Summary
Den beskrevne sammenlignende kvantitativ proteom tilgang sigter på at opnå indsigt i sammensætningen af multiprotein komplekser under forskellige betingelser og demonstreres ved at sammenligne genetisk forskellige stammer. Til kvantitativ analyse lige store volumener af forskellige fraktioner fra en sucrosemassefyldegradient blandes og analyseres ved massespektrometri.
Abstract
Det indførte protokol giver et værktøj til analyse af multiprotein komplekser i thylakoid membran, ved at afsløre indsigt i komplekse sammensætning under forskellige forhold. I denne protokol er påvist ved at sammenligne proteinsammensætning komplekse ansvarlig for cyklisk elektron flow (CEF) i Chlamydomonas reinhardtii, isoleret fra genetisk forskellige stammer tilgang. Proceduren består af isolering af thylakoid membraner, efterfulgt af deres adskillelse i multiprotein komplekser af saccharosedensitetsgradientcentrifugering, SDS-PAGE, immunpåvisning og sammenlignende kvantitativ massespektrometri (MS) baseret på forskellen metabolisk mærkning (14 N / 15 N) analyserede stammer. Vaskemiddel opløste thylakoid membraner er indlæst på saccharosedensitetsgradienter på klorofylkoncentrationen lige. Efter ultracentrifugering, er gradienterne adskilles i fraktioner, som analyseres ved masse-spectrometRy baseret på lige volumen. Denne fremgangsmåde giver undersøgelsen af sammensætningen inden for de gradientfraktioner og desuden til at analysere opførslen af forskellige proteiner migration, især med fokus på ANR1, CAS, og PGRL1. Desuden er denne metode demonstreret ved at bekræfte resultaterne med immunoblotting og derudover ved at støtte resultaterne fra tidligere undersøgelser (identifikation og PSI-afhængige migrering af proteiner, der tidligere blev beskrevet at være en del af CEF-supercomplex såsom PGRL1, FNR, og cyt f). Især denne tilgang er anvendelig til at løse en bred vifte af spørgsmål, som kan vedtages denne protokol og fx bruges til sammenlignende analyser af multiprotein komplekse sammensætning isoleret fra forskellige miljøforhold.
Introduction
Fotosyntetiske processer i thylakoid membraner af planter og alger kan fungere i en lineær og cyklisk tilstand. Under lineær elektron flow (LEF) fotosystem I (PSI), fotosystem II (PSII) og cytochrom b 6 / f sidste ende overføre elektroner fra vand til NADP + 1, der fører til dannelse af NADPH og ATP 2. I modsætning hertil, cyklisk elektronstrøm (CEF), der vides at blive induceret under forskellige miljøforhold som eksempelvis state 2 3 og anaerobe betingelser 4, resulterer i re-reduktion af oxideret PSI ved at injicere elektroner tilbage i elektron transportkæden. Denne proces kan finde sted enten på det stromale side af cytochrom b 6 / f komplekse 1 eller på plastoquinon pool 5 og genererer ATP, men ingen NADPH 2.
Formålet med det præsenterede protokol er at demonstrere en massespektrometri (MS) baseret metode til sammenlignende, kvantitativ analyse af multiprotein komplekser i thylakoid membraner af Chlamydomonas reinhardtii at få indsigt i sammensætningen af disse komplekser under forskellige betingelser (eksemplificeret ved at sammenligne genetisk forskellige stammer). Denne fremgangsmåde blev anvendt i en publikation fra Terashima et al. I 2012 viser en Ca 2 +-afhængig regulering af CEF i C. reinhardtii formidlet af en multiprotein kompleks, herunder de proteiner, CAS, ANR1 og PGRL1 6. Proceduren vil blive forklaret ved forholdsvis analysere sammensætningen af CEF-supercomplex i to genetisk forskellige stammer, således udnytter mærkning af en af de to stammer med tung nitrogen (15 N). Kort fortalt protokollen omfatter udarbejdelse af thylakoid membraner efterfulgt af detergentsolubilisering og fraktionering af fotosyntetiske komplekser i en sucrosemassefyldegradient. Efter fraktionering af gradienten, valgte fractioner af to stammer blandes baseret på lige volumen, adskilt ved SDS-PAGE efterfulgt af i-gel-fordøjelse og efterfølgende kvantitativ MS analyse.
Som nævnt ovenfor er CEF induceret under forskellige miljøforhold og en publikation fra 2010 viser isolering af en funktionel CEF-supercomplex fra stat 2 låste celler af C. reinhardtii 7, som blev udført ved at adskille opløste thylakoid membraner på en sucrosemassefyldegradient under ultracentrifugering. Forskellig fra Iwai et al. 7, den præsenterede protokol beskriver isolering af CEF-supercomplex fra anaerob dyrket C. reinhardtii kulturer ved at følge en alternativ procedure. Dette omfatter ændringer i thylakoid isolation protokollen samt forskelle vedrørende solubiliseringstrin og adskillelse af protein komplekser ved ultracentrifugering. I den nuværende protokol, thylakoid membranerisoleres ved at anvende proceduren publiceret af Chua og Bennoun 8, medens de buffere, der anvendes til thylakoid fremstilling af Iwai et al. indeholdt 25 mM MES, 0,33 M saccharose, 5 mM MgCl2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5) som beskrevet 9. Solubiliseringen blev udført med 0,7-0,8% detergent (n-tridecyl-β-D-maltoside) i 30 minutter på is i tilfælde af Iwai og medarbejdere, mens den her beskrevne solubilisering metode bygger på anvendelsen af 0,9% detergent (n -dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) og udføres for kun 20 min på is. Begge grupper anvendes 0,8 mg klorofyl pr ml solubilisering med det respektive rengøringsmiddel. Til adskillelse af fotosyntetiske komplekser fra opløste thylakoid membraner anvendt Iwai et al. Saccharose koncentrationer på mellem 0,1 til 1,3 M, mens forfatterne af denne protokol, der anvendes koncentrationer fra 0,4 til 1,3 M. Den sidste forskel er centrifugeringshastigheden, hvilket er lavere end til earlier publikation.
Solubilization af thylakoid membraner med nonioniske detergenter efterfulgt af sucrosemassefyldegradient fraktionering er allerede blevet anvendt i adskillige undersøgelser, der spænder fra 1980'erne til i dag 7, 9-14 og også anvendelse af metabolisk mærkning af proteiner er en udbredt metode inden for området proteomics. Den beskrevne fremgangsmåde anvender 15 N metabolisk mærkning af en af de to sammenlignede stammer ved dyrkning den i nærværelse af tungt nitrogen som eneste nitrogenkilde i form af 15 N NH4CI, som er indarbejdet i alle aminosyrer, der fører til en masse skifte afhængig aminosyresekvensen af peptidet. Ved analyse af en blanding af 14 N og 15 N inden for en MS løber, kan denne masse skift anvendes til at bestemme prøvens oprindelse for hvert peptid og relativ peptid mængderne kan beregnes repræsenterer relative mængder til de tilsvarendening protein 15.
Talrige kvantitative proteomics undersøgelser af C. reinhardtii er til rådighed, der sammenligner en defineret mængde protein til at analysere ændringer i proteom mellem eksperimentelle betingelser (eksempelvis ændringer i proteomet grund næringsstof 16-19 eller lys stress 20,21). I forhold til disse studier i den aktuelt præsenterede tilgang lige volumener af prøver kombineres og analyseres. Denne opsætning tillader at studere opførslen af proteiner migration inden for gradient og desuden til at analysere sammensætningen af forskellige komplekser med hensyn til de undersøgte stammer.
Denne metode vil blive forklaret ved primært koncentreret om tre proteiner: Den første kandidat er kloroplast lokaliseret calcium sensor protein CAS, som viste sig at være involveret i foto-akklimatisering i C. reinhardtii 22.. Calcium anses for at være et vigtigt signalning ion for veje, som aktiveres på grund af forskellige biotisk og abiotisk stress endelig fører til ændringer i genekspression og celle fysiologi 23, og det blev foreslået, at kloroplaster kan bidrage til cellulær Ca2 + signalering via CAS protein 22,24,25. Det andet protein er ANR1 (anaerob reaktion 1 6), et protein, der blev vist at blive induceret under anoxiske vækstbetingelser i C. reinhardtii 26.. Især blev CAS samt ANR1 identificeret som underenheder af CEF-supercomplex og i øvrigt, ved hjælp af reverse genetiske metoder, blev det påvist, at begge proteiner bidrager funktionelt til CEF in vivo 6, støtte deres rolle som funktionelle underenheder af dette protein kompleks. Den tredje protein er den thylakoid protein PGR5-Like 1 (PGRL1), som viste sig at være involveret i CEF i Chlamydomonas 4,27 samt i Arabidopsis 5,28 og var også identified i arbejdet i Iwai et al. 7.
Denne tilgang vil blive præsenteret ved at vise resultaterne af to forskellige eksperimenter: vildtype (WT) versus (vs.) en ΔPSI 29 stamme, der udviser en sletning af psab gen, der koder for en væsentlig fotosystem I Subunit, som også er en del af den CEF-supercomplex og WT kontra en pgrl1 knock-out stamme 4. For hvert af disse eksperimenter den kvantitative sammensætning af CEF-supercomplex mellem en 15 N-og en 14 N-mærket stamme er blevet sammenlignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Dyrkning af Chlamydomonas
- Følgende C. reinhardtii stammer blev anvendt i nærværende undersøgelse: WT cc124, WT cw15-arg7 (celle-væg mangelfuld og arginin auxotrofen), en ΔPSI mutant stamme 29 og en pgrl1 knock-out stamme 4.
- Alle stammer blev dyrket i Tris-acetat-fosfat (TAP)-medium 30 ved 25 ° C med en konstant lysintensitet på 20-50 uE / m 2 sek og rystning ved 120 rpm. Den kultur af ΔPSI bør pakkes med nogle silkepapir for lys eksponering af <5 uE / m 2 sek.
- Kulturerne i de mærkede stammer (ΔPSI og WT cc124, henholdsvis) indeholdt 7,5 mM 15 N NH4 Cl, mens kulturer til de ikke-mærket stammer (WT cw15-arg7 og pgrl1 henholdsvis) indeholdt 7,5 mM 14 N NH4 Cl. Celler er nødt til at vokse for mindst fire generationer for at opnå fuld mærkning og skal holdes på eksponentielle vækstfase.
- På dagen før start eksperimentet tælle og fortyndes cellerne til en tæthed på 1 x 10 6 celler / ml i et volumen på mindst 750 ml / stamme.
Bemærk, at to typer af korte saccharosedensitetsgradienter er beskrevet i den følgende protokol. De fotosystem sucrose densitetsgradienter efter Takahashi et al. 9 bruges til at adskille de forskellige fotosyntetiske protein komplekser fra isolerede og opløste thylakoids løbet natten over centrifugering og er nødt til at være forberedt dagen før (se protokol nr. 2), og de thylakoid saccharosedensitetsgradienter 8 anvendes i thylakoid isolation procedure (se protokol 3).
2. Udarbejdelse af fotosystem saccharosedensitetsgradienter
- For at hælde gradienterne er brug for tre stamopløsninger:
- 2 M Saccharose
- 10% β-DM i H 2 O
- 0,5 M tricin, pH 8,0 (NaOH)
- Ved hjælp af disse bestande, forberede følgende løsninger:
Koncentration: 1,3 M 1,0 M 0,85 M 0,7 M 0,65 M 0,4 M 2 M Saccharose 13 ml 10 ml 8,5 ml 7 ml 6,5 ml 4 ml 10%46,-DM 100 pi 100 pi 100 pi 100 pi 100 pi 100 pi 0,5 M tricin 200 pi 200 pi 200 pi 200 pi 200 pi 200 pi H2O 6,7 ml 9,7 ml 11,2 ml 12,7 ml 13.2 ml 15,7 ml - Brug 14 mm x 89 mm centrifugerør og hæld gradienterne meget langsomt, begyndende med den højeste sucrose løsning lavere densitet løsning.
- Hæld kun 1 ml for hver af de 1,3 og 1,0 M opløsninger og 2 ml for resten af løsningerne.
- Lad stigninger natten over i kølerum.
3. Anaerob Induktion og Isolering af thylakoid Membranes 8
- Før du starter med isolering af thylakoid membraner, fremkalde anaerobe forhold ved at boble med argon i 4 timer. Gennemboblingen kan udføres gennem et glas pipetten dyrkning kolber med konstant blanding af kulturen med en magnetisk omrørerstav.
- Start med isolering af thylakoid membraner ved pelletering af cellerne i 5 minutter ved 2.500 x g, resuspender i H1-buffer (0,3 M saccharose, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2).
(Bemærk, at når du starter med isolering af thylakoid membraner prøver shOuld holdes på is for at undgå protein nedbrydning, er alle centrifugeringstrin udføres ved 4 ° C og arbejde med handsker anbefales kraftigt for at undgå keratin forurening.) - Pellet celler i 5 minutter ved 2500 xg, resuspender i H1-puffer.
- Break celler med to passager gennem en forstøver med et nitrogenindhold tryk på 1.500 hPa (for stammer uden cellevæg gøre én passage).
- Spin ned celler til 7 min ved 2.500 x g..
(Efter dette trin supernatanten skal være lys grøn, hvis ikke, cellebrud lykkedes ikke.) - Resuspender cellerne i H2-buffer (0,3 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)), og pellet cellerne i 10 minutter ved 32.800 x g.
- Resuspender cellerne i H3 buffer (1,8 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) og homogeniseres pellet med en pottemager (ingen grønne partikler bør forblive i slutningen af denne arbejdsgang).
- Forbered thylakoid saccharose densitetsgradienter i karbades (25 mm x 89 mm) ved at starte i bunden med et lag af 12 ml H3 buffer med celler, hæld et midterlag af 12 ml H4-buffer (1,3 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA ( pH 8,0)) og på toppen 12 ml H5-buffer (0,5 M sucrose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Vær forsigtig, når hælde gradienter og undgå at blande de tre lag.
- Balance med H5 buffer og centrifuger thylakoid saccharosedensitetsgradienter i 1 time ved 70.700 x g.
- Fjern thylakoid bånd fra thylakoid saccharosedensitetsgradienter og fortynde dem med et passende volumen H6-buffer (5 mM HEPES (pH 7,5) 10 mM EDTA (pH 8,0)).
- Spin ned cellerne ved 37.900 xg i 20 min. Hvis pelleten ikke er tæt, er mere H6 buffer, der kræves til dette centrifugeringstrin.
- Resuspender thylakoids i en lille mængde H6 buffer og fortsætte med bestemmelse af klorofyl koncentration.
4.. Bestemmelse af klorofylkoncentrationen 31
- Fastsættelsen af klorofyl beløb udføres med 80% acetone.
- Bland 995 gl 80% acetone og 5 pi thylakoids i H6-puffer (fortynding 1:200).
- Vortex i flere sekunder, indtil ingen grønne partikler forblive og derefter spin ned på 14,1 xg i 5 min.
- Tag supernatanten og måle ekstinktion ved 663,6 og 646,6 nm og 750 nm, hhv.
- Beregn klorofyl beløb ved hjælp af følgende formler:
- C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * fortyndingsfaktor
- C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * fortyndingsfaktor
- C Chl [mg / ml] = C Chl a + C Chl b
5.. Belastning af fotosystem saccharosedensitetsgradienter
- Beregn mængden af thylakoids, β-DM og H6 buffer, der er nødvendigefor hver gradient:
- Hver gradient skal være belastet med en samlet volumen på 700 ul med 0,8 mg / ml klorofyl i 0,9% β-DM (opløse β-DM i H 2 O), fylde den resterende mængde med H6 buffer.
- For solubilization forberede forskellige portioner med thylakoids, β-DM og H6 buffer for hver gradient.
- Lad prøver til 20 minutter på is med jævne blanding (invertere) hvert par minutter (solubiliseringstrin).
- Centrifugeres ved maksimal hastighed (14.000 xg) i 10 min ved 4 ° C.
(Efter centrifugering bør pelleten være lille og hvidlig mens supernatanten mørkegrøn). - Load supernatant på stigninger.
- Balance med H6 buffer og spin bruge ultracentrifuge ved 134.470 xg natten over (14 timer) ved 4 ° C.
(Bemærk, at en vellykket adskillelse af fotosyntetiske komplekser ved hjælp af fotosystem saccharose densitetsgradienter som præsenteres i denne protokol kun opnås, når using frisk isolerede thylakoids, da en forudsigelse for solubilisering og komplekse adskillelse er svært at gøre, når du arbejder med thylakoid membraner, der har været frosset inden.)
6.. Fraktionering af fotosystem saccharosedensitetsgradienter
- Tag billeder af gradienter.
- Punktere et hul i bunden af røret ved hjælp af en nål og fraktionere gradienter i 500 rør pi. Alternativt kan fraktioneringen også udføres ved anvendelse af en 96-brønds plade (mikrotiterplade).
- Når du bruger en mikroplade, bestemme absorbansen af de forskellige gradientfraktioner ved 675 nm.
(På dette trin prøver kan opbevares ved -80 ° C i nogle få uger.)
7.. SDS-PAGE og Immunodetektion
(Bemærk, at kun til sammenligning af WT vs ΔPSI en western blot analyse er blevet udført for at vælge fraktionerne til efterfølgende MS-analyse. Til eksperimentet WT vs pgrl1 fraktioner blev valgt ved hjælp af absorbansen i de forskellige fraktioner.)
- Separate 30 ul af hver fraktion fra WT og ΔPSI gradient på en 13% SDS-polyacrylamidgel 32.
- Udføre western blot analyse 33 ved hjælp af følgende antistoffer: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6 PSI subunit PSAD 32 og PSII kerne subunit D1. Brug alle antistoffer med en fortynding på 1:1000 (for øget kemiluminescensdetektion teknik), undtagen for D1-antistof, der skal anvendes med en fortynding på 1:10.000.
- Baseret på resultaterne af immunpåvisningen, tage peak fraktioner af ANR1, PGRL1 og PSAD for WT og ΔPSI (her fraktionerne 6 og 13, henholdsvis), bland 30 pi fraktion 6 fra WT og ΔPSI og gøre det samme med fraktion 13 fra både præparater og adskille dem igen på en 13% SDS polyacrylamidgel.
- Til kvantitativ sammenligning af WT vs pgrl1 tage CEF-supercomplex fraktioner som bestemt ved måling af absorbansen i de forskellige gradientfraktioner og bland 30 pi af begge prøver efterfulgt af separation på en 13% SDS-polyacrylamidgel.
- Farv proteinbåndene med Coomassie-opløsning (85% phosphorsyrling, 757 mM ammoniumsulfat, 1,2% Coomassie brilliant blue, 20% methanol) i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- For at fjerne uspecifik farvning, vaskes flere gange med Hedeselskabet 2 O.
- Skær banerne i 1 mm gelstykker og fortsætte med i-gel-fordøjelse.
(Alternativt kan prøverne tørres et par minutter i et vakuum centrifuge og opbevares i et par uger, før du fortsætter med den i-gel fordøjelse.)
8.. I gel Fordøjelse (ændret fra Shevchenko et al. 35)
Bemærk at forberede alle buffere og opløsninger kort før brug og tage glasflasker til buffere, der indeholder acetonitril (ACN). <br /> ADVARSEL! Arbejde med ACN kunne være skadelig, mere information kan downloades fra: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).
- Vask gelstykker med> 10 volumener ddH2O (~ 200 ul) i 30 sek.
- Inkuber gelstykkerne med 300 pi 25 mM NH4 HCO 3 i 15 minutter med omrystning fjerne væske.
- Inkuber gelstykkerne med 300 pi 25 mM NH4 HCO3 i 50% ACN (fremstilles ved at blande ACN og 50 mM NH4 HCO 3 i et forhold på 1:1) i 15 minutter under omrystning fjerne væske.
- Hvis gelstykkerne er stadig blå, gentages NH4 HCO3 og NH 4 HCO 3 / ACN vasker indtil det meste af Coomassie fjernes.
(Selvom hovedparten af Coomassie-farvning skal fjernes, er det ikke nødvendigt at affarves gelstykkerne helt.) - Tilsæt 100 ul ACN at dehydrere gelstykkerne for 5 min. Gelstykkerne skal krympe ennd ser helt hvidt.
- Fjern så meget ACN som muligt og fortsætte med trypsin fordøjelse. Alternativt kan prøverne opbevares ved -20 ° C i et par uger.
- Tilføj 10-20 pi per bånd på 20 ng / mikroliter trypsin i 10% ACN / 25 mM NH4 HCO 3 (frisk fortyndet) opbevare prøver på is.
- Efter 30 min, kontrollere, om alle løsning blev absorberet og tilføje mere trypsin buffer, hvis det er nødvendigt. Gelstykker bør være helt dækket med trypsin buffer. Hold prøver på is.
- Lad gelstykker i yderligere 90 minutter på is for at mætte dem med trypsin.
(Kritisk trin: udbyttet af tryptiske peptider forøges betydeligt med stigende inkubationstider på is, sandsynligvis på grund af langsom diffusion af enzymet i polyacrylamidmatrix Det er nødvendigt at have et lille overskud af opløsning omfatter gelstykkerne at undgå, at stykkerne. falde tør under inkubation natten over.) - Skær ved 37 ° C i 4-6 timer. Til forsøg, der krævermaksimal peptid opsving, fordøje natten over.
- Efter fordøjelse spin ned kondenseret buffer.
- Soniker rør til 5 minutter at eluere peptider og centrifugeres igen.
- Saml supernatanten og overføre det til et nyt rør.
- Udfør peptid ekstraktion med 80 pi af 30% ACN / 1% myresyre (FA) i en sonisk bad i 15 min.
- Udføre ekstraktion med 80 pi af 30% ACN / 1% FA i en sonisk bad i 15 min.
- Udføre ekstraktion med 80 pi af 70% ACN / 1% FA i en sonisk bad i 15 min.
- Centrifuge igen og pool supernatanten med forudgående eluat.
(FA tjener til at inaktivere trypsin og øge peptid opløselighed.) - Tør peptidopløsning helt i en vakuumcentrifuge.
(På dette tidspunkt kan opbevares prøver til et par uger i -20 ° C, før du fortsætter med MS-analyse.) - Resuspender peptider i 6 pi MS-puffer (5% ACN, 0,1 v / v FA, vand) og sonikeres for 2-5 min.
- Centrifugér prøver på størst muligm hastighed i 5 minutter for at fjerne partikelformigt materiale.
- Brug 4 pi supernatant til massespektrometrisk analyse.
9.. MS-Dataanalyse med "Proteomatic"
Dataanalysen blev udført med open source software "Proteomatic" (som kan downloades på http://www.proteomatic.org/), en platform, der gør det muligt for generering og færdiggørelse af MS / MS evalueringsdata rørledninger, ved hjælp af gratis og kommercielle software 36.. Kort fortalt, er de indstillinger, der er beskrevet nedenfor og mere detaljerede oplysninger kan findes i 6,26.
- Identifikation og kvantificering af MS-data
Identifikation og kvantificering af proteiner fra eksperimenter WT vs ΔPSI blev udført med OMSSA (version 2.1.4 37) og qTrace 26 henholdsvis som beskrevet 6,26. For MS-analyse af data fra forsøget WT vs pgrl1 følgende opdaterede rørledning blev brugt:- Ud over OMSSA 37 blev proteiner også identificeret med X! Tandem (version 2013/02/01 38). Begge algoritmer blev anvendt ved at søge mod en database frembragt ved at kombinere JGI Chlamydomonas gen model database-version 4.3 med Augustus database version 10.2 samt mod en forenet database NCBI databaser BK000554.2 og NC_001638.1.
- MS 2 Identifikation af peptider blev udført ved hjælp af en mål-attrap tilgang 39. En lokkedue for hvert protein blev skabt af tilfældigt blander tryptiske peptider samtidig bevare redundans nonproteotypic peptider.
- Statistiske validering af peptiderne blev udført med softwaren qvality (version 0.3.3 40) ved hjælp af en bageste fejlsandsynlighed (PEP) grænse på mindre end 0,01, og resultaterne blev filtreret med et forstadium masse tolerance på 5 ppm.
- Peptider fra OMSSA og X! Tandem kørsler blev forenet og kvantificeret med qTrace
For at undersøge om protein-forhold var signifikant forskellige mod hinanden i de blandede CEF-supercomplex fraktioner fra WT og pgrl1 blev statistisk analyse udført anvende softwaren SPSS (version 21). De underenheder af cytochrom b 6 / f komplekset blev testet mod hinanden samt proteinerne FNR FTSH2 og HCF136 mod PSI underenheder. Peptid-forhold for hver scanning tælle pr protein af alle fire replikater blev testet for normalfordeling med Shapiro-Wilks-testen. Da peptid populationer ikke var normalfordelt (p <0,001), blev ikke-parametriske statistiske udført. Først blev Kruskal-Wallis test anvendte vurdering af en væsentlig afvigelse mellem grupper. Kun hvis denne test forudsagt signifikant forskels mellem grupper blev yderligere analyse udføres for at forudsige signifikante forskelle mellem to uafhængige grupper med Mann-Whitney-U-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det indførte kvantitative proteomics tilgang har til formål at karakterisere sammensætningen af multiprotein komplekser i thylakoid membraner demonstreret af den sammenlignende analyse af CEF-supercomplex komponenter i genetisk forskellige C. reinhardtii stammer. Den beskrevne metode er med held blevet anvendt af Terashima et al. 6 og omfatter isolering af thylakoid membraner fra anaerobe dyrket kulturer, efterfulgt af detergentsolubilisering. Efterfølgende prøver fyldt på en sucrosemassefyldegradient baseret på lige klorofyl beløb og komplekser fraktioneres ved ultracentrifugering. Til kvantitativ MS-analyse lige store volumener af to gradientfraktioner fra forskellige stammer blandes og forholdsvis analyseret (figur 1). De præsenterede resultater omfatter sammenligning af CEF-supercomplex fraktion mellem WT cw15-arg7 og ΔPSI samt WT cc124 og pgrl1 hhv.
(figur 2A og 2B) blev valgt 6. Figur 3 viser de relative protein-forhold som WT / ΔPSI (14 N / 15 N) for flere PSI kerne og LHCI proteiner (lys høst proteiner PSI også benævnt Lhca proteiner) samt for proteiner, der er tildelt med CEF-supercomplex. Som forventet er PSI core proteiner kun findes i WT prøver påvist ved infinity nøgletal i begge fraktioner. Lhca2 og Lhca9 er beriget i WT, mens Lhca4 -6 og -8 vise en anden regulering i begge fraktioner. Det er vigtigt at bemærke, at LHCI proteiner syntetiseret og akkumuleres normalt i ΔPSI mutant 41.. Polypeptidet sammenligning af PSI-LHCIkomplekset fra C. reinhardtii WT med LHCI kompleks af ΔPSI mutant afslørede, at størstedelen af Lhca2, -3 og -9 synes at være kun svagt bundet til LHCI og desuden, at tilstedeværelsen af PSI kerne er nødvendig for en stabil binding. I modsætning hertil Lhca1, -4, -6, -7 og -8 danne et kompleks uafhængig af samlingen af PSI 14, hvilket kan forklare den forskellige regulering af Lhca4, -6 og -8 i nærværende eksperiment.
For proteiner, der skal tildeles med CEF-supercomplex, kan det skelnes mellem dem, der er mere rigelige i WT fraktion 6 og fraktion 13 ΔPSI mutant, der viser en stærk PSI-afhængige migrering vises ved forhold højere end en for fraktion 6 og nøgletal lavere end den ene eller ikke påvist i fraktion 13 (Lhcbm5, PGRL1, ANR1, CAS, PFD, HCF136 og cyt f), og dem, der viser ikke sådan en stærk, men ikke desto mindre en PSI-afhængig lokalisering (FNR, FTSH1, FTSH2 og ATPC ).
Med dette eksperiment Terashima et al. 6 viste en PSI-afhængige migrering adfærd for ANR1 og CAS (figur 2A-D og figur 3), hvilket afslører dem som hidtil ukendte proteiner CEF-supercomplex tidligere ikke identificeret 7. Resultaterne af MS-analyse blev også bekræftet af immundetektion og støttet af anvendelsen af reverse genetik til at bekræfte en funktionel rolle af disse proteiner for CEF in vivo 6. Desuden er denne komparative MS-tilgang støtter kraftigt resultaterne fra tidligere undersøgelser, ved at bekræfte proteiner, der allerede er blevet vist sig at være en del af CEF-supercomplex såsom PGRL1, cyt f og FNR 7, samt Lhcbm5 7,9 for at vise en PSI-afhængig lokalisering i sucrosemassefyldegradient, der kan sammenlignes med ANR1 og CAS.
Sammenligningen af fraktion 6 og 13 anr1 og ΔPSI ved hjælp af den samme approach (se figur S8 6) viste en lignende sammensætning af CEF-supercomplex i anr1 og den samme tendens for proteinerne ANR1, CAS og PGRL1 som åbenbaret i eksperimentet WT vs ΔPSI. Især skønt protein-forhold på ANR1 i fraktion 6 (anr1 vs ΔPSI) er sammenlignelig med forholdet mellem WT vs ΔPSI eksperiment, synes mængderne af CAS og PGRL1 at være højere i det tidligere eksperiment og kan være et resultat af kompensere for nedregulering af ANR1 6.
Desuden berigelse af ANR1 og CAS i fraktionen CEF-supercomplex man kunne også udlede PSI-afhængige migrering af flere andre proteiner fra dette eksperiment. Det er to ATP-afhængige metalloproteaser FTSH1 og FTSH2 der spiller en fundamental rolle i nedbrydningen af den PSII reaktion center protein D1 i grønkorn 42,43, et prefoldin-domæne, som indeholder protein, det HCF136, hvilket er en afgørende faktor for stabiliteten eller assembly af PSII 44 og γ underenheden af ATPase. Mens der for den senere ene, behøver forholdene mellem fraktion 6 og 13 viser ikke en sådan klar forskel, yderligere forsøg skal gennemføres for at kontrollere, om de andre proteiner kan også være kandidater af CEF-supercomplex.
Som en proof of concept eksperiment for denne komparativ tilgang, analyserede vi CEF-supercomplex sammensætning i to stammer, der begge har PSI, så dannelsen af dette kompleks. De respektive fraktioner blev udvalgt baseret på absorbansmålinger af de fraktionerede gradienter. Figurerne 4A og 4B viser resultaterne for kvantitativ sammenligning mellem WT og pgrl1 knock-out stamme. Det skal påpeges, at ANR1 og CAS ikke er bemærkelsesværdigt ændret mellem WT og pgrl1. Interessant HCF136 synes at være beriget med WT, mens FTSH2 synes at være beriget med pgrl1. En statistisk significant forskel for både førnævnte proteiner til alle PSI-underenheder (herunder LHCI proteiner) kunne bekræftes.
Desuden cytochrom B 6 / f komplekse underenheder Cyt f og PETO viste sig at være væsentligt anderledes cyt B 6, cyt B 6 / f IV og PETC hhv. Især cyt f synes at være opreguleret i pgrl1, mens cyt B 6 og cyt B 6 / f IV er lidt nedreguleret, selvom reguleringen af cyt f syntese sandsynligvis indebærer cyt B 6 og cyt B 6 / f IV 45 . Det nukleare-kodet PETC, som også er kendt som Rieske protein viser en tilsvarende regulering som cyt B 6 og cyt B 6 / f IV (dvs. en nedregulering i pgrl1). Det er slående, som en reduktion eller fravær af Rieske protein stadig føre til ophobning af othis cyt B 6 / f underenheder til ~ 60% af WT niveau C. reinhardtii 46.. Derudover er det vigtigt at bemærke opregulering af PETO i pgrl1, da dette løst bundet subunit viste sig at akkumulere til reducerede niveauer i C. reinhardtii mutanter, der mangler enten cyt b 6 cyt b 6 / f IV eller PETC 47, som er mindre rigelige i pgrl1 forhold til WT i det foreliggende forsøg.
Fig. 1. Eksperimentel arbejdsgang som afbildet for WT og ΔPSI. Celler metabolisk mærket i mindst fire generationer, er anaerobe betingelser induceres ved argonbobling i 4 timer og thylakoid membraner isoleres gennem gradient adskillelse. Isolated membraner opløseliggøres ved anvendelse af β-DM, fyldt på en sucrosemassefyldegradient (for begge stammer anvendes lige store mængder af klorofyl i dette trin) og centrifugeret natten over. Gradient fraktioner opsamles og analyseres ved SDS-PAGE samt immunodetektion til at bestemme fordelingen af proteiner i gradienten. For at identificere proteiner med en PSI-afhængig migration, lige volumener af WT CEF-supercomplex fraktion (fraktion nr. 6) og den tilsvarende 15 N-mærket fraktion fra ΔPSI stamme blev blandet og forholdsvis analyseret. Det samme blev gjort med den maksimale fraktion af ANR1 i ΔPSI stamme (fraktion nr. 13). For sammenlignende kvantitativ MS-tilgang, blev de blandede protein prøver separeret ved SDS-PAGE, protein bands blev farvet med Coomassie blå opløsning, efterfulgt af i-gel fordøjelse forud for MS-analyse. Klik her for at se større image.
Figur 2.. ANR1 og CAS migrere til lavere densitet regioner i ΔPSI stamme. A:. Saccharoseestere densitetsgradienter af WT og ΔPSI thylakoids isoleret fra anaerobe forhold blev adskilt i 20 fraktioner B: Immunodetektion af ANR1 i de 20 fraktioner af gradient fra WT og ΔPSI. Mens dette protein er lokaliseret til højere tæthed region i WT (fraktion 6) er det op-skiftet til de lavere densitet i ΔPSI stammen (fraktion 13) C:. Saccharoseestere densitetsgradienter af WT og ΔPSI thylakoids isoleret fra anaerobe forhold blev adskilt i 27 fraktioner D:. Immunodetektion af CAS i de 27 fraktioner af gradient fra WT og ΔPSI. Selvom dette protein er lokaliseret to den højere tæthed region i WT (topper omkring fraktion 7) er det op-skiftet til de lavere densitet i ΔPSI stammen (topper omkring fraktion 19). (Dette tal er blevet ændret fra Terashima et al. 6). Klik her for at se større billede.
Figur 3. Relativ protein-forhold bestemt i fraktion 6 og 13 fra WT og ΔPSI ved kvantitativ massespektrometri. Fraktioner 6 og 13 fra WT er blevet sammenlignet med de respektive fraktioner fra de 15 N-mærket ΔPSI stamme. De relative protein-forhold, der repræsenterer to biologiske gentagelser og tre MS-kørsler er afbildet som WT / ΔPSI (14N / 15 N) for både analyserede fraktioner med undtagelse af cyt f, som først blev identificeret i fraktion 6. Denne komparative kvantificering afslører, at ANR1 og CAS viser en PSI-afhængig migration i sucrosemassefyldegradient (dette tal er blevet ændret fra Terashima et al. 6). Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Relative protein-forhold fastlægges i CEF-supercomplex fraktion af WT og pgrl1 ved kvantitativ massespektrometri. A: Saccharose densitetsgradienter af WT og pgrl1 thylakoids isoleret fra anaerobe forhold B:. Relative protein-forhold between CEF-supercomplex fraktion stammer fra fire forskellige replikater afbildet som WT / pgrl 1 (14 N / 15 N). I dette eksperiment ANR1 og CAS ikke er bemærkelsesværdigt ændret sig, mens FTSH2 og HCF136 udviser signifikante forskelle i forhold til alle PSI-underenheder (p ≤ 0,001 som angivet med *** i rød, HCF136: 1900 <U <58127; FTSH2: 2117 <U <164.197). Derudover cyt B 6 / f komplekse underenheder Cyt f og PETO viste sig at være væsentligt forskellig fra cyt B 6, cyt B 6 / f IV og PETC (p ≤ 0,001 som angivet med *** i blåt; cyt f : 2684 <U <11535; PETO:. 4700 <U <23663) Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige kvantitative proteom undersøgelser ved hjælp af stabile isotoper mærkning er blevet offentliggjort i de seneste år. I disse forsøg normalt to forskellige prøver sammenlignes, hvoraf en prøve er mærket med en stabil isotop. Derefter proteiner eller peptider fra de to prøver er kombineret i et ligeværdigt forhold og viderebehandles sammen 48. Sådanne undersøgelser ofte til hensigt at sammenligne definerede isolerede cellulære rum (f.eks kloroplaster, mitokondrier eller thylakoid membraner) udsættes for forskellige stress betingelser 26,34,49 at undersøge op-eller nedregulering af specifikke proteiner. Den beskrevne sammenlignende kvantitativ proteom tilgang til formål at analysere sammensætningen af multiprotein komplekser i thylakoid membran og i modsætning til de førnævnte undersøgelser, er baseret på at blande den samme mængde af prøver efter sucrose adskillelse af thylakoid membraner læsset på klorofylkoncentrationen lige før ultracentrifugation. Denne metode blev effektivt anvendt af Terashima et al. 6, der forholdsvis analyserede sammensætningen af CEF-supercomplex isoleret fra en WT og ΔPSI stamme til identifikation af proteiner, der migrerer PSI-afhængigt i en sucrosemassefyldegradient.
Opnåelsen af denne strategi er bevist ved, at MS-resultater understøttes yderligere ved immundetektion. Derudover Terashima et al. Kunne bekræfte resultaterne fra tidligere undersøgelser (dvs. identifikation og PSI-afhængige migrering af proteiner allerede er beskrevet at være en del af CEF-supercomplex, såsom PGRL1, FNR og cyt f. 7). Identifikationen af ANR1 og CAS som nye komponenter i CEF-maskiner 6 afslører denne tilgang som en meget kraftfuld og effektiv værktøj. Især den isolerede CEF-supercomplex udstillet in vitro-aktivitet, hvilket viser den vellykkede rensning af en funktionelforlængelse heraf multiprotein komplekse 6. Anvendeligheden af denne fremgangsmåde også for to stammer, der både danner en CEF-supercomplex demonstreres ved sammenligningen mellem WT og pgrl1.
I almindelighed kan denne metode bruges til at overskue komplekse kompositioner i forskellige stammer eller betingelser, som afsløret ved identifikationen af tidligere uidentificerede proteiner, som er renset sammen med CEF-supercomplex fraktion (dvs. berigelsen af FTSH1, FTSH2, PFD, og HCF136 i CEF-supercomplex fraktion). Hvorvidt disse proteiner er mulige nye kandidater af denne komplekse og til at forbedre vores forståelse for de forskellige regulering af FTHS2, HCF136, såvel som for de cyt B 6. / f underenheder som det fremgår af en sammenligning af WT og pgrl1, er det nødvendigt med yderligere eksperimenter.
Ud over de beskrevne fordele ved denne fremgangsmåde, er der skilleal kritiske trin, der skal overvejes nøje, når du arbejder med denne protokol: Den brud af celler med forstøver er det første vigtige skridt. Hvis åbningen af cellerne ikke gennemføres på en ordentlig måde, vil udbyttet af isolerede thylakoids være temmelig lav og kan resultere i næsten ingen påvisning af CEF-supercomplex efter over-night centrifugering. Den vellykkede afbrydelse af celler kan udledes lysegrøn farve supernatanten efter centrifugering. I modsætning hertil, hvis trykket under cellesprængning er for høj, dele af supercomplex kan smuldre og vigtige cofaktorer kan gå tabt. Et andet skridt påvirke udbyttet af thylakoids er resuspension af celler med en pottemager. Dette skal foretages omhyggeligt og i slutningen af dette trin kun få grønne partikler bør forblive. Endvidere, til fremstilling af sucrose gradienter dagen før samt for opløseliggørelse af membran-komplekser, er det meget vigtigt atpræcist at følge denne protokol i form af koncentrationen af β-DM, da det er afgørende for at opnå fuldt opløste thylakoids 50 og dermed også til oprensning af CEF-supercomplex. Solubiliseringstrin er blevet korrekt udført, hvis der observeres en lille hvidlig pille efter den efterfølgende centrifugering. Et andet kritisk punkt, der bør nævnes her er den tid af natten over ultracentrifugering. Saccharose densitetsgradienter skal centrifugeres i mindst tolv timer for at opnå fuld adskillelse af fotosyntetiske komplekser.
Selv om protokollen er påvist ved anvendelse af C. reinhardtii til sammenlignende analyse af CEF-supercomplex sammensætning i to genetisk forskellige stammer, er det let at tilpasse også til en bred vifte af andre spørgsmål, såsom sammenlignende analyser af multiprotein komplekse sammensætning isoleret fra særskilte miljø / eksperimentelbetingelser eller ved anvendelse af andre typer af fraktionering. De eneste krav i denne tilgang er, at den model organisme kan dyrkes i cellekultur, er i stand til at bruge ammonium som kvælstof kilde og protein komplekser kan adskilles ved saccharosedensitetsgradienter, viser en bred anvendelse af denne metode. Til fremtidig anvendelse af denne fremgangsmåde SDS-PAGE fraktionering af de blandede 14 N / 15 N prøver og efterfølgende i-gel fordøjelse kan erstattes ved at anvende filter-aided prøveforberedelse (FASP) metode. Denne metode omfatter anvendelse af stærke rengøringsmidler til solubilisering formål at "rydde op" i proteom før fordøjelsen og for at opnå oprensede peptider, som forhindrer ulemperne ved den i-gel fordøjelse tilgang, der kan hæmme peptid opsving, selv om man bør overveje at i-gel fordøjelse er beskrevet at være robuste over for forureninger, der kan forstyrre fordøjelsen 51..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
MH anerkender støtte fra "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Forfatter bidrag: MH designet forskning KT, JS og MT udføres forskning og analyserede data KT og MH skrev papiret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem | A0662 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetone | AppliChem | A2300 | http://www.applichem.com/home/ |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal | 9340 | Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/ |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories | 39466-62-1 | http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem | A0988 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium hydrogen phosphate | AppliChem | A3583 | http://www.applichem.com/home/ |
| Ammonium sulfate | AppliChem | A3598 | http://www.applichem.com/home/ |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific | 10041653 | http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem | A0819 | http://www.applichem.com/home/ |
| EDTA | AppliChem | A2937 | http://www.applichem.com/home/ |
| Formic acid | AppliChem | A3858 | http://www.applichem.com/home/ |
| HEPES | AppliChem | A3724 | http://www.applichem.com/home/ |
| Magnesium chloride | AppliChem | A4425 | http://www.applichem.com/home/ |
| Methanol | AppliChem | A2954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Phosphorous acid | AppliChem | A0989 | http://www.applichem.com/home/ |
| Dipotassium hydrogen phosphate | AppliChem | A1042 | http://www.applichem.com/home/ |
| Potassium dihydrogen phosphate | AppliChem | A1043 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sodium hydroxide | AppliChem | A1551 | http://www.applichem.com/home/ |
| Sucrose | AppliChem | A1125 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tricine | AppliChem | A3954 | http://www.applichem.com/home/ |
| Tris | AppliChem | A2264 | http://www.applichem.com/home/ |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega | V5111 | http://www.promega.de/ |
| Equipment | |||
| Nebulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col | http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 | |
| Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | for preparation of Takahashi style gradients
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm |
Beckman Coulter | 344058 | for preparation of thylakoid isolation gradients.
http://www.beckmancoulter.de/ |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter | http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal | 449/72 | https://www.diagonal.de/ |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand | 10618242 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand | 105252220 | http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter | website: http://www.beckmancoulter.de/ | |
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera | http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
- Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
- Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
- Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
- Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
- Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
- Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
- Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
- Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
- Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
- Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
- Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
- Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
- Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
- Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
- Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
- Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
- Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
- Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
- Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
- Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
- Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
- Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D.
- Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
- Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
- Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
- Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
- DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
- Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
- Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. (2008).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
- Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
- Hippler, M., Klein, J., Fink, a, Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
- Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
- Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
- Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
- Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
- Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
- Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
- Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
- de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
- Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
- Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
- Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
- Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).
