Summary
A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados por espectrometria de massa.
Abstract
O protocolo introduzido fornece uma ferramenta para a análise de complexos multiproteicos na membrana tilacoide, revelando insights composição complexa, sob diferentes condições. Neste protocolo a abordagem é demonstrada através da comparação da composição do complexo de proteínas responsáveis pela cíclico fluxo de electrões (CEF) na Chlamydomonas reinhardtii, isolado a partir de estirpes geneticamente diferentes. O processo compreende o isolamento de membranas de tilacóides, seguida pela sua separação em complexos multiproteicos por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, SDS-PAGE, espectrometria de imunodetecção e comparativa, quantitativa de massa (MS) com base na marcação metabólica diferencial (14 N / 15 N) do cepas analisadas. Tilacóides solubilizados detergentes são carregados em gradientes de densidade de sacarose na concentração igual clorofila. Após ultracentrifugação, os gradientes são separados em fracções, as quais foram analisadas por massa spectrometry baseado em igual volume. Esta abordagem permite a investigação da composição dentro das frações de gradiente e, sobretudo, para analisar o comportamento de migração de proteínas diferentes, com especial incidência sobre ANR1, CAS, e PGRL1. Além disso, este método é demonstrado pela confirmando os resultados com immunoblotting e, adicionalmente, apoiando as descobertas de estudos anteriores (a identificação e a migração dependentes do PSI de proteínas que foram previamente descritos para fazer parte da CEF-supercomplex como PGRL1, FNR, e cit f). Notavelmente, esta abordagem é aplicável para tratar uma ampla gama de questões para as quais este protocolo podem ser adotadas e, por exemplo utilizados para análises comparativas de composição complexa multiprotein isolado de condições ambientais distintas.
Introduction
Processos fotossintéticos em tilacóides de plantas e algas podem funcionar de modo linear e cíclica. Durante o fluxo de elétrons linear (LEF) fotossistema I (PSI), fotossistema II (PSII) e citocromo b 6 / f em última análise, transferir elétrons da água para o NADP + 1, o que leva à geração de NADPH e ATP 2. Em contraste, cíclico fluxo de elétrons (CEF), que é conhecido por ser induzida sob diversas condições ambientais, como o estado 2 3 e 4, as condições anaeróbias resulta na redução de re do PSI oxidados através da injeção de elétrons de volta para a cadeia de transporte de elétrons. Este processo pode ocorrer tanto no lado do estroma do citocromo b 6 / f complexo 1 ou na piscina plastoquinona 5 e gera ATP, mas não NADPH 2.
O objectivo do protocolo apresentado serve para demonstrar a espectrometria de massa (MS) m baseadoétodo para a análise comparativa e quantitativa de complexos multiprotein em tilacóides de Chlamydomonas reinhardtii para obter insights sobre a composição destes complexos em condições diferentes (exemplificadas comparando linhagens geneticamente diferentes). Esta abordagem foi aplicada em uma publicação por Terashima et al., Em 2012, mostrando uma Ca 2 +-regulação dependente da CEF em C. reinhardtii mediada por um complexo multiproteico, incluindo as proteínas do CAS, ANR1, e PGRL1 6. O procedimento será explicado por comparativamente a análise da composição de CEF-supercomplex em duas estirpes geneticamente diferentes, tirando assim partido de rotulagem uma das duas estirpes com azoto pesado (15 N). Resumidamente, o protocolo inclui a preparação de membranas de tilacóides, seguido de solubilização detergente e fraccionamento de complexos fotossintéticos em um gradiente de densidade de sacarose. Após o fracionamento do gradiente, frac selecionadoções de duas estirpes são misturadas com base no volume igual, separadas por SDS-PAGE seguido por digestão em gel e subsequente análise por MS quantitativa.
Como mencionado acima, a CEF é induzida em diferentes condições ambientais e uma publicação de 2010 demonstra o isolamento de um funcional CEF-supercomplex de estado 2 de células bloqueadas C. reinhardtii 7, a qual foi realizada por separação tilacóides solubilizados em um gradiente de densidade de sacarose durante a ultracentrifugação. Diferente do Iwai et al. 7, o protocolo apresentado descreve o isolamento de CEF-supercomplex de anaeróbio crescido C. culturas reinhardtii, seguindo um procedimento alternativo. Isto inclui mudanças no protocolo de isolamento thylakoid bem como as diferenças relativas ao passo solubilização ea separação de complexos de proteínas por ultracentrifugação. No presente protocolo, tilacóidessão isolados mediante a aplicação do processo publicado por Chua e Bennoun 8, enquanto que os tampões usados para a preparação de tilacoide por Iwai et al. continha 25 mM de Mes, 0,33 M de sacarose, 5 mM de MgCl2, 1,5 mM de NaCl (pH 6,5) como descrito 9. A solubilização foi realizada com 0,7-0,8% de detergente (de n-tridecil-β-D-maltósido) durante 30 min em gelo, no caso de Iwai e colegas de trabalho, enquanto o método de solubilização descrito aqui baseia-se no uso de 0,9% de detergente (n -Dodecil-β-D-maltósido (β-MS)) e é realizado por apenas 20 minutos em gelo. Ambos os grupos utilizaram 0,8 mg de clorofila por ml para a solubilização com o respectivo detergente. Para a separação dos complexos fotossintéticos de tilacóides solubilizadas Iwai et al. Aplicadas concentrações de sacarose entre 0,1-1,3 M, ao passo que os autores deste protocolo utilizado concentrações variando 0,4-1,3 M. A última diferença é a velocidade de centrifugação, que é menor em comparação ao eApublicação rlier.
A solubilização das membranas tilacóides com detergentes não iónicos, seguido por fraccionamento de densidade de gradiente de sacarose foi já aplicado em numerosos estudos que vão desde a década de 1980 até hoje 7, 9-14 e também a aplicação da marcação metabólica das proteínas é um método generalizado no campo proteómica. A abordagem descrita aplica-se a marcação metabólica 15N para uma das duas estirpes por cultura de comparação que, na presença de azoto pesado como única fonte de nitrogénio na forma de 15 N NH 4 Cl, o que é incorporada em todos os aminoácidos que conduzem a uma massa mudar dependendo da sequência de aminoácidos do péptido. Quando a análise de uma mistura de 14 N e 15 N dentro de um MS executado, este deslocamento de massa pode ser usada para determinar a origem da amostra, para cada péptido e o péptido relativa abundância pode ser calculada representando abundâncias relativas para o correspondenteção da proteína 15.
Numerosos estudos quantitativos sobre proteômica C. reinhardtii estão disponíveis, o que comparar uma quantidade definida de proteína para analisar as alterações do proteoma entre as condições experimentais (por exemplo, mudanças no proteoma de nutrientes devido a 16-19 ou luz estresse 20,21). Comparado a esses estudos, a abordagem atualmente apresentada volumes iguais de amostras são combinados e analisados. Esta configuração permite estudar o comportamento de migração das proteínas dentro da inclinação e, além disso, a análise da composição de diferentes complexos com respeito às estirpes investigadas.
Este método irá ser explicada pela concentração principalmente em três proteínas: O primeiro candidato é o CAS proteína sensor de cálcio localizada-cloroplasto, que foi mostrado estar envolvida na foto-aclimatação em C. reinhardtii 22. O cálcio é considerado para ser um sinal importanteção de íons para caminhos que são ativados devido a diferentes estresses bióticos e abióticos, finalmente, levando a mudanças na expressão genética e fisiologia da célula 23 e foi proposto que os cloroplastos podem contribuir para celular Ca 2 + sinalização via proteína CAS 22,24,25. A segunda proteína é ANR1 (resposta anaeróbia 1 6), uma proteína que se mostrou ser induzida em condições de crescimento em anóxicas C. reinhardtii 26. Notavelmente, CAS, bem como ANR1 foram identificadas como subunidades de CEF-supercomplex e, além disso, utilizando abordagens genéticas reversa, foi demonstrado que ambas as proteínas funcionalmente contribuir para CEF in vivo 6, suportando o seu papel como subunidades funcionais deste complexo proteína. A terceira proteína é a proteína de tilacoide PGR5-like 1 (PGRL1), que foi mostrado estar envolvidas em CEF em Chlamydomonas 4,27, bem como em Arabidopsis 5,28 e era também IDentified no trabalho de Iwai et al. 7
Esta abordagem irá ser apresentada mostrando os resultados de duas experiências diferentes: de tipo selvagem (WT) versus (vs) uma estirpe ΔPSI 29, apresentando uma deleção do gene PSAB, que codifica para uma subunidade fotossistema essencial I, que também é parte da CEF-supercomplex e WT contra um pgrl1 knock-out tensão 4. Para cada uma destas experiências, a composição quantitativa do CEF-supercomplex entre 15 N e uma deformação de 14 N-etiquetada tem sido comparado.
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Protocol
1. A cultura de Chlamydomonas
- A seguir C. reinhardtii cepas foram utilizados no presente estudo: WT cc124, WT CW15-arg7 (da parede celular deficiente e arginina auxotrofo), uma estirpe mutante ΔPSI 29 e um pgrl1 knock-out tensão 4.
- Todas as estirpes foram crescidas em Tris-Acetato-Fosfato (TAP) médio de 30 a 25 ° C, com uma intensidade de luz contínua de 20-50 μE / m 2 seg e agitando a 120 rpm. A cultura da ΔPSI deve ser envolvido com algum papel de tecido para a exposição à luz de <5 μE / m 2 seg.
- As culturas de estirpes marcadas (ΔPSI e WT cc124, respectivamente) continha 7,5 mM de 15 N NH 4 Cl, enquanto que as culturas de estirpes não marcado (WT CW15-arg7 e pgrl1, respectivamente) continha 7,5 mM de 14 N NH 4 Cl. As células têm de crescer em pelo menos quatro gerandoiões para atingir rotulagem completa e deve ser mantida na fase de crescimento exponencial.
- No dia antes de iniciar a contagem de experiência e diluir as células a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em um volume de pelo menos 750 ml / deformação.
Por favor note que dois tipos de gradientes de densidade de sacarose descontínuo são descritos no seguinte protocolo. Os gradientes de densidade fotossistema sacarose de acordo com Takahashi et al. 9 são usados para separar os diferentes complexos de proteína fotossintética de tilacóides isolados e solubilizados durante durante a noite centrifugação e tem que estar preparado no dia anterior (ver Protocolo 2) e os gradientes de densidade de sacarose thylakoid 8 são aplicados no procedimento de isolamento thylakoid (ver protocolo 3).
2. Preparação de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema
- Para despejar os gradientes são necessários três soluções estoque:
- 2 M de sacarose
- 10% β-DM em H2O
- 0,5 M de Tricina, pH 8,0 (NaOH)
- Usando essas ações, preparar as seguintes soluções:
Concentração: 1,3 M 1,0 M 0,85 M 0,7 M 0,65 M 0,4 M 2 M de sacarose 13 ml 10 ml 8,5 ml 7 ml 6,5 ml 4 ml 10%46;-DM 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 0,5 M Tricina 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul H2O 6,7 ml 9,7 ml 11,2 ml 12,7 ml 13,2 ml 15,7 ml - Utilize tubos de 14 milímetros x 89 milímetros de centrífuga e despeje os gradientes muito lentamente, começando com a solução de mais elevada densidade de sacarose a solução de menor densidade.
- Despeje apenas 1 ml cada, para os 1,3 e 1,0 M e 2 ml de soluções para o resto das soluções.
- Deixe gradientes durante a noite no quarto frio.
3. Anaerobic Indução e Isolamento de membranas tilacóides 8
- Antes de começar com o isolamento de membranas de tilacóides, induzir condições anaeróbicas, fazendo borbulhar árgon durante 4 h. O borbulhamento pode ser realizada por meio de uma pipeta de vidro de cultura de frascos com agitação constante da cultura com uma barra de agitação magnética.
- Comece com o isolamento de membranas de tilacóides por sedimentação das células durante 5 min a 2500 xg, ressuspender em tampão de H1 (0,3 M de sacarose, 25 mM de HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2).
(Por favor, note que quando se inicia com o isolamento de amostras de membranas tilacóides should ser mantidos em gelo para evitar a degradação de proteínas, todos os passos de centrifugação são realizados a 4 ° C e a trabalhar com luvas é fortemente recomendada para evitar a contaminação de queratina.) - Células de pellets por 5 min a 2.500 xg, ressuspender em tampão H1.
- Quebre as células com duas passagens através de um nebulizador com uma pressão de azoto de 1500 hPa (para as estirpes sem parede celular fazer apenas uma passagem).
- Gire para baixo as células de 7 min a 2.500 x g.
(Após este passo, o sobrenadante deve ser verde claro, se não, a ruptura celular não foi bem sucedida.) - Ressuspender as células em tampão de H2 (0,3 M de sacarose, HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e as células peletizadas para 10 min a 32.800 x g.
- Ressuspender as células em tampão de H3 (1,8 M de sacarose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e homogeneizar pelota com um potter (sem partículas verdes deve permanecer no final desta etapa de trabalho).
- Prepare gradientes de densidade de sacarose thylakoid em banheiraes (25 mm x 89 mm) por começando na parte inferior com uma camada de 12 ml de tampão com células H3, verter uma camada do meio, de 12 ml de tampão H4 (1,3 M de sacarose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de EDTA ( pH 8,0)) e no topo de 12 ml de tampão H5 (0,5 M de sacarose, HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Tenha cuidado ao despejar os gradientes e evitar a mistura das três camadas.
- Equilibrar com tampão H5 e gradientes de densidade de sacarose tilacói centrífuga durante 1 hora a 70.700 x g.
- Retirar bandas tilacói dos gradientes de densidade de sacarose e tilacóides diluí-los com um volume de tampão H6 apropriado (HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)).
- Gire as células em 37.900 xg por 20 min. Se a pastilha não é apertado, mais tampão H6 é necessário para este passo de centrifugação.
- Ressuspender thylakoids em um buffer H6 pequeno volume e prosseguir com determinação da concentração de clorofila.
4. Determinação da Concentração de Clorofila 31
- A determinação da quantidade de clorofila é realizada com 80% de acetona.
- Misturar 995 mL de 80% de acetona e 5 mL de tilacóides em tampão H6 (diluição 1:200).
- Vortex por alguns segundos até que não haja partículas verdes permanecem e, em seguida, girar em 14,1 g durante 5 min.
- Leve o sobrenadante e medir a extinção em 663,6 e 646,6 nm e 750 nm, respectivamente.
- Calcula-se a quantidade de clorofila utilizando a seguinte fórmula:
- C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * factor de diluição
- C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * factor de diluição
- C Chl [mg / ml] = C + C Chl a Chl b
5. Carregamento de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema
- Calcule a quantidade de tilacóides, β-DM e tampão H6 que são necessáriospara cada gradiente:
- Cada rampa deve ser carregado com um volume total de 700 ul com 0,8 mg / ml em 0,9% de clorofila β-MS (dissolver β-DM em H 2 O), preencher o volume restante com tampão H6.
- Para solubilização preparar diferentes alíquotas, com tilacóides, β-DM e tampão H6 para cada gradiente.
- Deixar as amostras durante 20 minutos em gelo, com agitação regular (inversora) a cada poucos minutos (passo de solubilização).
- Centrifugar a uma velocidade máxima (14000 xg) durante 10 min a 4 ° C.
(Após a centrifugação, o sedimento deve ser pequeno e esbranquiçado, enquanto o sobrenadante é verde-escuro.) - Carregar sobrenadante sobre os gradientes.
- Equilibrar com tampão H6 e girar usando ultracentrífuga a 134.470 xg durante a noite (14 horas) a 4 ° C.
(Por favor, note que a separação bem sucedida de complexos fotossintéticos usando gradientes de densidade fotossistema sacarose como apresentado neste protocolo só é alcançada quando using recém tilacóides isolado, uma vez que uma previsão para a solubilização e separação complexo é difícil de fazer quando se trabalha com membranas de tilacóides que tenham sido congeladas antes.)
6. Fracionamento de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema
- Tire fotos dos gradientes.
- Perfurar um furo na parte inferior do tubo por meio de uma agulha e gradientes de fraccionar em 500 tubos de ul. Alternativamente, o fraccionamento pode também ser realizado usando uma placa de 96 cavidades (microplaca).
- Ao utilizar uma microplaca, determinar a absorbância das diferentes frações do gradiente em 675 nm.
(Neste passo as amostras podem ser armazenadas a -80 ° C durante algumas semanas.)
7. SDS-PAGE e imunodetecção
(Por favor, note que apenas a comparação de WT vs ΔPSI um western blot foi realizada para selecionar as frações para posterior MS-análise. Para o experimento WT vs pgrl1 fracções foram escolhidos por meio da absorção em diferentes fracções.)
- Separe 30 ul de cada fracção de WT e ΔPSI gradiente em 13% de SDS em gel de poliacrilamida 32.
- Realizar análise de western blot 33 utilizando os seguintes anticorpos: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, o AASI PSI subunidade 32 e PSII núcleo subunidade D1. Use todos os anticorpos com uma diluição de 1:1.000 (por técnica de detecção de quimioluminescência aumentada), excepto para o anticorpo D1, que deve ser utilizado com uma diluição de 1:10.000.
- Com base nos resultados da imunodetecção, tomar as frações de pico de ANR1, PGRL1 e AASI para WT e ΔPSI (aqui frações 6 e 13, respectivamente), misturar 30 mL da fração 6 do WT e ΔPSI e fazer o mesmo com a fração de 13 de ambas as composições e separar os novamente sobre um gel de poliacrilamida SDS a 13%.
- Para a comparação quantitativa do WT vs pgrl1 tomar o CFracções EF-supercomplex como determinado através da medição da absorvância nas diferentes fracções do gradiente e misturar 30 ul de ambas as amostras, seguido por separação num gel de SDS-poliacrilamida a 13%.
- Manchar as bandas de proteína com uma solução de Coomassie (ácido fosfórico 85%, sulfato de amónio 757 mM, 1,2% de azul brilhante de Coomassie, 20% de metanol) durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Para remover manchas inespecífica, lavar várias vezes com DDH 2 O.
- Corte as pistas em um milímetro pedaços de gel e prosseguir com a digestão em gel.
(Alternativamente, as amostras podem ser secas de alguns minutos em uma centrífuga de vácuo e armazenados durante algumas semanas antes de continuar com a digestão em gel.)
8. A digestão em gel (a partir de modificação Shevchenko et al. 35)
Por favor, note a preparar todos os buffers e soluções imediatamente antes da utilização e tomar garrafas de vidro para buffers contendo acetonitrila (ACN). <br /> ATENÇÃO! Trabalhando com ACN pode ser prejudicial; mais informações pode ser baixado em: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).
- Lavar com pedaços de gel> 10 volumes de ddH2O (~ 200 mL) durante 30 seg.
- Incubar os pedaços de gel, com 300 ul de mM NH 4 HCO 3 25 durante 15 min com agitação, remover o líquido.
- Incubar os pedaços de gel, com 300 ul de mM NH 4 HCO 3 25 em 50% de ACN (preparar por mistura de ACN e 50 mM NH 4 HCO 3 a uma razão de 1:1) durante 15 min com agitação, remover o líquido.
- Se as peças de gel são ainda azul, repetir o NH 4 HCO 3 e NH 4 HCO 3 / ACN lava até a maioria do Coomassie é removido.
(Embora a maior parte da coloração com Coomassie deve ser removido, ele não é necessário para Destain os pedaços de gel completamente.) - Adicionar 100 ul de ACN para desidratar os pedaços de gel por 5 min. Os pedaços de gel deve encolher umª olhar completamente branco.
- Remover o máximo possível ACN e prossiga com a digestão de tripsina. Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C durante algumas semanas.
- Adicionar 10-20 mL por banda de 20 ng / mL de tripsina em 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (recém diluído), manter as amostras em gelo.
- Após 30 min, verificar se toda a solução foi absorvida e adicionar mais tampão de tripsina, se necessário. Pedaços de gel deve ser completamente cobertas com tampão de tripsina. Manter as amostras em gelo.
- Deixar pedaços de gel por mais 90 min em gelo para saturar os com tripsina.
(Etapa crítica: a produção de peptídeos trípticos aumenta consideravelmente com o aumento do tempo de incubação em gelo, provavelmente por causa da difusão lenta da enzima na matriz de poliacrilamida É necessário ter um pequeno excesso de solução cobrindo os pedaços de gel para evitar que as peças. cair seco durante a incubação durante a noite.) - Digerir a 37 ° C durante 4-6 horas. Para os experimentos que requeremrecuperação peptídeo máxima, digerir durante a noite.
- Após a digestão girar tampão condensado.
- Sonicar tubos durante 5 min para eluir os péptidos e centrifugar de novo.
- Recolher o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo.
- Realizar a extracção de péptidos com 80 ul de 30% ACN / 1% de ácido fórmico (FA), num banho sónico, durante 15 min.
- Realizar a extracção com 80 mL de 30% de ACN / 1% de FA em um banho sónico, durante 15 min.
- Realizar a extracção com 80 mL de 70% de ACN / 1% de FA em um banho sónico, durante 15 min.
- Centrifugar novamente e piscina sobrenadante com o fluido antes.
(FA serve para inactivar a tripsina e aumentar a solubilidade do péptido). - Solução de peptídeo seca completamente numa centrífuga de vácuo.
(Nesse momento as amostras podem ser armazenadas durante algumas semanas, em -20 ° C, antes de prosseguir com o MS-análise). - Peptídeos Ressuspender em 6 mL MS tampão (5% ACN, 0,1 v / v FA, água) e sonicado por 2-5 min.
- Centrifugar as amostras a maximum velocidade durante 5 minutos para remover o material em partículas.
- Use 4 ul de sobrenadante para análise por espectrometria de massa.
9. MS-Análise de Dados com "Proteomatic"
A análise dos dados foi realizada com o software open-source "Proteomatic" (que pode ser baixado em http://www.proteomatic.org/), uma plataforma que permite a geração e realização de MS / MS pipelines de avaliação de dados, usando software livre e comercial 36. Resumidamente, as configurações são descritas a seguir e informações mais detalhadas podem ser encontradas em 6,26.
- Identificação e quantificação de dados MS-
A identificação e quantificação de proteínas de o WT vs ΔPSI experiências foram realizadas com OMSSA (versão 2.1.4 37) e qTrace 26, respectivamente, como descrito 6,26. Para a análise de dados a partir de MS-o experimento WT vs pgrl1 o seguinte oleoduto actualização foi utilizado:- Além OMSSA 37, as proteínas foram também identificados com X! Tandem (versão 2013/02/01 38). Ambos os algoritmos foram aplicados através de pesquisa contra um banco de dados gerado pela combinação do JGI Chlamydomonas banco de dados modelo gene versão 4.3 com a versão do banco de dados AUGUSTUS 10.2, bem como contra um banco de dados do NCBI juntou bancos de dados BK000554.2 e NC_001638.1.
- MS 2 Identificação de péptidos foi realizada utilizando uma abordagem de chamariz alvo 39. Um engodo para cada proteína foi criado por baralhar aleatoriamente péptidos trípticos, mantendo a redundância de péptidos nonproteotypic.
- Validação estatística dos péptidos foi realizada com o qvality software (versão 0.3.3 40) utilizando uma probabilidade de erro posterior (PEP) limiar de menos do que 0,01 e os resultados foram filtrados com uma tolerância de massa precursor de 5 ppm.
- Peptídeos de OMSSA e X! Runs Tandem se juntaram e quantificadas com qTrace
Para investigar se a proteína proporções foram significativamente diferentes em relação uns aos outros nas frações CEF-supercomplex mistas de WT e pgrl1, a análise estatística foi realizada a aplicação do software SPSS (versão 21). As sub-unidades do complexo de citocromo b 6 / f foram testados contra o outro, assim como as proteínas FNR, FTSH2 e HCF136 contra as subunidades PSI. Os rácios de péptidos de cada contagem de varredura por proteína de todas as quatro repetições foram testados para a distribuição normal com o teste de Shapiro-Wilks. Uma vez que as populações de péptidos não foram distribuídos normalmente (p <0,001), foram realizadas estatísticas não paramétricas. Primeiro, o teste de Kruskal-Wallis foi aplicado avaliando uma divergência significativa entre os grupos. Só se este teste previsto diferença significativas entre grupos, foi realizada uma análise mais aprofundada de prever as diferenças significativas entre os dois grupos independentes, com o teste de Mann-Whitney U-teste.
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Representative Results
A abordagem proteômica quantitativa introduzida tem por objetivo caracterizar a composição dos complexos multiprotein em tilacóides demonstrados pela análise comparativa dos componentes CEF-supercomplex em geneticamente diferente C. reinhardtii cepas. O método descrito foi aplicado com sucesso por Terashima et al. 6 e compreende o isolamento de membranas de tilacóides de anaeróbios cultivadas culturas, seguido por detergente de solubilização. Subsequentemente, as amostras são carregadas para um gradiente de densidade de sacarose com base na quantidade de clorofila igual e complexos são fraccionados por ultracentrifugação. Para a MS-análise quantitativa de volumes iguais de duas fracções do gradiente de diferentes estirpes são misturados e analisados comparativamente (Figura 1). Os resultados apresentados incluem a comparação da fracção CEF-supercomplex entre WT CW15-arg7 e ΔPSI bem como WT cc124 e pgrl1, respectivamente.
(Figuras 2A e 2B) foram escolhidos 6. Figura 3 mostra as proporções relativas de proteína como WT / ΔPSI (14 N / N 15) para vários núcleo PSI e proteínas (proteínas LHCI captação de luz do PSI também denominado como proteínas LHCA), bem como para proteínas designadas com a CEF-supercomplex. Como esperado, as proteínas do núcleo PSI só são encontrados em amostras WT demonstradas pelos índices infinito em ambas as frações. Lhca2 e Lhca9 são enriquecidos no WT, enquanto Lhca4 -6 e -8 mostrar um regulamento diferente em ambas as frações. É importante notar que as proteínas são sintetizadas LHCI e normalmente acumulado no mutante ΔPSI 41. A comparação polipeptídeo do PSI-LHCIcomplexo de C. WT reinhardtii com o complexo LHCI do mutante ΔPSI revelou que a maioria dos Lhca2, -3 e -9 parece ser apenas fracamente ligado à LHCI e, além disso, que é necessário para uma ligação estável na presença do núcleo PSI. Em contraste, Lhca1, -4, -6, -7, -8 e formar um complexo independente da montagem do PSI 14, o que poderia explicar a diferente regulamentação da Lhca4, -6 e -8 no presente experimento.
Para as proteínas para ser atribuídos com o CEF-supercomplex, pode ser distinguido entre aqueles que são mais abundantes na fracção WT 6 e 13 fracção do mutante ΔPSI, mostrando uma forte migração dependente de PSI exibido por razões mais elevadas do que uma fracção de 6 e índices mais baixos do que um ou não detectado na fração 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, PFD, HCF136 e cit f) e aqueles que mostram não um forte, mas mesmo assim a localização dependente do PSI (FNR, FTSH1, FTSH2 e ATPC tal ).
Com esta experiência Terashima et al. 6 demonstrou um comportamento de migração dependente de PSI para ANR1 e CAS (Figuras 2A-D e Figura 3), revelando-los assim como novas proteínas da CEF-supercomplex, anteriormente não identificada 7. As conclusões do MS-análise também foram confirmados por imunodetecção e apoiado pela aplicação da genética reversa para confirmar um papel funcional destas proteínas para CEF in vivo 6. Além disso, esta abordagem MS-comparativa apoia fortemente os resultados de estudos anteriores, confirmando as proteínas que já se demonstrou ser parte de CEF-supercomplex como PGRL1, cit f FNR e 7, bem como Lhcbm5 7,9 para mostrar uma localização dependentes do PSI com o gradiente de densidade de sacarose, o que é comparável ao ANR1 e CAS.
A comparação da fracção 6 e 13 de anr1 ΔPSI e usando o mesmo approach (ver Figura 6 S8) demonstraram uma composição semelhante da CEF-supercomplex em anr1 ea mesma tendência para as proteínas ANR1, CAS e PGRL1 como revelado no experimento WT vs ΔPSI. Notavelmente, embora a proporção de proteína de ANR1 na fracção 6 (anr1 vs ΔPSI) é comparável à relação entre o WT vs ΔPSI experimento, as quantidades de CAS e PGRL1 parece ser maior no primeiro ensaio e pode ser um resultado de para compensar a diminuição da regulação dos ANR1 6.
Além disso, o enriquecimento de ANR1 e CAS na fração CEF-supercomplex também se poderia deduzir a migração dependente do PSI de várias outras proteínas a partir desta experiência. Estes são dois metaloproteases dependentes de ATP e FTSH1 FTSH2 que desempenham um papel fundamental na degradação da proteína D1 FSII centro reacção em cloroplastos 42,43, um prefoldin-domínio contendo proteína, a HCF136, que é um factor crucial para a estabilidade ou assembly de PSII 44 e subunidade γ da ATPase. Considerando que, para um mais tarde, as relações entre a fração de 6 e 13 não mostram uma diferença tão clara, mais experimentos devem ser realizados para verificar se as outras proteínas também podem ser candidatos da CEF-supercomplex.
Como prova de conceito experimento para esta abordagem comparativa, foi analisada a composição CEF-supercomplex em duas linhagens, o que ambos têm PSI, permitindo a formação do complexo. As respectivas frações foram selecionados com base nas medidas de absorbância dos gradientes fracionadas. Figuras 4A e 4B mostram os resultados para a comparação quantitativa entre WT e um pgrl1 knock-out tensão. Deve-se salientar que ANR1 e CAS não são notavelmente mudou entre WT e pgrl1. Curiosamente, HCF136 parece ser enriquecida no WT, enquanto FTSH2 parece ser enriquecida em pgrl1. A si estatisticamentediferença gnificant para ambas as proteínas para todos os subunidades PSI (incluindo as proteínas LHCI) acima mencionados pode ser confirmada.
Além disso, as citocromo b 6 / f subunidades complexos CYT f e PETO foram demonstrou ser significativamente diferente do citocromo b 6, citocromo b 6 / f IV e PETC, respectivamente. Notavelmente, cit f parece ser sobre-regulada em pgrl1, enquanto cit b 6 e cit b 6 / f IV são ligeiramente para baixo-regulado, embora a regulamentação da cit f síntese provavelmente envolve cit b 6 e cit b 6 / f IV 45 . O nuclear codificado PETC, que também é conhecida como proteína Rieske mostra um regulamento semelhante ao cit b 6 e cit b 6 / f IV (ou seja, uma sub-regulação pgrl1). Isso é impressionante como uma redução ou ausência da proteína Rieske ainda levar ao acúmulo do other cit b 6 / f subunidades para ~ 60% do nível de WT em C. reinhardtii 46. Além disso, a sobre-regulação de PETO em pgrl1 É importante notar, uma vez que esta subunidade fracamente ligado foi mostrado acumular-se a níveis reduzidos em C. reinhardtii mutantes falta ou cit b 6, cit b 6 / f IV ou PETC 47, que são menos abundantes em pgrl1 comparação com o WT no presente experimento.
Figura 1. Fluxo de trabalho experimental, conforme ilustrado para o WT e ΔPSI. Células são metabolicamente marcadas durante pelo menos quatro gerações, condições anaeróbias são induzidas por borbulhamento de árgon durante 4 horas e tilacóides são isoladas através de separação por gradiente. O isolamentoted membranas são solubilizadas utilizando β-MS, carregado num gradiente de densidade de sacarose (para ambas as estirpes de quantidades iguais de clorofila são aplicados nesta etapa) e centrifugada durante a noite. As fracções do gradiente são recolhidas e analisadas por SDS-PAGE, bem como para determinar a distribuição de imunodetecção de proteínas dentro do gradiente. Para identificar proteínas com uma migração dependente de PSI, volumes iguais da fracção CEF-supercomplex WT (fracção número 6) e a correspondente fracção 15 N-marcado a partir da estirpe ΔPSI foram misturados e analisados comparativamente. O mesmo foi feito com a fracção do pico da ANR1 na estirpe ΔPSI (fracção número 13). Para a MS-abordagem quantitativa comparativa, as amostras de proteína misturadas foram separadas por SDS-PAGE, as bandas de proteínas foram coradas com uma solução de azul de Coomassie, seguido por digestão em gel antes da análise de MS-. clique aqui para ampliar image.
Figura 2. ANR1 e CAS migrar para as regiões de baixa densidade na estirpe ΔPSI. A:. Gradientes de densidade de sacarose de WT e ΔPSI tilacóides isolados de condições anaeróbicas foram separados em 20 frações B: Imunodetecção de ANR1 nos 20 frações do gradiente de WT e ΔPSI. Embora esta proteína está localizada a região de maior densidade no WT (fração 6) cabe-deslocou-se para as regiões de baixa densidade na cepa ΔPSI (fração 13) C:. Gradientes de densidade de sacarose de WT e ΔPSI tilacóides isolado do condições anaeróbicas foram separados em 27 frações D:. Imunodetecção do CAS nas 27 frações do gradiente de WT e ΔPSI. Embora esta proteína está localizada to da região de maior densidade no WT (com um pico em torno de fração 7), cabe-deslocou-se para as regiões de baixa densidade na cepa ΔPSI (com um pico em torno de fração 19). (Este valor foi modificado a partir Terashima et al. 6). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Relativa proporções de proteínas encontradas na fracção 6 e 13 a partir de WT e ΔPSI por espectrometria de massa quantitativo. Fracções 6 e 13 a partir de WT foram comparados com as respectivas fracções da estirpe ΔPSI 15 N-marcado. Os índices de proteína relativos que representam duas repetições biológicas e três MS-runs são retratados como WT / ΔPSI (14N / N 15) para ambas as fracções analisadas com a excepção de cit f, que só foi identificado em fracção 6. Esta quantificação comparativa revela que ANR1 e CAS mostram uma migração dependente do PSI no gradiente de densidade de sacarose (este valor tenha sido modificado a partir Terashima et al. 6). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. Rácios de proteína relativa determinada na fracção de CEF-supercomplex de WT e pgrl1 por espectrometria de massa quantitativo. A: gradiente de densidade de sacarose de WT e tilacóides pgrl1 isoladas a partir de condições anaeróbias B:. Rácios relativos de proteína between da fração CEF-supercomplex decorrente de quatro repetições diferentes retratado como WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). Neste experimento ANR1 e CAS não são notavelmente alterados, enquanto FTSH2 e HCF136 apresentam diferenças significativas em relação a todas as subunidades PSI (p ≤ 0,001, conforme indicado por *** em vermelho; HCF136: 1900 <U <58127; FTSH2: 2117 <U <164197). Além disso, o cit b 6 / f subunidades complexas cit f e PETO mostraram-se significativamente diferente da cit b 6, cit b 6 / f IV e PETC, respectivamente (p ≤ 0,001, conforme indicado por *** em azul; cit f : 2684 <U <11535; PETO:. 4,700 <U <23663) Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
Diferentes estudos de proteômica quantitativa, utilizando rotulagem de isótopos estáveis têm sido publicados nos últimos anos. Nestas experiências, normalmente duas amostras diferentes são comparados, de que uma amostra é marcada com um isótopo estável. Posteriormente, as proteínas ou os péptidos de ambas as amostras são combinadas numa proporção igual e ainda mais processados em conjunto 48. Tais estudos, muitas vezes a intenção de comparar os compartimentos definidos isoladas celulares (por exemplo, cloroplastos, mitocôndrias, ou tilacóides) expostas a diferentes condições de estresse 26,34,49 para investigar cima ou para baixo-regulação de proteínas específicas. A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica pretende analisar a composição de complexos multiproteicos na membrana tilacoide e, em contraste com os estudos acima referidos, baseia-se na mistura o mesmo volume de amostras, depois da separação de densidade de sacarose de tilacóides carregado com uma concentração igual de clorofila antes ultracentrifugação. Este método foi aplicado eficazmente pela Terashima et al. 6 que analisados comparativamente a composição da CEF-supercomplex isolado a partir de um WT e uma estirpe ΔPSI para identificar proteínas que migram PSI-dependente em um gradiente de densidade de sacarose.
A realização desta estratégia é comprovado pelo fato de que os MS-resultados são confirmados por imunodetecção. Além disso, Terashima et al. Podia confirmar as descobertas de estudos anteriores (isto é, a identificação e dependente de PSI a migração de proteínas já descritas para ser parte do CEF-supercomplex, tais como PGRL1, FNR, e citocromo f 7). A identificação de ANR1 e CAS como novos componentes da CEF-máquinas 6 revela esta abordagem como uma ferramenta muito poderosa e eficiente. Notavelmente, o isolado CEF-supercomplex exibiu atividade in vitro, demonstrando assim a purificação bem sucedida de uma funçãoretamente proporcional multiprotein complexo 6. A aplicabilidade desta abordagem também para duas linhagens de que ambos formam uma CEF-supercomplex é demonstrado pela comparação entre WT e pgrl1.
Em geral, este método pode ser usado para examinar composições complexas em diferentes estirpes ou condições como revelado pela identificação de proteínas anteriormente não identificados que são copurified com a fracção de CEF-supercomplex (ou seja, o enriquecimento de FTSH1, FTSH2, PFD, e no HCF136 fração CEF-supercomplex). Se estas proteínas são possíveis novos candidatos deste complexo e para melhorar a nossa compreensão para os diferentes regulação da FTHS2, HCF136, bem como para os cit b 6 / f subunidades como revelado pela comparação do WT e pgrl1, novas experiências são necessárias.
Além das vantagens descritas desta abordagem, existem separeal passos críticos que precisam ser cuidadosamente considerado quando se trabalha com este protocolo: A quebra de células com o nebulizador é o primeiro passo importante. Se a abertura das células não é levada a cabo de uma forma adequada, o rendimento de tilacóides isolado irá ser bastante baixo e pode resultar em quase qualquer detecção de CEF-supercomplex após centrifugação durante a noite. A ruptura bem sucedida de células pode ser inferida a partir da luz de cor verde do sobrenadante após centrifugação. Em contraste, se a pressão durante o rompimento celular é demasiado elevada, as partes do supercomplex pode desintegrar-se e co-factores importantes podem ser perdidas. Outro passo influenciar o rendimento de tilacóides é a re-suspensão de células com um potter. Isto tem de ser feito com cuidado e, no final desta etapa apenas poucas partículas verdes deve permanecer. Além disso, para a preparação de gradientes de densidade de sacarose no dia antes, bem como para a solubilização de complexos da membrana, que é muito importanteseguir exatamente este protocolo em termos de concentração de β-DM, uma vez que esta é crucial para obter thylakoids totalmente solubilizados 50 e, portanto, também para a purificação da CEF-supercomplex. O passo de solubilização tem sido realizada com sucesso, se um pequeno sedimento esbranquiçado é observada após a etapa de centrifugação subsequente. Outro ponto importante que deve ser mencionado aqui é o tempo de sobre-noite ultracentrifugação. Os gradientes de densidade de sacarose deve ser centrifugado para pelo menos 12 horas para assegurar a separação completa dos complexos fotossintéticos.
Mesmo que o protocolo é demonstrado usando C. reinhardtii para a análise comparativa da composição CEF-supercomplex em duas linhagens geneticamente diferentes, é facilmente adaptável também para uma ampla gama de outras questões, como as análises comparativas de composição complexa multiprotein isolado do distinto ambiental / experimentalcondições ou por utilização de outros tipos de fraccionamento. Os únicos requisitos desta abordagem é que o modelo de organismo pode ser cultivado em cultura celular, é capaz de utilizar de amónio como fonte de azoto e de complexos proteicos podem ser separados por gradientes de densidade de sacarose, o que demonstra uma ampla aplicação deste método. Para aplicação futura desta abordagem de SDS-PAGE de fraccionamento dos mistos 14 N / N 15 amostras e posterior digestão em gel pode ser substituído pela aplicação da preparação da amostra auxiliado por filtro método (FASP). Este método inclui a aplicação de detergentes fortes para solubilização destinadas para "limpar" o proteoma, antes da digestão e para obter péptidos purificados, evitando as desvantagens da abordagem em gel que pode inibir a digestão de recuperação de péptidos, apesar de que se deve considerar que, em gel digestão é descrito para ser robusto para contaminações que possam interferir com a digestão 51.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.
Acknowledgments
MH reconhece o apoio da "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Autor contribuições: MH investigação destinada; KT, JS e MT realizado pesquisas e analisados os dados; KT e MH escreveu o jornal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
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