimentalecondizioni o utilizzando altri tipi di frazionamento. Gli unici requisiti di questo sistema è che il modello organismo può essere coltivato in coltura cellulare, è in grado di utilizzare ammonio come fonte di azoto complessi e proteine possono essere separate da gradienti di densità di saccarosio, dimostrando una larga applicazione di questo metodo. Per la futura applicazione di questo approccio SDS-PAGE frazionamento dei misti 14 N / 15 N campioni e la successiva digestione in-gel potrebbe essere sostituito applicando il metodo (FASP) preparazione dei campioni del filtro assistita. Questo metodo comprende l'applicazione di forti detergenti per solubilizzazione inibitori a "ripulire" proteoma prima digestione e avere peptidi purificati, evitando gli svantaggi dell'approccio in-gel digestione che può inibire il recupero peptide, anche se occorre considerare che in-gel digestione è descritto essere robusto alle contaminazioni che potrebbero interferire con la digestione 51.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza concorrente interesse finanziario.
Acknowledgments
MH riconosce il sostegno della "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Autore Contributi: MH progettato ricerca; KT, JS e MT svolto attività di ricerca e analizzato i dati, KT e MH ha scritto il giornale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
